Progettazione e sviluppo di un modello per studiare l'effetto dell'ossigeno supplementare sul microbioma delle vie aeree della fibrosi cistica

Questi protocolli sono progettati per modellare gli effetti in vitro dell'uso supplementare di ossigeno sul microbioma polmonare dei pazienti con fibrosi cistica. Questa ricetta multimediale è adattata per rispecchiare la composizione fisiologica dell'espettorato per le persone che vivono con la fibrosi cistica. Il processo di sparging introduce la capacità di coltivare in diverse condizioni di ossigeno.

Le alterazioni del mezzo espettorato artificiale consentono di imitare altre malattie polmonari croniche e modellare comunità microbiche in altre condizioni, come diverse concentrazioni di glucosio in pazienti concomitanti con fibrosi cistica e diabete. Una panoramica dei passaggi per la preparazione del mezzo espettorato artificiale mostra la miscelazione di ASCM, ASMM e ASBM preparati. Il tampone mops viene utilizzato per titolare il pH a 6,3 e la sterilizzazione del filtro del mezzo viene effettuata in una cella frigorifera su uno shaker orbitale.

Per cominciare, preparare un mezzo espettorato artificiale aggiungendo 250 millilitri di ASCM alla bottiglia da un litro contenente ASMM. Quindi aggiungere 250 millilitri di ASBM alla bottiglia media. Titolare il mezzo con un tampone mops molare di base per raggiungere un pH di 6,3 su una carta a pH.

Refrigerare il mezzo espettorato artificiale a quattro gradi Celsius fino alla filtrazione. Quindi, per avviare il processo di filtrazione, trasferire 200 millilitri di mezzo espettorato artificiale non filtrato a un sistema di filtrazione a vuoto con un filtro di dimensioni dei pori di 0,22 micrometri. Dopo aver collegato il sistema di filtrazione alla pompa per vuoto, accendere la pompa per vuoto, quindi posizionare la camera su uno shaker orbitale, agitando a 90 rotazioni al minuto in una cella frigorifera a quattro gradi Celsius.

Cambia il filtro dopo che 350 millilitri di mezzo vengono filtrati per superare il problema dell'intasamento. Dopo che una quantità considerevole è filtrata, a un mezzo extra di 150 millilitri per la filtrazione. Ripetere la filtrazione con camere aggiuntive fino a quando tutto il fluido non viene filtrato.

Panoramica dello spargimento di ossigeno che dimostra l'aggiunta dell'espettorato del paziente al mezzo espettorato artificiale in un flacone di siero autoclavato. Quindi spargere la bottiglia di siero sigillata con una miscela di gas. Infine, il flacone di siero viene incubato per ottenere la coltura di Alec Watts all'intervallo di 24 ore per il successivo sequenziamento meta genomico.

Per iniziare lo sparging della coltura del flacone di siero, etichettare i flaconi di siero autoclavati da 500 millilitri con identificatori del campione, data e ora di inoculazione e percentuale di ossigeno target. In un cappuccio biologico, aggiungere 24 millilitri del mezzo espettorato artificiale a ciascun flacone di siero in fase di installazione. Per ottenere un volume di campione sufficiente per ogni condizione di coltura, se necessario, diluire il campione con soluzione salina tamponata con fosfato sterile, quindi omogeneizzare l'espettorato con un ago da 18 gauge e aggiungere un millilitro dell'espettorato del paziente a ciascun flacone di siero.

Successivamente, utilizzando una pinzetta sterile, posizionare i tappi di gomma autoclavati sulla parte superiore di ciascun flacone di siero, premere verso il basso i tappi di gomma senza toccare la parte inferiore del tappo. Dopo aver rimosso le bottiglie dal cappuccio, applicare e crimpare i sigilli in alluminio. Rimuovere il centrotavola dei sigilli e pulire la parte superiore delle bottiglie con una salvietta imbevuta di alcool e passare il sigillo della bottiglia attraverso una fiamma del bruciatore Bunsen.

Ora fissare un ago sterile calibro 18 a una siringa a stantuffo con un filtro, inserire prima la siringa di rilascio del gas apposta nella bottiglia. Ora fissare un ago sterile calibro 18 all'uscita del gas dal sistema e inserire anche l'ago di uscita del gas nella bottiglia. Instradare le giunzioni a T dai serbatoi attraverso il monitor dell'ossigeno.

Dopo aver verificato la concentrazione di ossigeno target che scorre attraverso il sistema, mirare a circa cinque litri al minuto di flusso di gas. Reindirizzare le giunzioni a T dai serbatoi fino all'uscita del gas. Quando il gas inizia a fluire attraverso la bombola di siero, prestare molta attenzione al manometro e, se la pressione aumenta inaspettatamente, spegnere immediatamente il sistema.

Dopo la corsa, l'ossigeno scorre attraverso la bottiglia di siero per un minuto a cinque litri al minuto, le impostazioni consentono 10 scambi d'aria e assicurano che l'atmosfera interna raggiunga la concentrazione desiderata di ossigeno al 100%. Rimuovere il rilascio di gas, ago calibro 18. Dopo aver lasciato che la pressione nella bottiglia di siero si accumulasse in un'atmosfera, rimuovere immediatamente l'ago di uscita del gas.

Incubare i flaconi di siero in uno shaker per incubatore a 37 gradi Celsius a 150 rotazioni al minuto per intervalli di 3, 24 ore. Alec Watts vengono prelevati ad ogni intervallo di 24 ore per l'analisi a valle e i campioni vengono rigenerati ogni volta. L'esempio qui mostra come può apparire una cultura prima e dopo l'incubazione.

I livelli di ossigeno e pH di deflusso sono stati misurati nel corso del processo di coltura per i campioni di espettorato mantenuti a 37 gradi Celsius. Con entrambi gli intervalli di sparging di 12 ore e 24 ore, le concentrazioni di ossigeno sono state approssimativamente mantenute nel tempo con un moderato calo della concentrazione di ossigeno osservato per tutte e tre le condizioni. I livelli di pH misurati erano all'interno dell'intervallo fisiologico senza cambiamenti significativi nel tempo.

Il confronto tra carica microbica, diversità e composizione della comunità tra espettorato non coltivato e in coltura ha rivelato un aumento di 20 volte della carica microbica nell'espettorato in coltura. Le metriche di diversità indicavano la conservazione della composizione della comunità con differenze globali minime introdotte dal processo culturale. L'analisi comparativa delle 120 specie microbiche nell'espettorato in coltura e non coltivato è stata eseguita mediante sequenziamento meta genomico.

46 di queste specie sono state identificate sia in campioni non coltivati che coltivati. Mentre 35 sono stati identificati esclusivamente in campioni non coltivati e 39 sono stati identificati esclusivamente in campioni coltivati. Sono state generate curve di crescita basate sull'assorbimento per i comuni patogeni polmonari CF coltivati in mezzi espettorati artificiali da isolati di campioni di pazienti con una normale concentrazione di ossigeno del 21%.

Nessun cambiamento nel tempo nella densità ottica a 600 nanometri nell'ASM solo il controllo negativo ha indicato una coltura priva di contaminazione. I tipici modelli di curva di crescita osservati indicano che il mezzo ASM può essere utilizzato per la generazione di curve di crescita utilizzando metodi ottici. Il sequenziamento metagenomico viene qui utilizzato per descrivere la composizione della comunità microbica.

Altre tecniche come il sequenziamento metatrascrittomico possono essere utilizzate per valutare l'espressione genica o la metabolomica per valutare la produzione di metaboliti.