Tessuto trattato con radioligandi attivati da fluorescenza per determinare l'origine cellulare del segnale radioattivo

Questo protocollo è complementare all'imaging in vivo. Permette la quantificazione del tipo cellulare e del livello cellulare dei radiotraccianti, che è una scala diversa da quella ottenuta in vivo. Il vantaggio principale di questa tecnica è la sua sensibilità e la risoluzione cellulare data dall'uso di radioligandi e dalla cernita cellulare.

Accendere la fotocamera e caricare il software operativo. Fare clic sul pulsante Home XYZ stage per eseguire l'homing. Imposta l'esperimento composto da un'acquisizione di scansione di 10 minuti.

Impostare la modalità Step su fine e la modalità Acquisition su Listmode per registrare l'intero spettro di emissione. Impostare il letto e assicurarsi che il sistema di riscaldamento, il sensore respiratorio e l'anestesia siano funzionali e sicuri. Quindi, posiziona un fantasma dove verrà posizionata la testa dell'animale.

Imposta l'area di scansione facendo scorrere i cursori per le tre dimensioni con l'aiuto delle tre immagini nella parte inferiore dello schermo. Assicurarsi che il volume di scansione del fantasma e dell'animale sia lo stesso. Avviare la scansione fantasma per la successiva calibrazione con i parametri stabiliti in precedenza.

Assicurarsi di lavorare in un ambiente appropriato, autorizzato per esperimenti che coinvolgono la radioattività. Incubare 100 microgrammi di precursore della tributilina in 100 microlitri di acido acetico con ioduro di sodio e cinque microlitri di acido paracetico al 37% a 70 gradi Celsius per 20 minuti in un termociclatore posizionato in un vano portaoggetti. Diluire la reazione utilizzando il 50% di acetonitrile in acqua per raggiungere un volume di 500 microlitri.

Iniettare i 500 microlitri della reazione diluita su una colonna a fase inversa. Isolare il CLINDE con un HPLC a gradiente lineare eseguito dal 5 al 95% di ACN in acido fosforico a sette millimolari per 10 minuti. Diluire l'isolato in acqua per ottenere un volume finale di 10 millilitri e quindi iniettare la reazione diluita su una colonna di concentrazione.

Eluire il CLINDE dalla colonna con 300 microlitri di etanolo assoluto e quindi evaporare l'etanolo incubandolo in una centrifuga sottovuoto a temperatura ambiente per 40 minuti. Diluire il residuo contenente il CLINDE in 300 microlitri di soluzione salina per creare una soluzione madre. Dopo aver misurato la sua radioattività, diluire la soluzione madre in soluzione salina per ottenere una soluzione di 0,037 megabecquerel in 500 microlitri.

Stabilire le curve di calibrazione con composti di riferimento freddi e risolvere l'equazione di regressione lineare:Y uguale a AX più B per ottenere i coefficienti A e B. X rappresenta la massa del composto freddo e Y rappresenta l'area sotto le curve. Controllare l'area sotto la curva del radioligand, misurando l'assorbanza ultravioletta a 450 nanometri in base alla curva di calibrazione e l'area sotto la curva del radioligand.

Stimare la massa e misurare l'attività del radioligando. Assicurarsi che l'attività specifica sia maggiore di 1.000 gigabecquerel per micromole. Fare clic sul pulsante Aggiorna immagine per aggiornare la posizione dell'animale.

Imposta l'area di scansione facendo scorrere i cursori con l'aiuto delle tre immagini nella parte inferiore dello schermo per le tre dimensioni. Imposta l'esperimento su una scansione di 60 minuti che costituisce 60 fotogrammi di un minuto. Riutilizzare tutti gli altri parametri impostati inizialmente.

Iniettare 500 microlitri del radiotracciante radioattivo e quindi lavare il tubo con 300 microlitri di cloruro di sodio sterile allo 0,9%. Contemporaneamente, fare clic su Avvia acquisizione per avviare la scansione. Aprire il software di ricostruzione della scansione e quindi aprire il set di dati, cercando il file dei parametri del nome file creato nella cartella della scansione.

Selezionare l'isotopo di interesse. Si noti che il parametro list mode consente la selezione di più isotopi in questo passaggio. Imposta i diversi parametri di ricostruzione come la dimensione del voxel, il numero di sottoinsiemi e le iterazioni come descritto nel manoscritto.

Selezionare il formato di output come NIFTI e quindi selezionare Avvia ricostruzione SPECT. Usa una spatola metallica piatta e una lama di rasoio per sezionare le regioni di interesse del cervello. Posizionare i tessuti in un tubo di centrifuga da due millilitri e pesare il tessuto ottenuto.

Mettere i campioni in un tubo di centrifuga da due millilitri con un millilitro di HBSS privo di calcio e magnesio e quindi centrifugare a 300 volte G per due minuti a temperatura ambiente e rimuovere il surnatante senza disturbare il pellet. Aggiungere 1.900 microlitri di miscela enzimatica e incubarlo per 15 minuti a 37 gradi Celsius mentre si agitano i tubi per inversione ogni cinque minuti. Aggiungere 30 microlitri di enzima mescolare due.

Agitare delicatamente con una pipetta da 1.000 microlitri avanti e indietro 30 volte. Quindi, incubare la miscela per 15 minuti a 37 gradi Celsius mentre si agitano i tubi per inversione ogni cinque minuti. Mescolare delicatamente avanti e indietro con una pipetta da 200 microlitri e poi una pipetta da 10 microlitri prima di incubare la miscela per 10 minuti a 37 gradi Celsius per dissociare i tessuti.

Filtrare le cellule con un filtro cellulare da 70 micrometri e aggiungere 10 millilitri di HBSS privo di calcio e magnesio. Centrifugare a 300 volte G per 10 minuti a temperatura ambiente e rimuovere il surnatante senza disturbare il pellet. Per l'esaurimento della mielina, risospesciare il pellet con 400 microlitri di tampone per la rimozione della mielina e quindi aggiungere 100 microlitri di perle di rimozione della mielina prima di incubare per 15 minuti a quattro gradi Celsius.

Aggiungere cinque millilitri di tampone per la rimozione della mielina e centrifugare 300 volte G per 10 minuti a temperatura ambiente. Aggiungere 500 microlitri di tampone per la rimozione della mielina e posizionare i pellet sospesi nella colonna del campo magnetico. Lavare la colonna con un millilitro di tampone per la rimozione della mielina quattro volte.

Centrifugare a 300 volte G per due minuti a temperatura ambiente e rimuovere il surnatante senza disturbare il pellet. Vortice brevemente per dissociare le cellule e aggiungere cinque microlitri di Fc Block CD32. Aggiungere 100 microlitri del mix di anticorpi primari di interesse e incubare per 20 minuti a quattro gradi Celsius.

Centrifugare a 350 volte G per cinque minuti a quattro gradi Celsius e rimuovere il surnatante senza disturbare il pellet. Asciugare i tubi a testa in giù su carta morbida. Ruotare brevemente il tubo, quindi aggiungere 100 microlitri della miscela di anticorpi secondari e incubare per 15 minuti a quattro gradi Celsius.

Aggiungere un millilitro di tampone per la rimozione della mielina e ripetere la centrifugazione. Scartare il surnatante e tamponare i tubi a testa in giù su carta morbida. Risospese le cellule in 250 microlitri di PBS sterile e procedere direttamente allo smistamento cellulare.

La scansione SPECT in vivo di ratti selvatici ha mostrato un legame più elevato di CLINDE nel sito di iniezione di lipopolisaccaride rispetto alla regione controlaterale del cervello. I campioni ex vivo sottoposti a tessuto trattato con radioligandi di selezione cellulare attivata a fluorescenza, o FACS-RTT, hanno rivelato la presenza di un numero maggiore di siti di legame CLINDE solo nelle microglia, dimostrando che l'origine cellulare del segnale CLINDE nel lato ipsilaterale del cervello era microglia. L'aumento della proteina traslocatrice, o legame TSPO, a 12 mesi nei ratti TgF344-AD è stato limitato agli astrociti.

Nei ratti di 24 mesi, l'aumento del legame TSPO è stato osservato a causa di alterazioni sia astrocitiche che microgliali. Nei ratti TgF344-AD più anziani, gli astrociti striatali hanno mostrato una diminuzione della densità di 5HT2AR rispetto al wild-type. Una sovraespressione corticale di TSPO è stata osservata sia negli astrociti che nelle microglia di soggetti ad AD rispetto ai controlli di pari età quando FACS-RTT è stato eseguito su campioni umani di AD post mortem.

Quando si lavora con la radioattività, seguire le istruzioni di radioprotezione e indossare dispositivi di protezione individuale appropriati. Quindi, dopo la procedura, assicurati di decontaminare l'ambiente di lavoro. La quantificazione delle proteine e l'analisi dell'espressione genica possono essere facilmente eseguite dopo questa procedura su popolazioni cellulari isolate.