In vivo Metodi per valutare la funzione e la struttura delle cellule gangliari retiniche e del nervo ottico in animali di grandi dimensioni
26 febbraio 2022
Qui mostriamo diversi test in vivo (potenziale evocato visivo flash, elettroretinogramma pattern e tomografia a coerenza ottica) in macaco di capra e rhesus per comprendere la struttura e la funzione del nervo ottico e dei suoi neuroni.
Ciao a tutti. Questo è Yikui Zhang del Wenzhou Eye Hospital. Il nervo superiore manca di Exxon dalle cellule gangliari dell'orexina e quindi trasmette il segnale visivo al cervello.
Un modello più ampio di lesione del nervo superiore è essenziale per tradurre il nuovo trattamento dal modello robotico all'applicazione linfatica. Qui, descriviamo alcuni metodi in vivo per valutare la struttura e la funzione delle cellule gangliari dell'orexina nel nervo superiore in animali di grandi dimensioni. Presentando questo metodo passo dopo passo, speriamo di aumentare le disabilità riproduttive sperimentali e facilitare l'uso di modelli più ampi di nevrosi ottica.
Rasare il rasoio con rasoio elettronico. E, preparalo con il 70% di alcol tre volte, per pulire la pelle ed esporre la vena sottocutanea. Inserire una ruota venosa periferica per via endovenosa.
Quindi gocciolare atropina e propofol. Intubare la capra con un tubo tracheale di sei millimetri e connettersi a un respiratore artificiale. L'anestesia è stata mantenuta con il 3,5% di isoflurano in ossigeno a una portata gestita costante di due litri.
Posizionare il sensore di temperatura sotto la lingua della capra. Agganciare la fessura di saturazione di ossigeno all'estremità prossimale dell'orecchio di capra. Legare il bracciale per la pressione sanguigna alla base della coscia.
Clamp ECG si spacca sugli arti in ordine. Quindi, possiamo monitorare gli indicatori vitali della capra. Rasare i capelli e disinfettare la pelle con betadina e alcool al 70% tre volte al centro dell'osso frontale.
Aprire il sacchetto sterilizzatore contenente le forbici e le unghie. Fai incisioni cutanee per esporre il cranio con una forbice. Viti in acciaio per impiantato al centro dell'osso frontale.
Rasare i capelli e disinfettare la pelle con betadina e alcool al 70% tre volte in un punto centrale di due orecchie nell'osso occipitale. Fai incisioni cutanee. Viti in acciaio per impiantato nel punto medio di due orecchie nell'osso occipitale.
L'elettrodo dell'ago di terra viene inserito per via sottocutanea sotto la vite cranica frontale. L'elettrodo attivo e l'elettrodo di riferimento sono collegati rispettivamente a viti frontali e occipitali con clip a coccodrillo per ridurre l'impotenza dell'elettrodo. Patch un occhio.
Applicare colliri per anestesia topica sulla superficie oculare. Le pupille su entrambi i lati sono dilatate da colliri midriasi. Metti la testa della capra in uno stimolatore pieno di gas rivolto alla luce deambulante.
Posizionare la coperta nera sopra lo stimolatore e la testa di capra per cinque minuti di adattamento. Lo speculum palpebrale viene utilizzato per esporre completamente la sua pupilla. Controllare l'impotenza del contatto con il tessuto dell'elettrodo.
Assicurarsi che l'impotenza sia inferiore a 10 chilometri per ciascuno per evitare interferenze elettromagnetiche da altri dispositivi elettrici nella stessa stanza. Controllare il rumore di base senza stimolazione luminosa. Avviare la registrazione FVEP.
Si noti che la registrazione FVEP ad ogni intensità luminosa viene eseguita due volte. Si noti che inumidire la cornea con lacrima artificiale se appare asciutta. Ripeti i passaggi per l'occhio controlaterale.
Avviare consecutivamente la registrazione FVEP a diverse intensità luminose. Per ogni registrazione, 64 tracce sono mediate per produrre una forma d'onda. Il primo picco positivo e attivo nella forma d'onda FVEP è stato designato come P1 e N1. L'elettrodo di terra sterilizzato è posizionato nel lobo dell'orecchio.
Gli elettrodi attivi e di riferimento sterilizzati vengono inseriti per via sottocutanea lungo la linea mediana e l'osso frontale e occipitale rispettivamente. Lo speculum palpebrale viene utilizzato per esporre completamente la sua pupilla. Patch un occhio.
Registra consecutivamente le risposte VEP dell'altro occhio a diverse frequenze spaziali. Collegare all'elettrodo di terra con una clip a coccodrillo. Due elettrodi di riferimento dell'ago sterilizzati sono posizionati sotto la pelle un centimetro dietro il canto laterale su entrambi i lati.
Lo speculum palpebrale viene utilizzato per esporre completamente la sua pupilla. Due elettrodi di registrazione ERG disinfettati sono centrati su entrambi la cornea dopo l'applicazione topica di lacrima artificiale. Due stimolatori sono posizionati davanti a ciascun occhio con una distanza di visione di 50 centimetri.
Assicurati che l'impotenza sia inferiore a 10 chilometri. Tieni traccia del rumore di base senza stimolazione luminosa. Punta la luce deambulante.
Avviare la registrazione ERG del modello da entrambi gli occhi contemporaneamente a diverse frequenze spaziali consecutivamente. Infine, ritorno dello schermo per registrare il modello ERG senza stimolatori visivi e un controllo attivo. Il filtro passa-banda è impostato per variare da uno a 75 Hertz per tre pattern CPD ERG.
Il filtro passa-banda va da uno a 50 Hertz per levigare la forma senza alterarne l'ampiezza. I primi picchi positivi e attivi nella forma d'onda sono designati come P1 e N1. L'ampiezza ERG del modello misurata da N1 a P1.To ridurre l'impotenza dell'elettrodo, un riferimento di ago sterilizzato viene posizionato sotto la pelle frontale. E un elettrodo di riferimento dell'ago sterilizzato è posto sotto la pelle un centimetro dietro il canto laterale su un lato.
Un elettrodo di registrazione ERG disinfettato viene posizionato sulla cornea su un'applicazione topica di lacrima artificiale. Patch un occhio. Un display è posizionato a una distanza di visualizzazione di 50 centimetri.
Lo speculum palpebrale viene utilizzato per esporre completamente la sua pupilla. Quindi, la capra viene posizionata sul mentoniera. Allineare la capra con la fotocamera per inviare la sua testa del nervo ottico nell'immagine oftalmoscopia laser a scansione confocale modificando la sua posizione della testa.
Fare clic sul pulsante Start per accedere alla fase finale del rilevamento. Attendere che la macchina finisca di caricare. Premere il pulsante di avvio giallo per avviare l'imaging formale.
Regolare il joystick per illuminare uniformemente l'immagine a infrarossi per migliorare la qualità dell'immagine. Far scorrere la fotocamera in avanti fino a visualizzare l'immagine dello Strumento di personalizzazione di Office retinica verticale sullo schermo in alto a destra. Modificare il joystick per farlo danzare uniformemente in un'immagine OCT retinica orizzontale.
Premi il pulsante sul joystick per catturare automaticamente la tua immagine. Tenere premuto questo joystick per mantenere la qualità dell'immagine sullo schermo dell'immagine dal vivo fino al completamento dell'esecuzione dell'immagine. Quindi premere acquisisci.
Seleziona una foto iniziale di alta qualità. Fare clic con il pulsante destro del mouse e selezionare Imposta riferimento. Premere il pulsante di follow-up per consentire al programma di abbinare automaticamente la scansione corrente alla scansione di base.
Una volta abbinato, premi il pulsante sul joystick per attivare il tracciamento automatico in tempo reale. Fare clic sul pulsante di misurazione per accedere alla piattaforma di misurazione. Scegli la gomma uno strumento e cancella la linea RFL, che viene automaticamente etichettata dalla macchina.
Scegliete lo strumento di disegno a linee per delineare manualmente il limite tra IPL e INL. Tra le linee rosse e blu c'è il complesso GCC. L'imaging alterato della retina nel macaco rhesus viene eseguito utilizzando le stesse attrezzature e procedure utilizzate nella capra.
La figura A mostra FVEP rappresentativo nella capra. La figura B mostra il modello rappresentativo della forma d'onda ERG nella capra. La figura C mostra il modello rappresentativo FVEP nel macaco rhesus.
E la figura D mostra il modello rappresentativo della forma d'onda ERG nel macaco rhesus. La figura due mostra immagini OCT retiniche rappresentative intorno alla testa del nervo ottico e lo spessore del complesso GCC in diverse regioni periferiche nella capra e nel macaco rhesus. Il modello animale di grandi dimensioni svolge un ruolo importante nella ricerca traslazionale.
In molti casi, gli effetti terapeutici promettenti in modelli di piccoli animali non sono stati tradotti in pazienti umani. In questo studio, abbiamo presentato il protocollo video di FVEP, PERG e OCT nella capra e nel macaco rhesus. Questo metodo in vivo può essere applicato in modelli più ampi di varie nevrosi ottiche, come la neuropatia ottica ischemica o traumatica del glaucoma e la neurite ottica.
Visualizza la trascrizione completa e accedi a migliaia di video scientifici
Panoramica
Questo studio presenta diversi test in vivo, tra cui il potenziale evocato visivo a lampo, l'elettroretinogramma a schema e la tomografia a coerenza ottica, effettuati su capre e macachi rhesus. La ricerca ha lo scopo di esplorare la struttura e la funzione del nervo ottico e dei suoi neuroni, fornendo informazioni sul trasmissione del segnale visivo.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Elettrofisiologia
- Oftalmologia
Sfondo
- Lo studio si concentra sulla funzione delle cellule gangliari dell'orexina nella trasmissione del segnale visivo.
- I modelli animali di maggiori dimensioni sono fondamentali per tradurre i trattamenti dai sistemi robotici ad applicazioni pratiche.
- Comprendere la funzione del nervo ottico può migliorare le conoscenze sui disturbi visivi.
- I metodi in vivo sono essenziali per valutare le strutture e le funzioni neuronali.
Scopo dello studio
- Valutare i metodi per esaminare la risposta del nervo ottico agli stimoli visivi.
- Migliorare la riproducibilità degli esperimenti che coinvolgono modelli animali di maggiori dimensioni.
- Comprendere la biomeccanica della neurite ottica e i suoi potenziali trattamenti.
Metodi Utilizzati
- Sono stati eseguiti test in vivo, inclusi potenziali evocati visivi a lampo (FVEP), elettroretinogrammi a stimolo di pattern (PERG) e tomografia a coerenza ottica (OCT).
- I modelli biologici consistevano in capre e macachi rhesus.
- Ogni metodo includeva passaggi preparatori specifici, come la gestione dell'anestesia, la preparazione chirurgica e il monitoraggio elettrico.
- I passaggi critici prevedevano la verifica dell'impedenza degli elettrodi e il rigoroso rispetto delle procedure di raccolta dati.
Risultati principali
- Lo studio ha descritto la registrazione delle risposte FVEP e PERG per valutare l'elaborazione del segnale visivo nel nervo ottico.
- I risultati hanno indicato picchi specifici (P1 e N1) nei tracciati che si correlavano con gli stimoli visivi.
- La ricerca ha fornito metodologie per mantenere la qualità e l'affidabilità dei dati nelle registrazioni.
- Sono stati evidenziati approfondimenti sulle risposte neuronali e le possibili implicazioni per i trattamenti.
Conclusioni
- Questo studio dimostra metodi efficaci per valutare la funzione del nervo ottico mediante test in vivo.
- I risultati contribuiscono alla comprensione della trasmissione del segnale visivo e delle implicazioni per il trattamento delle lesioni del nervo ottico.
- I risultati sottolineano l'importanza dei modelli animali di grandi dimensioni nel tradurre la ricerca fondamentale in neuroscienze in applicazioni cliniche.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La valutazione della funzione delle cellule gangliari retiniche e del nervo ottico in animali di grandi dimensioni collega i risultati preclinici alla traduzione clinica umana, fornendo modelli anatomicamente e fisiologicamente rilevanti. Metodi elettrofisiologici e di imaging in vivo consentono una valutazione quantitativa dell'integrità della via visiva, supportando la riduzione del rischio meccanicistico di terapie neuroprotettive e rigenerative. Questo approccio aumenta la fiducia predittiva nella validazione degli obiettivi per le neuropatie ottiche come il glaucoma, i traumi e i disturbi infiammatori.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Valore scientifico: Consente l'analisi di ipotesi terapeutiche riguardo alla sopravvivenza delle cellule gangliari retiniche e alla conduzione assonale in sistemi pertinenti alla malattia.
- Valore operativo: Fornisce letture funzionali e strutturali che chiariscono l'attivazione del percorso e l'attività biologica di nuovi composti.
- Valore predittivo: Supporta l'identificazione di composti promettenti correlando la modulazione del bersaglio con esiti elettrofisiologici e strutturali in modelli animali di grandi dimensioni.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Genera misurazioni quantitative e ripetibili di potenziali evocati visivi e spessore retinico per la standardizzazione dei saggi.
- Valore operativo: Stabilisce protocolli riproducibili per il monitoraggio longitudinale degli effetti del trattamento tra coorti di studio.
- Scalabilità: Facilita il riutilizzo della piattaforma attraverso specie diverse (capra, macaco rhesus) e modelli di lesione (ischemici, traumatici, infiammatori).
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Misura cambiamenti strutturali rilevanti per la malattia (spessore del complesso GCC) e deficit funzionali (ampiezze di VEP e PERG) allineati con endpoint clinici.
- Valore operativo: Permette la continuità dalla fase di scoperta alla validazione preclinica monitorando gli stessi parametri attraverso diversi sistemi modello.
- Controllo del rischio: Guida le decisioni di proseguimento o interruzione indicando l'interazione con il bersaglio e l'effetto biologico in specie clinicamente rilevanti.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
I metodi descritti si integrano nel percorso di scoperta, dalla validazione del bersaglio fino all'ottimizzazione del composto promettente e ai test di efficacia preclinica, fornendo biomarcatori funzionali e strutturali della salute del nervo ottico.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica di ipotesi sui meccanismi neuroprotettivi mediante la quantificazione della funzionalità delle cellule gangliari retiniche e dell'integrità assonale.
- Screening: Fornisce output standardizzati pronti per i saggi (ampiezze delle onde, latenze, spessore degli strati retinici) per la valutazione dei composti.
- Analisi: Permette il confronto statistico degli effetti dei trattamenti tramite la misurazione dei picchi P1/N1 e la quantificazione del complesso GCC.
- Ricerca traslazionale: Collega i dati di elettrofisiologia funzionale e di tomografia a coerenza ottica strutturale agli esiti visivi clinici nelle neuropatie ottiche umane.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma interspecie e intermodello per la verifica iterativa di terapie salvavista.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Riduce l'ambiguità meccanicistica collegando la modulazione del bersaglio a una funzione e struttura misurabili del percorso visivo.
- Valore operativo: Garantisce la riproducibilità attraverso protocolli standardizzati di posizionamento degli elettrodi, controllo dell'impedenza e mediazione del segnale.
- Valore strategico: Migliora l'efficienza del capitale consentendo il rilevamento precoce di candidati inefficaci prima di costosi studi clinici.
- Impatto sul portafoglio: Favorisce la priorizzazione corretta del rischio mediante biomarcatori oggettivi e traslazionali della preservazione del nervo ottico.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze in elettrofisiologia, preparazione chirurgica e gestione dell'anestesia in animali di grandi dimensioni.
- È dipendente da sistemi di registrazione elettrofisiologica, piattaforme di imaging OCT e dispositivi di somministrazione dello stimolo.
- Necessita della standardizzazione dell'impedenza dell'elettrodo (<10 kΩ), della valutazione del rumore di base e della media triplicata del segnale.
- Comporta considerazioni di adattamento relative all'anatomia specifica delle specie (parametri cranici e oculari di capra rispetto a macaco rhesus).
- È limitato dalla complessità delle procedure e dal rispetto delle norme sul benessere animale, che possono influenzare la produttività e la scalabilità.
