Name: Misure di forza diretta della meccanica subcellulare nel confinamento mediante pinzette ottiche (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 56 s
Description: Scopri la misura diretta della forza meccanica nucleare in cellule embrionali di Danio rerio mediante pinzette ottiche. Questo metodo consente di studiare le proprietà meccaniche subcellulari senza perturbare la membrana cellulare.

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MK riconosce il sostegno finanziario del Ministero spagnolo dell'Economia e della Competitività attraverso il Programma Nacional (PGC2018-097882-A-I00), FEDER (EQC2018-005048-P), Severo Ochoa programma per i centri di eccellenza in R & S (CEX2019-000910-S; RYC-2016-21062), dalla Fundació Privada Cellex, Fundació Mir-Puig e dalla Generalitat de Catalunya attraverso il programma CERCA e ricerca (2017 SGR 1012), oltre ai finanziamenti attraverso ERC (MechanoSystems) e HFSP (CDA00023/2018). V.R. riconosce il sostegno del Ministero spagnolo della Scienza e dell'Innovazione alla partnership EMBL, al Centro de Excelencia Severo Ochoa, al Plan Nacional di MINECO (BFU2017-86296-P, PID2020-117011GB-I00) e alla Generalitat de Catalunya (CERCA). V.V. riconosce il sostegno del programma di dottorato ICFOstepstone finanziato dal programma di ricerca e innovazione Horizon 2020 dell'Unione europea nell'ambito dell'accordo di sovvenzione Marie Skłodowska-Curie 665884. Ringraziamo Arnau Farré per la lettura critica del manoscritto; Maria Marsal per l'aiuto con l'imaging e il montaggio dell'embrione da 24 hpf e; Senda Jiménez-Delgado per il supporto con microiniezioni di zebrafish.

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

In questo protocollo, descriviamo un metodo unico per interrogare le proprietà meccaniche del nucleo cellulare all'interno delle cellule viventi. A differenza di altre tecniche di spettroscopia di forza, l'intrappolamento ottico non invasivo ci ha permesso di disaccoppiare il contributo della membrana cellulare e del citoscheletro dalla rigidità nucleare cellulare. È importante sottolineare che la micromanipolazione ottica è compatibile con la microscopia multimodale, che consentirà allo sperimentatore di studiare diversi processi coinvolti nella meccanobiologia nucleare cellulare. Come risultato rappresentativo, abbiamo usato la colorazione DNA-Hoechst per misurare la deformazione del nucleo dopo l'indentazione eseguita da forze dell'ordine di diverse centinaia di picoNewton.
Potenziali applicazioni del nostro metodo al di là degli esempi delineati in questo protocollo La possibilità di estrarre informazioni meccaniche quantitative da misurazioni all'interno di cellule viventi senza perturbazioni esterne consente una pletora di opportunità senza precedenti che stanno appena iniziando ad essere esplorate. Pertanto, il protocollo presentato della nostra piattaforma di micromanipolazione ottica può essere esteso a esperimenti più complessi con grande versatilità. I deflettori acusto-ottici (AOD) possono generare più trappole ottiche per misurazioni sincrone della forza in diverse posizioni cellulari, nonché possono essere utilizzati per la microreologia attiva in un'ampia gamma di frequenze51,61. Come è stato accennato, la risposta di forza al momento dell'indentazione può superare la massima forza di intrappolamento, portando a una fuga del tallone dalla trappola ottica. In questo caso, è possibile configurare un force feedback con l'AOD per bloccare la forza ottica. Tutto sommato, molteplici approcci microreologici, come il rilassamento dello stress descritto in questo protocollo, ma anche la microreologia attiva o la conformità allo scorrimento, possono essere ottenuti sperimentalmente con questa piattaforma e analizzati a fondo da nuovi pacchetti software61,62,63,64,65 . Inoltre, l'applicazione delle forze non è limitata al nucleo, ma potrebbe in linea di principio essere effettuata per misurare diverse strutture intracellulari e in tessuti complessi, come dimostrato per intrappolare i globuli rossi che fluiscono all'interno di vasi sanguigni intatti66,67 o intrappolare e deformare cloroplasti e mitocondri68 . La calibrazione del momento luminoso è indipendente dalla forma e dalle dimensioni dell'oggetto intrappolato, consentendo quindi misurazioni di forza diretta su qualsiasi sonda di forza con forma arbitraria38,39. L'uso di microsfere iniettate ci ha permesso di applicare forze elevate sul nucleo con una potenza laser relativamente bassa rispetto alla manipolazione diretta delle strutture cellulari69,70,71. Tuttavia, data una differenza di indice di rifrazione sufficientemente elevata, non è necessaria alcuna sonda di forza applicata esternamente e gli organelli intracellulari possono essere manipolati direttamente senza perline iniettate (osservazioni e riferimenti non pubblicati70).
Potenziali modifiche del nostro metodo per estendere le applicazioni Diverse dimensioni di microsfere possono essere iniettate a seconda dell'esperimento, ma i relativi controlli devono essere fatti. Ad esempio, per studiare le cellule nelle fasi successive possono essere iniettate perline più piccole. Ciò ridurrà la forza massima che può essere esercitata dalla trappola ottica (come mostrato nel riferimento55). Perle più grandi possono essere iniettate per esercitare forze più elevate, ma queste potrebbero influenzare lo sviluppo dell'embrione a seconda delle loro dimensioni o dello stadio di interesse. Negli esperimenti in cui l'iniezione di microsfere non è un'opzione, vari organelli che mostrano differenze negli indici di rifrazione rispetto a quelli del citoplasma possono ancora essere manipolati otticamente, dando origine a forze ottiche misurabili dai cambiamenti del momento luminoso42. Come accennato in precedenza, questi metodi sono stati impiegati da Bambardekar et al. per deformare le giunzioni cellula-cellula nell'embrione di Drosophila70. Allo stesso modo, il nucleo della cellula ha un indice di rifrazione inferiore rispetto al mezzo circostante44, che consente una rientranza senza perline (osservazioni non pubblicate e riferimento72) anche se con una forza di intrappolamento inferiore. Pertanto, il nucleo non può essere intrappolato facilmente e sfugge alla trappola.
Il distanziatore PDMS rivestito di spin è fabbricato tramite un metodo comodo e veloce, ma potrebbe essere fuori dalla portata dei laboratori senza accesso a una struttura di micro / nanofabbricazione o laboratori di ingegneria. Pertanto, il distanziatore può essere facilmente assemblato da nastro da laboratorio o parafilm (passaggio 4). Il protocollo può anche essere adattato producendo canali microfluidici che automatizzano la consegna di singole celle in pozzi di misura predefiniti o in una camera con un'altezza definita per stimare l'effetto di confinamento all'interno dello stesso campione. Tuttavia, tali dispositivi microfluidici devono essere progettati in modo da adattarsi allo spazio tra l'obiettivo del microscopio e la lente di raccolta del sensore di forza ottica, di circa 2 mm (vedere punto 3). Si noti che il sensore di forza ottica deve essere posizionato all'altezza appropriata in modo che nessuna aberrazione ottica da sfocatura influisca sulla misurazione del momento del fotone.
Altre modifiche potrebbero includere il cambiamento dei reporter biologici. Abbiamo scoperto che la fluorescenza di Hoechst sanguina spettralmente nel canale GFP e quindi favoriamo la combinazione con l'istone marcato con mCherry come marcatore nucleare per la misurazione simultanea in due canali fluorescenti. In alternativa, la deformazione nucleare può essere facilmente tracciata con un'etichetta mirata alla membrana nucleare interna come Lap2b-GFP (Figura 2).
L'indentazione sul nucleo cellulare era dell'ordine di 2-3 micron, che potevamo misurare con precisione mediante l'analisi dell'immagine della microscopia confocale a disco rotante limitata alla diffrazione. Nel caso di nuclei più rigidi o forze più piccole, l'indentazione sarà a malapena misurabile usando questo approccio. Tuttavia, le pinzette ottiche calibrate con forza assoluta possono anche essere calibrate per le misurazioni di posizione del tallone intrappolato in situ utilizzando l'interferometria BFP con precisione nanometrica51. Utilizzando questo approccio, il segnale di tensione e il sensore di forza ottica possono essere tradotti nella posizione della sonda intrappolata attraverso il parametro β [nm/V], mentre il parametro invariante α [pN/V] produce valori di forza attraverso la suddetta calibrazione del momento luminoso41 (vedi sotto per i dettagli).
Risoluzione dei problemi Abbiamo scoperto che durante l'esperimento potrebbero verificarsi le seguenti sfide:
Non si forma alcuna trappola stabile e la microsfera sfugge facilmente Qualsiasi sporcizia sull'obiettivo del microscopio o su un collare di correzione disallineato potrebbe portare al fallimento di una trappola stabile. Se non si trova una soluzione immediata, misurare la funzione point-spread della lente dell'obiettivo. Se il campione di interesse è in profondità all'interno di un tessuto otticamente denso, la messa a fuoco laser potrebbe subire gravi aberrazioni ottiche che portano a un intrappolamento instabile (questo effetto è solitamente trascurabile nelle cellule isolate, ma diventa più evidente nei tessuti più spessi). Per un'elevata rigidità, la forza di ripristino del nucleo potrebbe superare la forza di fuga della trappola, in modo tale che la microsfera venga persa e la routine di indentazione fallisca. Inizialmente, il bordo della membrana nucleare prossimale alla trappola ottica diventa difficilmente rientrato (Figura S2A). Quando ciò si verifica, il laser di intrappolamento non è più influenzato dalla forza e dal movimento browniano, che porta a una caduta di forza a zero e una diminuzione del rumore del segnale (Figura S2B). Nel caso in cui ciò accada, la potenza del laser può essere aumentata per avere una trappola più forte, l'ampiezza della traiettoria trapezoidale che spinge il tallone nel nucleo può essere ridotta o la posizione iniziale della microsfere intrappolata può essere spostata più lontano dal nucleo.
La cellula si muove durante la stimolazione Se le cellule non sono sufficientemente attaccate, la trappola del gradiente ottico muoverà le cellule durante l'esecuzione della routine di indentazione intracellulare, in modo tale che le forze e la meccanica sottostante del nucleo siano artefatte. Per evitare lo spostamento dell'intera cellula, si consiglia di aumentare la concentrazione di molecole di adesione cellulare sulla superficie, ad esempio ConA.
Compensazione iniziale del momentum Se nella piattaforma OT non è disponibile una routine iniziale di compensazione del momento (fase 6.5), è necessario correggere un segnale di base artificiale indipendente dalla forza. Questo è visibile come una pendenza sulla curva di forza anche senza perline intrappolate (Figura S1E). Per eseguire la correzione, la stessa traiettoria deve essere eseguita senza una perlina, al di fuori della cella esattamente nella stessa posizione. Per questo, spostare la cella lontano dalla trappola usando il controllo del palcoscenico. Come riferimento, l'offset di forza cambia 5 pN attraverso il FOV a 200 mW nel nostro sistema; quindi, diventa trascurabile per traiettorie brevi. In alternativa, è possibile utilizzare una fase di scansione piezoelettrica per spostare le cellule sul campione, lasciando costante la posizione del laser.
Passaggi critici del protocollo presentato Le microsfere devono essere iniettate allo stadio destro di 1 cellula per garantire la massima distribuzione sull'embrione. Le perline non devono essere fluorescenti in modo che la luce non perda nei canali fluorescenti utilizzati per l'imaging. Ad esempio, anche le tipiche perle rosso-fluorescenti sono chiaramente visibili nel canale blu utilizzato per l'imaging del nucleo cellulare dopo la colorazione di Hoechst a causa della loro luminosità (eccitazione: 405 nm; emissione: 445 nm). L'attacco stabile della cellula al substrato è fondamentale per prevenire lo spostamento laterale durante la routine di rientranza. Se la cellula si muove durante la routine, le forze sono sottovalutate. Se ciò dovesse accadere frequentemente, ottimizzare il protocollo di allegato. Per le cellule di coltura tissutale, altre proteine di adesione cellulare, come la fibronectina, il collagene o la poli-L-lisina portano ad un attaccamento soddisfacente (osservazioni non pubblicate). Durante il confinamento, le cellule sono sottoposte a un improvviso e grave stress meccanico. Ciò può causare danni alle cellule e spesso lo sperimentatore incontrerà cellule scoppiate se la procedura non viene eseguita con attenzione. Inoltre, se l'altezza di confinamento è troppo piccola, tutte le cellule soffriranno di rottura dell'involucro nucleare o danni irreversibili. Per mitigarli, abbassare più lentamente il coverslip superiore e/o aumentare la spaziatura tra il coverslip.
Limiti della tecnica e suggerimenti per superarli Una chiara limitazione della tecnica è la penetrazione della luce laser in sezioni profonde del tessuto, che porta ad aberrazioni e intrappolamento instabile. Pertanto, un limite inferiore di profondità di penetrazione dipende dalla chiarezza del campione, dalla correzione dell'aberrazione che può essere impiegata73 e dalla potenza laser applicata. Va tenuto conto del fatto che una maggiore potenza laser porta all'eccitazione termica del campione in prossimità della microsfera. Tuttavia, il riscaldamento del campione originato dallo spot laser a lunghezza d'onda di 1064 nm è ridotto al minimo per evitare uno stress plausibile legato al calore sui nostri campioni biologici74.
Un'altra limitazione è la forza massima che può essere misurata. Anche se il rilevamento diretto del momento della luce consente misurazioni della forza ben oltre il regime di risposta lineare della trappola ottica40,41, la forza massima applicata è nell'ordine di poche centinaia di picoNewton. Ciò è limitato dalla potenza del laser e dalla conseguente soglia di danno del materiale biologico morbido e dalle differenze dell'indice di rifrazione, che normalmente non sono superiori a 0,1 o 0,344. Sono stati proposti diversi metodi per aumentare il limite di rilevamento della forza, ad esempio utilizzando luce strutturata75, microsfere rivestite antiriflesso76, particelle ad alto indice di rifrazione77 o punti quantici altamente drogati78.
Gli OT possono essere utilizzati per misurazioni di posizione su scala nanometrica attraverso l'interferometria BFP, in modo tale che la posizione del tallone all'interno della trappola sia Δx = β Sx, dove Sx è il segnale di tensione del sensore e β [μm/V] può essere calibrato al volo seguendo diversi protocolli35,54. Per un sensore di forza ottica, si può dimostrare che il fattore di conversione invariante tensione-forza α [pN/V] si riferisce direttamente a β e alla rigidità della trappola, k [pN/μm], attraverso α = kβ 37) Negli esperimenti con spostamenti di perline troppo piccoli per essere rilevati dall'imaging ottico, questa strategia può essere utilizzata per integrare le misurazioni della forza con il rilevamento di una posizione ridotta. Un esempio è l'applicazione delle routine sperimentali qui presentate su nuclei molto rigidi, per i quali forze a potenze laser ragionevoli (200-500 mW) non sono sufficienti per indurre valori di indentazione abbastanza grandi. In tal caso, il tallone deve essere portato a contatto con il nucleo e la rigidità di intrappolamento deve essere calibrata prima della misurazione (fase 8.6). La rientranza d del nucleo in funzione della forza può essere determinata indirettamente come:
d = xtrap - F/k
dove xtrap è la posizione della trappola. Diverso dal fattore di quantità di luce invariante α [pN / V], il fattore β [μm / V] deve essere calibrato prima di ogni esperimento poiché dipende da molte variabili locali che determinano la dinamica di intrappolamento, come la dimensione delle particelle, la dimensione dello spot della trappola ottica e gli indici di rifrazione relativi.

La morfogenesi tissutale è un processo complesso in cui i segnali biochimici e le forze fisiche sono coordinati spaziotemporalmente. Nell'embrione in via di sviluppo, i gradienti dei fattori di segnalazione biochimica dettano le specifiche del destino e assicurano un corretto pattern tissutale1,2. Allo stesso tempo, le forze intrinseche ed estrinseche svolgono un ruolo nella costruzione dell'architettura dell'embrione3,4. L'influenza della meccanica della corteccia cellulare in questo contesto è stata ampiamente studiata5,6. La stretta interconnessione tra i processi meccano-chimici durante la morfogenesi si basa sulle proprietà delle singole cellule per rilevare e rispondere alle forze meccaniche nel loro microambiente tissutale. Le cellule, quindi, decodificano i segnali meccanici attraverso la presenza di elementi subcellulari e molecolari sensibili alla forza che trasducono informazioni meccaniche in specifiche vie di segnalazione che controllano il comportamento cellulare, il destino cellulare e la meccanica cellulare.
Un segno distintivo dei processi di sviluppo è che le cellule si organizzano come gruppi per costruire strutture multicellulari. Come tali, le singole cellule raramente riorganizzano e si muovono da sole, ma sono associate in un sociotopo stretto in cui mostrano un comportamento collettivo come la migrazione sopracellulare7, le transizioni (un)jamming8,9 o la compattazione della blastocisti10. Le forze meccaniche generate all'interno e tra le cellule servono come spunti importanti per istruire la dinamica cellulare collettiva7,11. Ma anche quando le cellule si muovono da sole, come le cellule progenitrici che si fanno strada tra fogli di tessuto o strette nicchie di tessuto, sperimentano estese forze meccaniche anisotropiche quando navigano in un ambiente tridimensionale. Queste sollecitazioni meccaniche sulle cellule hanno profonde conseguenze sul comportamento cellulare12,13. Sono stati studiati diversi meccanismi che convergono sul nucleo come un importante elemento di meccanotrasduzione14,15, come elemento meccanico passivo o attivo durante la migrazione all'interno di un ambiente di tessuto 3D denso15,16.
Recentemente abbiamo proposto un meccanismo che equipaggia le cellule per misurare le deformazioni della forma utilizzando il nucleo come meccanometro intracellulare elastico12. Il nucleo, essendo il più grande organello in una cellula, subisce grandi deformazioni quando le cellule si polarizzano, migrano o cambiano forma sotto allungamento meccanico, confinamento o stress osmotico16,17,18,19. Abbiamo scoperto che l'allungamento dell'involucro nucleare insieme al posizionamento intracellulare del nucleo fornisce alle cellule informazioni sulla grandezza e il tipo di deformazione cellulare (come la compressione cellulare rispetto al gonfiore cellulare). Lo stiramento del nucleo è associato a uno sviluppo della membrana nucleare interna (INM), che promuove l'attività della lipasi cPLA2 calcio-dipendente (fosfolipasi citosolica A2) all'INM seguita dal rilascio di acido arachidonico (AA) e dalla rapida attivazione della miosina II nella corteccia cellulare. Ciò porta ad un aumento della contrattilità cellulare e alla migrazione delle cellule ameboidi al di sopra di una soglia di contrattilità corticale6. La risposta meccanosensibile alla deformazione cellulare si verifica in meno di un minuto ed è reversibile al momento del rilascio del confinamento, suggerendo che il nucleo agisce come un estensimetro per la propriocezione cellulare che regola il comportamento cellulare adattativo in condizioni di stress meccanico. Questa via meccanosensibile ha dimostrato di essere attiva nelle cellule staminali progenitrici derivate da embrioni di zebrafish, sia in cellule pluripotenti che impegnate nel lignaggio12 ed è conservata in diverse specie e linee cellulari20.
Oltre alle proprietà nucleari come cellula-meccanosensore, l'architettura e la meccanica nucleare sono intrinsecamente regolate durante lo sviluppo e in risposta alla specifica del destino cellulare21, quindi sintonizzando la meccano-sensibilità cellulare22,23. La conseguenza potrebbe essere un cambiamento nella conformità nucleare che consenta cambiamenti morfologici e transizioni da uno stato premigratorio a uno migratorio e viceversa8.
Sono state applicate diverse tecniche per misurare la meccanica del nucleo cellulare, come la microscopia a forza atomica24,25, l'aspirazione a micropipetta26,27, la tecnologia microfluidica28 e i microaghi29. Tuttavia, molte di queste tecniche sono invasive nel senso che l'intera cellula deve essere deformata, limitando la misurazione delle caratteristiche meccaniche e delle risposte forza-dipendenti del nucleo stesso. Per aggirare la deformazione simultanea della superficie cellulare e della sua corteccia cellulare meccanosensibile30, sono stati studiati nuclei isolati in vari contesti31,32. Tuttavia, non si può escludere che l'isolamento nucleare sia associato a un cambiamento delle proprietà dei nuclei meccanici e della loro regolazione (riferimento24 e proprie osservazioni non pubblicate).
Le pinzette ottiche (OT) sono una tecnologia versatile che ha permesso una pletora di esperimenti in meccanobiologia cellulare e sono stati determinanti nella nostra comprensione di come le macchine molecolari convertono la chimica in energia meccanica33,34. Le pinzette ottiche utilizzano un raggio laser strettamente focalizzato per esercitare forze ottiche sulle particelle dielettriche che hanno un indice di rifrazione superiore al mezzo circostante33. Tali forze possono essere dell'ordine di centinaia di pico-Newton e risultare in un efficace confinamento della particella all'interno della messa a fuoco della trappola laser, consentendo la manipolazione della particella intrappolata in tre dimensioni. L'uso della luce ha un vantaggio importante in quanto la misurazione può essere eseguita in modo non invasivo all'interno di cellule viventi. Le manipolazioni ottiche sono ulteriormente limitate alla messa a fuoco della trappola del raggio laser. Quindi, la manipolazione può essere eseguita senza stimolare le membrane cellulari circostanti e non perturba la corteccia di actina o i processi meccanosensibili sulla membrana plasmatica, come l'attivazione forza-dipendente dei canali ionici.
La difficoltà dell'approccio della pinzetta ottica è quella di determinare con precisione le forze applicate alla microsfera utilizzando approcci classici che si basano sulla calibrazione della forza indiretta basata sul teorema di equipartizione o sull'uso di forze di Resistenza di Stokes definite per misurare una forza di fuga dipendente dalla potenza laser35. Mentre questi metodi sono semplici da implementare in un esperimento in vitro, di solito non possono essere tradotti in un ambiente cellulare. Sono state introdotte sul campo diverse strategie che si basano su una calibrazione diretta della forza, derivata dai primi principi di conservazione della quantità di moto36,37. A differenza di altri approcci di spettroscopia di forza, le misurazioni della forza sono dedotte da uno scambio locale di momento luminoso con la particella intrappolata di forma arbitraria38,39. Nel nostro set-up sperimentale, i cambiamenti nel momento della luce derivanti dalle forze ottiche vengono misurati direttamente senza la necessità di calibrazione della trappola in situ40,41,42,43. Pertanto, le misurazioni diventano possibili in un ambiente viscoso come l'interno della cellula o anche all'interno di un tessuto, e le forze possono essere facilmente quantificate fino al livello pN.
In questo protocollo, descriviamo un test per manipolare meccanicamente organelli o strutture intracellulari e valutare quantitativamente le loro proprietà meccaniche mediante una pinzetta ottica. Questa configurazione è integrata in un microscopio fluorescente a disco rotante che consente l'imaging parallelo del comportamento cellulare o della dinamica intracellulare. Il saggio consente la caratterizzazione delle proprietà meccaniche di specifici compartimenti cellulari, come il nucleo, studiando contemporaneamente la possibile meccanoresponsazione e attivazione delle vie di segnalazione molecolare a seguito della deformazione stessa. Inoltre, l'intrappolamento ottico delle microsfere iniettate all'interno delle cellule consente un aumento della forza di indentazione grazie ad un indice di rifrazione notevolmente più elevato del tallone di polistirene (n = 1,59) rispetto al contrasto rifrattivo intrinseco44 del nucleo (n ~ 1,35) rispetto al citoplasma (n ~ 1,38). La strategia presentata può essere facilmente adattata allo studio di altre strutture intracellulari e organelli, nonché ad altri approcci che coinvolgono la microreologia attiva, l'uso di più trappole ottiche per sondare contemporaneamente le stesse / diverse strutture subcellulari e misurazioni mirate alla meccanobiologia cellulare nell'embrione vivo.

<table><tbody><tr><td>#1.5 Occhiali da 22 mm</td><td>Ted Pella</td><td>260148</td><td></td></tr><tr><td>#1.5 22x60 mm Bicchieri</td><td>da incasso Ted Pella</td><td>260152</td><td></td></tr><tr><td>#1.5H Piatti con fondo in vetro</td><td>Willco</td><td>GWST-5040</td><td></td></tr><tr><td>Perline da 10 um</td><td>Supelco</td><td>72986</td><td></td></tr><tr><td>Capillari in vetro da 1 mm</td><td>Harvard Apparatus</td><td>30-0020 GC100F-15</td><td></td></tr><tr><td>Polistirene da 1 um microsfere</td><td>Sigma</td><td>89904</td><td></td></tr><tr><td>1-um perline rosse fluorescenti</td><td>ThermoFisher</td><td>F8816</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>ThermoFisher</td><td>16500500</td><td></td></tr><tr><td>Telecamere di ispezione sCMOS</td><td>Andor</td><td>Sona-4BV11-UNI</td><td></td></tr><tr><td>Telecamera ausiliaria (Figura 3, AUX)</td><td>Blackfly, FLIR</td><td>BFS-U3-200S6M-C</td><td></td></tr><tr><td>Calbryte 520</td><td>AAT Bioquest</td><td>520 AM</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga</td><td>Eppendorf</td><td>5453000011</td><td></td></tr><tr><td>Concanavalin A</td><td>Sigma</td><td>C5275</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma</td><td>D2906</td><td></td></tr><tr><td>DNA-Hoechst</td><td>ThermoFisher</td><td>33342</td><td></td></tr><tr><td>Doppio scotch</td><td>Biesse Adesivi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>E3</td><td>5 mM NaCl. 0.17 mM KCl. 0.33 mM CaCl2. 0.33 mM MgSO4</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eclipse Ti2</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Forcipe</td><td>Strumenti per la scienza</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>GPI-GFP</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>H2A-mCh</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software di acquisizione immagini</td> Olio da immersione <td>Fusion-Andor</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Cargille</td><td>Tipo B: 16484</td><td></td></tr><tr><td>occhiali di</td> <td>protezione IRThorlabs</td><td>LG1</td><td></td></tr><tr><td>Lap2b-eGFP</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipetta con microcaricatore</td><td>Eppendorf</td><td>GELoader</td><td></td></tr><tr><td>Microinjector</td><td>World Precision Instruments</td><td>SYS-PV820</td><td></td></tr><tr><td>MicroManager 2.0</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vetrino per micromita</td><td>ID5243 GXMGRAT-5 5mm/100 divisioni</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Olio minerale</td><td>Sigma</td><td>M3616</td><td></td></tr><tr><td>Stadio motorizzato</td><td>ASI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Estrattore ad aghi</td><td>Sutter instrument Co.</td><td>Modello P-97</td><td></td></tr><tr><td>Pinzette ottiche piattaforma</td><td>Impetux Optics</td><td>Sensocell</td><td></td></tr><tr><td>OTs software (LightAce)</td><td>Impetux Optics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PDMS</td><td>Sigma</td><td>Sylgard 184</td><td></td></tr><tr><td>PDMS Agente indurente</td><td>Sigma</td><td>Sylgard 184</td><td></td></tr><tr><td>Software di post-elaborazione (Matlab)</td><td>Mathworks</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNAse free water</td><td>Thermofisher</td><td>AM9937</td><td></td></tr><tr><td>Specchio dicroico a passaggio corto (Figura 3, IR-F)</td><td>Semrock</td><td>FF01-950/SP-25</td><td></td></tr><tr><td>Spin-coater</td><td>Sistemi di rivestimento speciali</td><td>Spincoat G3P-8</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio confocale a disco rotante</td><td>Andor</td><td>DragonFly 502</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscopio</td><td>Leica M80</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stampo triangolare a microiniezione</td><td>Adaptive Science Tools</td><td>TU1</td><td></td></tr><tr><td>Forno universale</td><td>Memmert</td><td>UNB 200</td><td></td></tr><tr><td>Obiettivo ad immersione in acqua</td><td>Nikon</td><td>MRD07602</td><td></td></tr></tbody></table>

misure di forza diretta della meccanica subcellulare nel confinamento mediante pinzette ottiche

Direct Force Measurements of Subcellular Mechanics in Confinement using Optical Tweezers

Durante lo sviluppo di un organismo multicellulare, una singola cellula fecondata si divide e dà origine a più tessuti con funzioni diverse. La morfogenesi tissutale va di pari passo con i cambiamenti molecolari e strutturali a livello di singola cellula che si traducono in variazioni delle proprietà meccaniche subcellulari. Di conseguenza, anche all'interno della stessa cellula, organelli e compartimenti diversi resistono in modo diverso alle sollecitazioni meccaniche; e le vie di meccanotrasduzione possono regolare attivamente le loro proprietà meccaniche. La capacità di una cellula di adattarsi al microambiente della nicchia tissutale è quindi in parte dovuta alla capacità di percepire e rispondere alle sollecitazioni meccaniche. Recentemente abbiamo proposto un nuovo paradigma di meccanosensazione in cui la deformazione e il posizionamento nucleare consentono a una cellula di misurare l'ambiente fisico 3D e dotano la cellula di un senso di propriocezione per decodificare i cambiamenti nella forma della cellula. In questo articolo, descriviamo un nuovo metodo per misurare le forze e le proprietà del materiale che modellano il nucleo cellulare all'interno delle cellule viventi, esemplificato su cellule aderenti e cellule confinate meccanicamente. Le misurazioni possono essere eseguite in modo non invasivo con trappole ottiche all'interno delle cellule e le forze sono direttamente accessibili attraverso il rilevamento senza calibrazione del momento luminoso. Ciò consente di misurare la meccanica del nucleo indipendentemente dalle deformazioni della superficie cellulare e di consentire la dissezione delle vie di meccanotrasduzione esterocettiva e interocettiva. È importante sottolineare che l'esperimento di trapping può essere combinato con la microscopia ottica per studiare la risposta cellulare e le dinamiche subcellulari utilizzando l'imaging a fluorescenza del citoscheletro, degli ioni calcio o della morfologia nucleare. Il metodo presentato è semplice da applicare, compatibile con soluzioni commerciali per le misurazioni della forza e può essere facilmente esteso per studiare la meccanica di altri compartimenti subcellulari, ad esempio mitocondri, fibre di stress ed endosomi.

Qui, presentiamo un protocollo per studiare le proprietà meccaniche intracellulari di cellule embrionali isolate di zebrafish in confinamento tridimensionale con misurazione della forza diretta mediante una trappola ottica.

Misure di forza diretta della meccanica subcellulare nel confinamento mediante pinzette ottiche

During the development of a multicellular organism, a single fertilized cell divides and gives rise to multiple tissues with diverse functions. Tissue ...

Questo protocollo analizza le singole proprietà meccaniche del nucleo cellulare che lo rendono un misuratore meccanico per la polarizzazione, la differenziazione e la migrazione cellulare. Il vantaggio principale di questa tecnica è che può misurare le proprietà meccaniche e applicare forze ai compartimenti subcellulari senza perturbazione esterna della membrana o del citoscheletro corticale. Il protocollo può essere facilmente adattato per manipolare perline all'interno di altre cellule di altri organismi al fine di studiare la meccanica nucleare in diverse linee cellulari o modelli animali.L'allineamento del sensore di forza diretta è fondamentale per catturare tutta la luce che crea e lascia le trappole ottiche. Ciò garantirà misurazioni accurate del momento luminoso nel mezzo viscoelastico di una cellula. Inizia la preparazione unicellulare posizionando gli embrioni allo stadio della sfera quattro ore dopo la fecondazione in un piatto di vetro contenente supporti E3 usando una pipetta di plastica Pasteur.Quindi selezionare gli embrioni che sono positivi alle perle ed esprimere la proteina fluorescente in caso di iniezione di mRNA. Utilizzare una pinza per decurionare manualmente gli embrioni e trasferire circa 10-15 embrioni decurionati in un contenitore di reazione da 1,5 millilitri con l'aiuto di una pipetta di vetro Pasteur. Rimuovere il fluido E3 dal tubo e aggiungere 500 microlitri di terreno di coltura tissutale preriscaldato indipendente dall'anidride carbonica.Agitare delicatamente il tubo evitando la formazione di bolle e assicurarsi che il contenuto del tubo diventi torbido mentre le cellule si dissociano senza grossi pezzi visibili dall'occhio. Quindi centrifugare il tubo a 200 volte G per tre minuti. Dopo la centrifugazione, rimuovere il surnatante e raccogliere il pellet per procedere con la colorazione cellulare.Per etichettare il nucleo, risospese le cellule aggiungendo 500 microlitri della soluzione colorante DNA Hoechst appena preparata al tubo. Incubare le cellule colorate per sette minuti al buio. Successivamente, centrifugare le cellule come descritto in precedenza e risospescere il pellet in 50 microlitri di DMEM per i campioni in sospensione o 20 microlitri di DMEM per le cellule in confinamento.Per la preparazione degli orpelli ottici o della camera OT per gli esperimenti con le celle in sospensione, tagliare un pezzo di scotch biadesivo con un foro quadrato di circa 10 millimetri per 10 millimetri al centro. Staccare uno degli strati protettivi del nastro e posizionare il lato scoperto del nastro al centro di un piatto con fondo di vetro numero 1,5 H. Premere delicatamente il nastro per far aderire tutta la superficie del nastro al vetro evitando bolle d'aria e staccare lo strato protettivo rimanente del nastro.Incubare la superficie con 100 microlitri di Concanavalin A a 0,5 milligrammi per millilitro per 30 minuti. Quindi rimuovere la goccia di Concanavalin A e risciacquare la superficie con DMEM. Aggiungere 30 microlitri della soluzione contenente le cellule sulla superficie della cavità.Quindi chiudere la camera molto delicatamente con un vetro di copertura da 22 per 22 millimetri. Utilizzare un bisturi o una pinza, se necessario. Successivamente, procedere all'avvio delle pinzette ottiche accendendo il laser ad altissima potenza per almeno 30 minuti prima dell'esperimento per ottimizzare la stabilità della potenza di uscita.Al termine, accendere il modulo elettronico delle micro manipolazioni ottiche e delle unità di misurazione della forza. Prima di allineare il sensore di forza ottica, posizionare una goccia d'acqua sull'obiettivo di immersione in acqua 60X 1.2 e posizionare la camera contenente le celle sul palco. Concentrati sulla superficie inferiore della camera in cui verranno posizionati i campioni cellulari.Dopo aver aggiunto una goccia di olio per immersione sulla parte superiore del vetrino di copertura che copre il campione, abbassare la lente di raccolta dell'unità sensore di forza fino a quando non contatta la goccia d'olio. Seguendo la procedura standard per l'allineamento del sensore di forza ottica, guardare l'immagine del piano campione sulla telecamera ausiliaria da utilizzare per posizionare gli OT, quindi abbassare il sensore di forza ottica fino a quando il suo arresto del campo appare coniugato sul piano del campione. Per verificare la presenza di bolle d'aria con l'obiettivo Bertrand, osservare il percorso di imaging attraverso la fotocamera ausiliaria.Se sono visibili sporcizia o bolle d'aria, pulire la lente e la camera con tessuto privo di polvere prima di ripetere la procedura come descritto, aggiungendo altro olio per immersione. Utilizzando le viti laterali posizionate sul supporto del sensore di forza ottica, centrare l'arresto del campo nel campo visivo. Per precisione, aprire l'arresto del campo quasi per occupare il campo visivo visibile sulla telecamera ausiliaria.Dopo aver posizionato il campione al microscopio e allineato il sensore di forza ottica, utilizzare la piastra rotante a mezza onda per impostare la potenza di trappola iniziale a 200 milliwatt se la rigidità del nucleo o della struttura intercellulare studiata non è nota. Una volta fatto, utilizzare il controller software dello stadio del microscopio per cercare una cellula con una o due perline attraverso la microscopia Brightfield trasmessa. Nel foglio numerico, scrivi lo spostamento e il tempo di ogni passo successivo della traiettoria.In alternativa, caricare la tabella S1 dal materiale supplementare. Per un esperimento di stress/rilassamento, programmare i carichi trapezoidali da applicare. Nel software OT, attivare le trappole ottiche.Per intrappolare una microsfera, impostare i piani dell'immagine leggermente sopra il tallone con un controller software per lo stadio del microscopio. Fare clic sulla microperla di polistirene nella finestra di imaging della telecamera ausiliaria calibrata. Il confinamento riuscito del tallone da parte della trappola ottica ridurrà fortemente il movimento del tallone.Fare clic e trascinare il tallone attraverso il citoplasma e posizionarlo a una distanza di circa due micron dall'involucro nucleare. Assicurarsi che la traiettoria sia impostata in modo che la rientranza del tallone sia perpendicolare alla membrana nucleare. Quando la configurazione è pronta, vai al software di imaging e fai clic sul pulsante di acquisizione per avviare l'acquisizione delle immagini.Apri la finestra di lettura forzata in tempo reale, fai clic sui dati e salva nella finestra di lettura della forza in tempo reale per salvare. Avviare i dati di misurazione della posizione di trappola e della forza. Avviate la traiettoria caricata in precedenza facendo clic con il pulsante destro del mouse sul tallone e selezionando la traiettoria iniziale.Attendere che la traiettoria sia terminata e che il sistema si stabilizzi prima di terminare la registrazione dei dati di misurazione della forza della trappola. Interrompere l'acquisizione delle immagini e tracciare i risultati nel software di post-elaborazione. Nell'analisi rappresentativa, viene visualizzata una cellula staminale progenitrice di zebrafish isolata con una singola microsfera vicino al nucleo.È stata monitorata la distribuzione della microsfera di polistirene cinque ore dopo l'iniezione all'interno di un embrione. L'immagine del campo luminoso e della fluorescenza mostra che le perline sono disperse nel tessuto embrionale. La massima proiezione dello Z-stack fluorescente confocale e una proiezione massima di un sotto-stack nella stessa regione confermano che una grande frazione di celle profonde conteneva da una a due perline.A 24 ore dalla fecondazione, le perle sono state distribuite su tutto il corpo dell'embrione. Sono state ottenute le micrografie Brightfield delle cellule in sospensione sulle cellule confinate con una o due perle iniettate. Inoltre, più etichette fluorescenti hanno facilitato lo studio di diversi aspetti delle cellule, come la membrana internucleare, la membrana plasmatica, il DNA e la linea transgenica.Le istantanee rappresentative hanno descritto nuclei marcati con Hoechst cinque secondi prima /durante e cinque secondi dopo l'indentazione con una microsfera intrappolata otticamente. Sono stati studiati profili di intensità lungo il segmento di rientranza per tre diversi fotogrammi e traiettorie dei confini distali e prossimali del nucleo durante un esperimento di rientranza di cellule sospese e confinate. Sono state misurate la traiettoria intrappolata e la forza sperimentata dalla microsfera intrappolata otticamente durante un ripetuto esperimento di rientranza nucleare.La meccanica del nucleo nelle cellule in sospensione e sotto confinamento ha confermato che il confinamento ha comportato un'espansione dell'area proiettata e un cambiamento insignificante nella rigidità nucleare. Se le perline vengono iniettate nell'embrione di una cellula, molto probabilmente si distribuiranno uniformemente nelle fasi successive. Ricorda che il tallone deve essere stabilmente intrappolato.Se il tallone sfugge alla trappola ottica, ridefinire la traiettoria o aumentare la potenza del laser. Questi esperimenti possono essere facilmente eseguiti su più microsfere all'interno di una cellula ed estesi a misurazioni microreologiche attive.

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