Metodo ad alta produttività, robusto e altamente flessibile nel tempo per la sterilizzazione superficiale dei semi di Arabidopsis

Viene fornito un protocollo ad alto rendimento per la sterilizzazione superficiale dei semi di Arabidopsisthaliana (Arabidopsis), ottimizzando le fasi di movimentazione del liquido con un semplice dispositivo di aspirazione costruito con una pompa per vuoto. Centinaia di campioni di semi possono essere sterilizzati in superficie in un giorno.

Questo protocollo migliora la sterilizzazione della superficie dei semi, un passo fondamentale nella genomica funzionale della specie modello Arabidopsisthaliana. I principali vantaggi di questa tecnica sono la facilità e l'elevata produttività, consentendo l'elaborazione di centinaia di campioni al giorno. Con alcune semplici modifiche, questo metodo può essere applicato a molte altre specie vegetali modello e non modello.

Per gli utenti alle prime armi, si prega di prestare attenzione alla temperatura del mezzo e alla velocità di centrifugazione in quanto sono entrambi fondamentali per la sopravvivenza del seme. Per iniziare, preparare il 70% di etanolo aggiungendo il 95% di etanolo tecnico all'acqua distillata e mescolando accuratamente. Quindi, preparare la soluzione di candeggina al 5% aggiungendo cinque millilitri di candeggina domestica a 95 millilitri di acqua distillata sterile.

Quindi, aggiungere alcune gocce di detergente non ionico alla soluzione di candeggina e mescolare accuratamente. Quindi, preparare Murashige e Skoog medium a mezza forza aggiungendo 2,2 grammi di polvere media MS comprese le vitamine e 10 grammi di saccarosio in 800 millilitri di acqua distillata. Regolare il pH del mezzo a 5,7 usando un idrossido di potassio molare, quindi portare il volume a un litro usando acqua distillata.

Aliquota 500 millilitri del mezzo in una bottiglia da un litro e aggiungere quattro grammi di agar per preparare un mezzo solido. Dopo l'autoclave, lasciare raffreddare il mezzo a 50-53 gradi Celsius a bagnomaria. Quindi versarlo in piastre di Petri sotto la cappa a flusso laminare.

Per preparare il mezzo selettivo, aggiungere kanamicina al mezzo e versarlo in piastre di Petri come dimostrato in precedenza. Per impostare l'aspiratore, collegare l'ingresso della pompa per vuoto a un'estremità di un tubo di polietilene di dimensioni adeguate. Quindi collegare l'altra estremità del tubo all'uscita del coperchio bidirezionale della bottiglia di decantazione.

Avvolgere saldamente la giunzione del tubo con un film sigillante per garantire una connessione ermetica. Quindi, collegare un secondo tubo di polietilene all'ingresso del tappo a vite sul flacone di decantazione. Quindi collegare l'altro lato del tubo all'uscita di una valvola dell'acquario dotata di un sottile tubo di polietilene.

Se necessario, avvolgere la giunzione con il film sigillante per eliminare le perdite d'aria. Dopo aver etichettato due lotti di 48 tubi microcentrifuga da 1,5 millilitri con numeri progressivi, aggiungere da 100 a 200 semi di Arabidopsis a ciascuno dei 96 tubi microcentrifuga sterili, circa uno o due millimetri sopra il fondo dell'estremità conica del tubo. Successivamente, utilizzando una pipetta sierologica sterile da 10 millilitri, aggiungere circa un millilitro di etanolo al 70% in ciascun tubo e chiudere con attenzione i coperchi.

Agitare i tubi ad una frequenza di oscillazione di otto hertz per tre minuti in uno shaker. Quindi rimuovere gli adattatori dallo shaker e trasferirli nel cestello di una microcentrifuga da banco per far girare i semi utilizzando la funzione di impulso. Dopo aver trasferito i tubi su un rack, aprire tutti i tubi sotto la cappa a flusso laminare.

Non toccare la parte dei coperchi che si inseriscono nei tubi per evitare contaminazioni. Quindi, sotto il cappuccio a flusso laminare, montare una punta gialla sterile da 200 microlitri sull'ingresso della valvola dell'acquario dell'aspiratore fatto in casa e accendere la pompa. Inserire la punta appena sopra il livello dei semi per evitare di toccare i semi quando si succhia il liquido.

Successivamente, utilizzando una pipetta sierologica sterile da 10 millilitri, aliquotare un millilitro di soluzione di candeggina al 5% in ciascun tubo. Chiudere i coperchi prima di riposizionare i tubi negli adattatori dello shaker, quindi agitare i tubi come dimostrato in precedenza. Dopo aver fatto girare i semi utilizzando la funzione di impulso di una centrifuga da banco, montare una nuova punta gialla sterile da 200 microlitri sulla valvola dell'acquario e accendere la pompa.

Inserire la punta sopra il livello dei semi per evitare di toccare i semi quando si succhia la soluzione di candeggina. Successivamente, utilizzando una pipetta sierologica sterile da 10 millilitri, aliquotare un millilitro di acqua sterilizzata in ciascun tubo. Dopo aver montato una nuova punta gialla sterile da 200 microlitri sulla valvola dell'acquario, accendere la pompa.

Inserire la punta appena sopra il livello dei semi per evitare di toccare i semi quando si succhia l'acqua. Infine, aliquota 500 microlitri di acqua sterilizzata in ciascun tubo e chiudere tutti i coperchi nella cappa a flusso laminare. I semi sono ora pronti per essere seminati.

Se necessario, mantenere i tubi a temperatura ambiente per un massimo di alcune ore o a quattro gradi Celsius durante la notte. Usando una pipetta da un millilitro, trasferire i semi con 300-400 microlitri di acqua sterile in una capsula di Petri. Dopo aver trasferito 10 tubi, versare da 1,5 a due millilitri di mezzo Murashige e Skoog fuso a mezza forza senza antibiotici in ciascuna piastra.

Ruotare rapidamente il piatto per distribuire i semi e fissare i piatti sui lati opposti. Avvolgere le piastre in un foglio di plastica o alluminio e metterle in frigorifero per tre giorni al buio per ottenere una germinazione uniforme. Le analisi di germinazione eseguite nei giorni due, tre, quattro e sette non hanno indicato differenze significative tra 10 e 40 minuti di tempo di sterilizzazione con etanolo al 70%.

Tuttavia, quando il tempo di sterilizzazione ha superato i 40 minuti, i tassi di germinazione sono diminuiti. Di conseguenza, anche i tassi di emergenza del cotiledone verde sono diminuiti. Sulla base dello studio, sono stati selezionati tre minuti per il 70% di etanolo e tre minuti per il 5% di candeggina come tempo minimo per sterilizzare i semi.

Per dimostrare che i semi utilizzati originariamente erano contaminati da microrganismi, i semi non sterili sono stati seminati direttamente sulle piastre. Rispetto ai semi sterili, i semi non sterili hanno mostrato un aspetto fungino dopo due giorni, che si sono diffusi su tutte le piastre dopo una germinazione di sette giorni. Un test di contaminazione incrociata eseguito utilizzando una singola punta di pipetta sterile per elaborare diversi campioni di semi ha mostrato che non sono stati osservati cotiledoni verdi nei semi del genotipo Columbia-0 seminati in piastre con kanamicina.

In parallelo, nei semi di Columbia-0 seminati in piatti senza kanamicina, tutti i cotiledoni apparivano verdi dopo la germinazione. Questi risultati non indicano alcun riporto di contaminazione tra i campioni nonostante l'utilizzo di una singola punta di pipetta per rimuovere la soluzione sterile. Questa procedura è la base per molti altri metodi di genomica funzionale come la sovraespressione genica, l'editing del genoma, la localizzazione subcellulare, l'attività del promotore e le interazioni proteina-proteina e proteina-DNA.