Immunocolorazione fluttuante del cervello di topo

La colorazione immuno-istochimica del cervello dei topi è una tecnica comunemente usata nella ricerca neuroscientifica. Tuttavia, la qualità, l'affidabilità e la riproducibilità dei risultati dell'istologia cerebrale possono variare tra diversi ricercatori e laboratori. Presentiamo una metodologia consolidata per gli studi istologici del cervello dei topi che ha dimostrato di essere riproducibile, affidabile ed efficiente.

Ad aiutare a dimostrare la procedura sarà il Dr.Chunmei Wang, un assistente professore del mio laboratorio Dopo aver confermato l'anestesia di successo in un topo C57 nero / 6J di otto-16 settimane, fissare il mouse su una tavola di schiuma e fare un'incisione superficiale longitudinale lungo la linea mediana sopra il torace e l'addome, quindi spostare la pelle da parte per esporre la parete muscolare del torace e dell'addome. Quindi, fare un'incisione nello strato muscolare per esporre il fegato e l'intestino. Quindi, usando le forbici, tagliare la cassa toracica per aprire il torace ed esporre il cuore e i polmoni.

Usando una pinza emostatica, tirare la cassa toracica da parte per allargare l'area di lavoro. Prossimo. per posizionare una cannula di perfusione, penetrare direttamente nel ventricolo cardiaco sinistro con una cannula smussata e inserirla con cura nell'aorta ascendente. Posizionare i perni attorno alla congiunzione della cannula e del tubo accoppiato sul pannello di schiuma per fissare la cannula in posizione durante la perfusione e procedere a tagliare l'atrio destro per consentire il deflusso del sangue dalla circolazione.

Per la perfusione con soluzione salina, accendere il pressostato salino e perfondere il mouse transcardialmente con 40-60 millilitri di soluzione salina. Osservare da vicino il deflusso dall'atrio destro e il colore del fegato. Successivamente, per perfondere con formalina, spegnere il pressostato salino e accendere il pressostato della formalina per perfondere il mouse con 40 millilitri di formalina tamponata in neutro al 10%.

Osserva gli arti dell'animale per prove di tremori. Per l'isolamento cerebrale, utilizzare le forbici per rimuovere la testa e fare un'incisione della linea mediana lungo il tegumento per esporre il cranio, quindi tagliare la pelle e l'attaccamento muscolare. Quindi, fai un taglio sulla cresta orbitale e posiziona l'estremità affilata delle forbici dell'iride nel forame magnum.

Far avanzare le forbici lungo la superficie interna del cranio, mantenendo la pressione verso l'alto per evitare danni al cervello. Quindi, rimuovere con attenzione le ossa parietali e frontali e le meningi prima di rimuovere il cervello dal cranio aperto. Posizionare il ghiaccio secco sopra la piastra di regolazione dell'altezza di un microtomo scorrevole e attendere che il gelo bianco sia visibile, quindi distribuire con cura cinque millilitri di saccarosio al 30% sopra la piastra per formare uno strato di base solido dopo che il saccarosio si è congelato.

Quindi, posizionare tutti i campioni di cervello orizzontalmente in una linea sopra la base di saccarosio con 500 microlitri del 30% di saccarosio. Dopo cinque o 10 minuti di congelamento, quando il cervello è diventato duro e bianco, tagliare il cervello fino a raggiungere lo strato o la regione desiderata, quindi passare dalla modalità di taglio alla modalità di alimentazione e sezione del tessuto cerebrale per generare sezioni spesse 25 micrometri. Quindi, preparare una piastra a 48 pozzetti piena di PBS e contrassegnare cinque pozzetti per un cervello di topo.

Usando un pennello, raccogli una sezione e posizionala in un pozzetto, quindi raccogli la sezione successiva dello stesso mouse e posizionala nel secondo pozzo. Ripetere la procedura fino a raggiungere il quinto pozzo posizionando le sezioni da sei a 10 nel primo al quinto pozzo e così via. Posizionare un colino cellulare in un pozzetto di una piastra di coltura cellulare a sei pozzetti piena di PBS e, usando un pennello, trasferire una serie di sezioni cerebrali nel filtro cellulare.

Risciacquare queste sezioni in PBS trasferendo il filtro cellulare in un altro pozzo pieno di PBS sullo shaker. Quindi, trasferire le sezioni cerebrali dal filtro cellulare in un tubo da 1,5 millilitri contenente un millilitro di WFA marcato con biotina e incubare su una piattaforma a dondolo a 50 RPM durante la notte. Il giorno seguente, sciacquare le sezioni cerebrali con PBS come dimostrato in precedenza, quindi trasferire le sezioni in un tubo contenente un millilitro di soluzione di streptavidina-luce diurna 488 e incubare per due ore su una piattaforma a dondolo.

Dopo aver risciacquato nuovamente le sezioni cerebrali con PBS, incubarle in tampone di blocco per due ore, seguito da incubazione in anticorpi primari durante la notte su una piattaforma a dondolo. Il giorno successivo, dopo i risciacqui PBS, incubare le sezioni in anticorpo secondario per due ore. Riempire due piastre di Petri con 100 millilitri di PBS e trasferire tutte le sezioni cerebrali da un colino al primo piatto.

Allineare le sezioni cerebrali in ordine neuroanatomico da caudale a rostrale. Quindi, immergere una diapositiva nel secondo piatto con un'estremità leggermente inclinata con un supporto e, usando un pennello fine, posizionare delicatamente una sezione cerebrale appena sotto l'interfaccia del buffer dell'aria sulla diapositiva inclinata. Successivamente, utilizzando una pipetta di trasferimento, rimuovere lentamente e delicatamente il buffer per abbassarne il livello fino a quando la sezione cerebrale è completamente sopra l'interfaccia del buffer dell'aria.

Continuare a ripetere questo processo fino a raggiungere la parte inferiore della diapositiva e tutte le sezioni sono montate sulla diapositiva. Per l'imaging, accendere lo scanner e il computer, quindi posizionare le diapositive nel supporto diapositive con il dispositivo di caricamento e inserire il supporto nello scanner. Aprire il software per lo scanner e scegliere la posizione di archiviazione e il profilo di scansione appropriati.

Avviare la scansione di anteprima facendo clic sul pulsante Avvia scansione anteprima. Dopo la scansione, aprire la procedura guidata di rilevamento dei tessuti e cerchiare le regioni di interesse per l'imaging. Dopo aver scelto le regioni per l'imaging, fare clic sul pulsante Avvia scansione e attendere che la macchina termini la scansione.

Controlla il file dei risultati ed esporta le immagini. Qui sono mostrate immagini rappresentative di immuno-istochimica a fluorescenza di sezioni cerebrali di topo coronale a Bregma-negativo di 0,82 millimetri, che mostrano la distribuzione di glicine floribunda agglutinina, arginina vasopressina e DAPI. I segnali di agglutinina del glicine floribunda si osservano nell'area perifornica dell'ipotalamo anteriore e del nucleo reticolare, mentre i segnali di arginina vasopressina sono osservati nel nucleo paraventricolare.

Quando si prova questo protocollo per la prima volta, suggeriamo di eseguirlo sotto la supervisione di un ricercatore esperto. Il protocollo aiuterà a generare risultati istologici ottimali e coerenti tra diversi ricercatori e laboratori e servirà come riferimento per i principianti che imparano questa tecnica.