Name: Funzionamento di fotobioreattori da laboratorio con misurazioni di crescita online e regimi di luce personalizzabili (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 21 s
Description: Impara a progettare fotobioreattori da laboratorio per microalghe con monitoraggio continuo dell'ossigeno e regimi luminosi personalizzabili. Questo protocollo riduce l'intervento manuale e ottimizza la coltivazione.

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Questo studio è stato sostenuto dal Natural Sciences and Engineering Research Council (NSERC), dalla Canada Foundation for Innovation (CFI), dal Canada First Research Excellence Fund (CFREF), dall'Alberta Innovates, dalla General Sir John Monash Foundation, dal governo dell'Alberta e dall'Università di Calgary. I ringraziamenti sono estesi a Mark Toonen per il lavoro elettrico e William Richardson per i calcoli di solubilità.

1. Costruzione dello stand PBR
<ol><li>Con un seghetto portatile, taglia cinque lunghezze da 380 mm e due lunghezze da 200 mm di acciaio scanalato angolato. Fissare insieme con bulloni e grandi bretelle angolari per creare la base di un supporto (Figura 1A). Colla sui tappi terminali di sicurezza.</li>
	<li>Collegare alla base due lunghezze verticali non tagliate (1220 mm) di acciaio scanalato angolato. Fissare con bulloni e soffietti angolari in metallo (Figura 1B). Colla sui tappi terminali di sicurezza.</li>
	<li>Tagliare quattro lunghezze piatte da 65 mm di acciaio scanalato. Imbullonarli con angoli di 90° sui supporti verticali: attaccarne due a ciascun supporto, uno a 130 mm dalla base (Figura 1C) e uno a 60 mm verso il basso dall'alto.</li>
	<li>Fissare i supporti verticali sulla parte superiore con una lunghezza orizzontale di 140 mm di acciaio a fessura piatta (traversa) imbullonata sul retro del telaio (Figura 2A).</li>
</ol>2. Costruzione della camera luminosa
<ol><li>Tagliare un tubo bianco di cloruro di polivinile (PVC) di 153 mm di diametro a una lunghezza di 1070 mm. Tagliare il tubo a metà longitudinalmente con una sega a nastro. Carteggia tutti i bordi.</li>
	<li>Uniformemente spazio e centro quattro canali di dissipatore di calore in alluminio verticalmente insieme all'interno del tubo. Non fissare canali entro 20 mm dal bordo tagliato del tubo. Con piccoli bulloni, fissare i canali in posizione superiore e inferiore (Figura 2B).</li>
	<li>Imbullonare metà del tubo al supporto utilizzando i supporti orizzontali modellati nel passaggio 1.3.</li>
	<li>Posare il reattore e riunire le metà del tubo nastrandole insieme. Centrare la cerniera del pianoforte lungo una linea di taglio. Traccia i fori della cerniera e fora il tubo di conseguenza. Utilizzare una pistola rivettato e rivetti di media lunghezza per fissare la cerniera al tubo.</li>
	<li>Utilizzare un piccolo cavo elastico (vedere Tabella dei materiali) per tenere chiuso il tubo (Figura 1C).</li>
	<li>Consultare un elettricista per collegare le luci a LED e installare i seguenti quattro componenti: driver LED, decodificatore digitale multiplex (DMX), controller di illuminazione DMX e scatola di commutazione (vedere Tabella dei materiali). Fissare tutti i componenti sul retro del PBR secondo la Figura 2A.</li>
</ol>3. Costruzione delle piattaforme per bottiglie
<ol><li>Tagliare le forme della piattaforma (Figura 3A) dalla plastica dura, ad esempio polietilene ad alta densità (HDPE) (vedere Tabella dei materiali), utilizzando la fresatura a controllo numerico computerizzato (CNC). Crea tre di ogni forma. NOTA: si consiglia di tagliare gli strati superiori e inferiori di ricambio.</li>
	<li>Nastro insieme lo strato inferiore e superiore. Contrassegnare e praticare cinque piccoli fori, di 6 mm di diametro, attraverso entrambe le forme (Figura 3A). Utilizzando una punta più grande, espandere con attenzione la superficie di questi fori in modo che le teste dei bulloni possano essere incassate (Figura 3B).</li>
	<li>Per ciascuna delle tre piattaforme, imbullonare due piccole parentesi angolari alla metà posteriore del tubo. NOTA: la distanza tra la parte superiore delle parentesi graffe deve essere di 350 mm.</li>
	<li>Centra ogni strato inferiore sopra le sue parentesi graffe. Segna la posizione dei fori di perforazione da sotto le parentesi graffe. Praticare due fori di 6 mm di diametro. Utilizzando una punta più grande, espandere con attenzione la superficie dei fori in modo che i bulloni possano essere incassati.</li>
	<li>Imbullonare gli strati inferiori alle loro parentesi graffe (Figura 3B–C).</li>
	<li>Tagliare quindici pezzi di tubi rigidi di diametro esterno (OD) lunghi 12 mm e 6,35 mm. Sandwich cinque pezzi del tubo rigido tra ogni strato superiore e inferiore. Fissare strati e tubi insieme a bulloni lunghi e stretti secondo la Figura 3B-D.</li>
	<li>Praticare un grande foro nel tubo in PVC dietro ogni piattaforma. Inserire ogni micro agitatore magnetico nella sua piattaforma. Infilare il cavo elettrico di ciascun agitatore attraverso questi fori appena tagliati (Figura 3C-E). Collegare ogni agitatore alla rispettiva unità di controllo e a una presa di corrente.</li>
	<li>Posizionare una bottiglia da 1 L su ogni piattaforma. Aggiungere golfari nel tubo posteriore a livello del collo della bottiglia. Avvolgere un piccolo cavo elastico attorno a ciascun collo della bottiglia per aggiungere stabilità (Figura 4A). NOTA: in tutto il protocollo, saranno utili piattaforme di codifica a colori, bottiglie, agitatori magnetici e tutti i cavi e sensori associati.</li>
</ol>4. Costruzione delle porte di campionamento dei liquidi (opzionale)
<ol><li>Tagliare tre lunghezze di 60 mm di tubi rigidi OD da 6,35 mm. Utilizzando una punta da trapano da 5 mm, praticare fori attraverso ciascun tappo di gomma. Spingere le lunghezze del tubo rigido attraverso il tappo.</li>
	<li>Tagliare tre lunghezze di 60 mm di tubi rigidi OD da 3,18 mm. Collegarli con un riduttore dritto al tubo sporgente sul lato inferiore di ciascun tappo.</li>
	<li>Inserire una valvola di arresto unidirezionale (ad esempio, porta 1 = Luer femmina, porta 2 = Luer maschio) nel tubo sporgente su ciascuna superficie del tappo (Figura 4A).</li>
	<li>Tagliare tre lunghezze di 30 mm di tubi flessibili OD da 3,18 mm. Inserire i raccordi Luer (ad esempio, Luer maschio per il barbo del tubo e Luer femmina per il barbo del tubo) su entrambe le estremità.</li>
	<li>Collegare i pezzi realizzati al punto 4.4 alle valvole del rubinetto sulla superficie di ciascun tappo di gomma (Figura 4A). NOTA: molte combinazioni di rubinetti e raccordi Luer possono produrre lo stesso risultato. Il disegno deve consentire di estrarre o inserire il liquido tramite una siringa.</li>
</ol>5. Collegamento di sensori di gas volumetrici
<ol><li>Preparare i sensori di gas secondo le istruzioni del produttore. NOTA: Ciò comporta principalmente il riempimento di sensori di gas con liquido di imballaggio (Figura 4B).</li>
	<li>Per realizzare le tubazioni del gas, tagliare tre lunghezze di 1000 mm di tubi flessibili OD da 3,18 mm.</li>
	<li>Praticare tre fori di diametro 4 mm nel tubo posteriore in PVC. Posizionare i fori accanto alla cerniera all'altezza del collo della bottiglia. Filettare le linee del gas attraverso questi fori (Figura 4A).</li>
	<li>Alla fine della linea del gas all'interno del tubo in PVC, aggiungere un raccordo Luer (ad esempio, il tubo flessibile a Luer maschio) e collegare una valvola di arresto unidirezionale (ad esempio, porta 1 = Luer femmina, porta 2 = Luer maschio). NOTA: la valvola è necessaria solo quando sono installate anche le porte di campionamento del liquido.</li>
	<li>Unire l'altra estremità della linea del gas alla porta di ingresso del sensore di gas utilizzando un riduttore dritto. Fissare questa connessione con una cravatta con zip.</li>
	<li>Collegare tutti i sensori di gas al modulo di ingresso digitale (DIM) con cavi jack plug e il DIM a un computer nelle vicinanze.</li>
	<li>Installare il software di acquisizione dati (vedere Tabella dei materiali) su un sistema operativo Windows e collegare il dongle della chiave di licenza. Aggiungere i file di calibrazione del sensore alla directory di calibrazione del software.</li>
</ol>6. Programmazione del regime di luce
<ol><li>Utilizzando l'interruttore on/off posteriore, accendere il PBR e collegare il controller di illuminazione DMX a un computer tramite un cavo micro-USB.</li>
	<li>Scarica Store Upgrade Tools (SUT) e il software di controllo LED (vedi Tabella dei materiali). Registrare il controller di illuminazione DMX online.</li>
	<li>Aprire il software di controllo LED e selezionare Fare clic qui per lavorare con l'interfaccia USB-DMX: SUSHI-RB-RJ.</li>
	<li>Nella scheda Configurazione della casella ScanLibrary selezionare la cartella Generica e il Canale singolo. Modificare le impostazioni di ScanLibrary in DMX universe 1, il numero di dispositivi in 4 e il numero di indice in 1. Nell'angolo in alto a destra, modificare la casella a discesa in Visualizzazione elenco. Infine, fare clic su Patch (Figura supplementare 1). NOTA: nell'universo DMX, una casella verifica il controllo di ciascuna striscia LED facendo scorrere i pulsanti del dimmer o inserendo un valore numerico nella casella di testo.</li>
	<li>Creare una curva standard che metta in relazione l'impostazione della luce digitale nel software di controllo dell'illuminazione con l'intensità luminosa sperimentata al centro del tubo in PVC (Figura 5). Misurare l'intensità della luce interna con una piccola sonda sferica (vedi Tabella dei Materiali) sospesa al centro del tubo in PVC.</li>
	<li>Passa alla scheda Editor . Per creare un programma di illuminazione personalizzato, crea una nuova scena e inizia ad aggiungere passaggi. Fare riferimento alla Tabella supplementare 1 per un esempio di programma diurno 16:8 h. Impostare la scena in loop. NOTA: i passaggi suddividono le scene in blocchi di tempo, ognuno dei quali può essere impostato su diversa intensità luminosa. I passi vanno da 1 s a 43 min. Qui, i passaggi di 30 minuti sono i più convenienti. È possibile caricare più scene su un dispositivo di controllo dell'illuminazione DMX.</li>
	<li>Crea una scena di supporto aggiuntiva che sia immediatamente riconoscibile, ad esempio due dei quattro LED accesi. NOTA: le scene possono essere ciclizzate manualmente utilizzando il pulsante sul lato del controller di illuminazione DMX. Se il programma di luce desiderato inizia durante la notte, sarà impossibile distinguere se il programma di luce è già iniziato. La scena dell'helper funge da indicatore del corretto funzionamento del controller di illuminazione DMX.</li>
	<li>Salva le scene e passa alla scheda Stand Alone . Scrivere la memoria del controller di illuminazione DMX e scollegare il dispositivo dal computer.</li>
	<li>Collegare il controller di illuminazione DMX alla sua fonte di alimentazione utilizzando una micro-USB.</li>
	<li>Prima di iniziare un esperimento, testare il programma di luce registrando l'intensità della luce interna per una durata di 24 ore. Se la temperatura del liquido è interessante, registrarla contemporaneamente a una sonda di temperatura sommersa (Figura 6).</li>
</ol>7. Avvio di un esperimento
<ol><li>Sterilizzare supporti, bottiglie, barre di agitazione, tappi di gomma, porte di campionamento, tappi a vite con apertura filettata e tubi. NOTA: tutti i componenti utilizzati in questo progetto sono autoclavabili ad eccezione delle valvole e dei raccordi Luer: esistono alternative autoclavabili di altri produttori.</li>
	<li>Aprire il software di acquisizione dati e compilare la pagina di configurazione (Figura supplementare 2). Assegnare i file di calibrazione ai rispettivi sensori.</li>
	<li>In Nome file directory selezionare la cartella del numero di porta DIM corrispondente. Fare clic su Cartella corrente e ripetere per tutte le porte.</li>
	<li>Fare clic su OK per passare alla pagina di registrazione.</li>
	<li>Riempire le bottiglie al volume desiderato con terreno di coltivazione (Tabelle supplementari 2,3). NOTA: Ognuna di queste bottiglie conterrà un massimo di ~ 1,1 L con un piccolo spazio per la testa (~ 80 ml, compresa la linea del gas).</li>
	<li>Centrifugare la coltura di riserva in tre tubi bilanciati da 50 ml per 15 minuti a 4500 x g per produrre tre pellet. Aggiungere un pellet a ogni bottiglia: lavare in pellet con una pipetta sierologica e un mezzo fresco. NOTA: la densità di coltura del giorno 0 è anche nota come concentrazione iniziale di biomassa (IBC). Per misurare l'IBC in gAFDW. L-1, un ulteriore tubo da 50 ml può essere centrifugato nel passaggio 7.6. Il pellet risultante può quindi essere essiccato e bruciato15,19. Il passaggio 7.6 richiederà probabilmente modifiche in base agli obiettivi individuali degli utenti e ai loro esperimenti.</li>
	<li>Lascia cadere un agitatore magnetico, 25 x 8 mm, in ogni bottiglia.</li>
	<li>Sigillare ogni apertura della bottiglia con un tappo di gomma e un tappo a vite ad apertura filettata (Figura 4A). Se sono installate porte di campionamento opzionali, chiudere le valvole.</li>
	<li>Individuare l'estremità di ogni linea del gas all'interno del tubo in PVC (costruito nel passaggio 5.4) e collegare un ago alla porta Luer maschio della valvola.</li>
	<li>Collegare ogni bottiglia al suo sensore di gas perforando ogni tappo di gomma con l'ago corrispondente.</li>
	<li>Avvia ogni sensore di gas singolarmente selezionando la casella di controllo sul lato sinistro dello schermo, facendo clic su Start e inserendo un nome di file. Fare clic su OK e ripetere per tutti i sensori (Figura supplementare 3). NOTA: durante la registrazione, non uscire dalla finestra di acquisizione dati. Impostare le impostazioni di alimentazione e sospensione del computer su mai e posticipare gli aggiornamenti del computer per la durata dell'esperimento.</li>
	<li>Accendere il PBR e assicurarsi che il controller di illuminazione DMX sia collegato a un alimentatore. La prima scena programmata inizierà automaticamente. Fare riferimento al passaggio 6.7 per verificare che il controller di illuminazione DMX funzioni correttamente.</li>
</ol>8. Campionamento della bottiglia (opzionale)
<ol><li>Preparare altri 500 mL del mezzo fresco prima di iniziare l'esperimento (tabella supplementare 2). NOTA: se alle 9 del mattino iniziasse un programma di luce di 24 ore con un ciclo diurno di 16:8 h, i tempi di campionamento prima del tramonto e dell'alba cadrebbero alle 8:00 e alle 16:00 (Tabella supplementare 1). Qui, l'alba e il tramonto si riferiscono a passi di 30 minuti che passano le luci da ON a OFF e viceversa.</li>
	<li>Chiudere la valvola sulla linea del gas.</li>
	<li>Collegare una siringa (10 mL) alla valvola della porta di campionamento (Figura 4A).</li>
	<li>Aprire la valvola della porta di campionamento e prelevare 8 ml di coltura. NOTA: si consiglia tra 5-10 ml. La rimozione del liquido genera un vuoto nello spazio di testa, rendendo difficili da estrarre volumi > 10 ml.</li>
	<li>Chiudere la valvola della porta di campionamento e scollegare la siringa.</li>
	<li>Collegare una siringa contenente 8 mL di mezzo fresco (dal punto 8.1) alla valvola della porta di campionamento.</li>
	<li>Aprire la valvola della porta di campionamento e iniettare il mezzo fresco. NOTA: la sostituzione del volume della coltura campionata con un mezzo fresco serve a mantenere un volume e una pressione uguali allo spazio di testa e a lavare la linea della porta di campionamento.</li>
	<li>Chiudere la valvola della porta di campionamento prima di scollegare la siringa.</li>
	<li>Ripetere i passaggi 8.2–8.8 ad ogni momento di campionamento.</li>
</ol>9. Terminare un esperimento
<ol><li>Seleziona tutte le caselle di controllo della porta attiva nella finestra di acquisizione dati e fai clic su Stop.</li>
	<li>Per esportare i dati, selezionare File e dati offline. Selezionare tutti i file di registro pertinenti. Esporta i dati in un software per fogli di calcolo e salva.</li>
	<li>Per ogni bottiglia, convertire il volume totale di ossigeno misurato in ml in talpe utilizzando la legge del gas ideale. Prevedere il peso della biomassa coltivata (gAFDW) se viene generata 1,05 mole di O2 per ogni mole di biomassa prodotta. Prendi il peso molare della biomassa come 24,6 g mol-1.</li>
	<li>Curare manualmente i dati della portata. Utilizzare unità di mL/h e una media mobile a 3 punti.</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

All'interno di questo protocollo, concentrarsi sui passaggi seguenti aumenta la probabilità di generare dati riproducibili e di alta qualità. Quando si costruisce il supporto del reattore (fase 1), la base deve essere robusta con supporti verticali ben allineati. L'acciaio a fessura ha spigoli vivi, quindi l'aggiunta di tappi di sicurezza è essenziale. Le superfici della piattaforma della bottiglia devono essere completamente piatte, l'agitatore magnetico e le teste dei bulloni devono entrambi trovarsi sotto la superficie dello strato superiore (passaggi 3.2-3.6). Secondo le istruzioni del produttore, il liquido di imballaggio del sensore di gas deve essere riempito con la "vite di tracciamento per il livello del liquido" per misurazioni accurate dell'ossigeno. Questo livello di liquido deve essere controllato regolarmente poiché l'evaporazione del liquido di imballaggio può cortocircuitare la cella di misurazione. Tutte e tre le tubazioni del gas realizzate nel punto 5.2 dovrebbero avere la stessa lunghezza; questo assicura che le repliche abbiano volumi di spazio di testa identici. Prima di iniziare un esperimento, è consigliabile testare il regime di luce programmata registrando l'intensità della luce su un periodo di 24 ore (passaggio 6.11). Se gli aumenti della temperatura del liquido destano preoccupazione, questo test dovrebbe includere anche una bottiglia sigillata con una sonda di temperatura interna (punto 6.11). Durante la registrazione, non uscire dalla finestra del software di acquisizione dati; questo terminerà la registrazione. Se si prelevano campioni di coltura, fare attenzione a non rilasciare gas dello spazio di testa aprendo le valvole nella sequenza sbagliata (passaggi 8.2-8.8). Durante la revisione dei dati sperimentali, si noti che il software di acquisizione dati genera automaticamente una media mobile della portata. Questo gonfia il valore di una o due letture di portata generate durante la notte. Curare manualmente i registri dei sensori di gas per correggere questo problema.
La battuta d'arresto più comune con questo metodo è il potenziale di cortocircuito del sensore di gas se il livello di imballaggio del liquido diminuisce. Ci sono due modi in cui questo può accadere. In primo luogo, l'evaporazione può ridurre lentamente il livello del liquido. Tuttavia, questo è improbabile in un esperimento a breve termine (<7 giorni)29. In secondo luogo, alti tassi di respirazione possono attirare ossigeno nella soluzione e generare uno spazio di testa sotto pressione. Quando l'energia luminosa non è disponibile, le microalghe utilizzano la respirazione aerobica per fornire l'energia necessaria per la manutenzione e la riparazione cellulare28. Quindi, nelle colture dense durante le ore non illuminate, il consumo di ossigeno e la conseguente sottopressione possono essere sostanziali. Questo aspira il liquido di imballaggio dai sensori di gas nella linea del gas. La distanza percorsa dal liquido di imballaggio è proporzionale alla quantità di respirazione notturna. Se il liquido di imballaggio entra nelle bottiglie, questo genera una chiazza d'olio sulla superficie del liquido.
Se sono previsti alti tassi di respirazione notturna, è possibile apportare modifiche al protocollo. Il modo più semplice per evitare la sottopressione è lasciare aperti gli spazi di testata della bottiglia durante la notte. Ciò ha anche il vantaggio di allentare i livelli di DO diminuendo la pressione parziale dello spazio di testa di O2. Si ritiene che alte concentrazioni di DO siano dannose per la crescita in quanto l'O2 può impedire l'attività di Rubisco e può innescare lo stress ossidativo30,31. Non è raro che le sospensioni di coltura raggiungano una sovrasaturazione 4x anche a contatto con l'atmosfera25,32. Per aprire lo spazio di testa, scollegare la linea del gas dall'ago che attraversa il tappo di gomma. Le ore notturne possono servire come finestra per rabboccare il liquido di imballaggio del sensore di gas o manipolare esperimenti continui con un impatto minimo sulla raccolta dei dati. Ad esempio, si può alterare la densità della coltura, aggiornare i nutrienti, aggiungere un emendamento o introdurre un agente patogeno. Le bombole devono essere richiuse e la linea del sensore di gas ricollegata prima che le luci si riaccendano. Le misurazioni dell'ossigeno raccolte da esperimenti con spazi di testa notturni chiusi rispetto a quelli aperti saranno diverse.
Quando le bottiglie rimangono sigillate, il consumo notturno di ossigeno riduce il numero di moli di O2 nello spazio di testa. Ciò fa sì che il liquido di imballaggio si insinui lungo la linea del sensore di gas per mantenere la pressione dello spazio di testa. Quando le luci si accendono, la produzione di ossigeno riprende. Il liquido di imballaggio deve essere reinserito nel sensore di gas prima che inizino le letture della portata. Questo ritardo è quindi proporzionale al grado di respirazione notturna. In questo modo, quando lo spazio di testa rimane chiuso, le letture O2 rappresentano la produzione netta di O2 (produzione fotosintetica - consumo respiratorio). Al contrario, quando lo spazio di testa è aperto di notte, il gas atmosferico sostituisce lo spazio di testa O2 consumato e nessun liquido di imballaggio entra nella linea del gas. Il risultato è che il consumo respiratorio di O2 non è contabilizzato nei dati di produzione di O2 . Ciò potrebbe ridurre l'accuratezza delle stime di crescita della biomassa AFDW. Tuttavia, non dovrebbe influire sull'utilità di utilizzare la produzione diurna di O2 come metrica per confrontare la crescita tra i trattamenti.
Tutti i PBR di laboratorio sono afflitti dalla stessa limitazione; le luci artificiali non possono replicare lo spettro solare. Le microalghe utilizzano lunghezze d'onda della luce tra 400-700 nm per la fotosintesi. Questa regione è indicata come radiazione fotosinteticamente attiva (PAR)33. La luce solare e la luce artificiale variano nel loro contributo relativo di lunghezze d'onda all'interno di questo intervallo. Questo, insieme a temperature favorevoli e una fornitura di luce costante, significa che i dati di crescita di laboratorio spesso non possono essere estrapolati in modo affidabile alle condizioni esterne. Questi PBR possono, tuttavia, affrontare uno dei limiti dell'alimentazione della luce PBR di laboratorio. L'intensità della luce solare è molto variabile durante il giorno, con la copertura nuvolosa che genera fluttuazioni transitorie nel PAR incidente. Il software di controllo dell'illuminazione e il controller di illuminazione DMX possono fornire intensità luminose da 0 a 2400 μmolfotoni m-2 s-1 e oltre. I regimi di luce possono essere suddivisi in incrementi individuali fino a 1 s. L'intensità della luce sintonizzabile consente all'utente di imitare i modelli di luce esterna più da vicino rispetto alle configurazioni PBR standard. Qui, gli intervalli simulati di 30 minuti all'alba e al tramonto svaniscono insieme i cicli giorno e notte (Tabella supplementare 1).
Sebbene la densità AFDW sia diventata la misura standard della crescita, questo metodo può richiedere volumi di coltura sostanziali, un periodo di elaborazione di 2-3 giorni e genera un punto dati alla volta. Inoltre, se le condizioni diventano sfavorevoli e le cellule muoiono, la densità AFDW non discrimina tra le cellule attivamente fotosintetizzanti e quelle che si stanno decomponendo. Quantificare il tasso di produzione di ossigeno fotosintetico serve come proxy di crescita alternativo. Questo design PBR può registrare continuamente la produzione di ossigeno con un piccolo intervento da parte dell'utente, preservando al contempo il volume della coltura. La risoluzione dei dati potrebbe essere migliorata selezionando un sensore di gas con un volume di cella di misura inferiore, ad esempio 1 mL. Inoltre, se le colture sono ben miscelate, gli utenti possono decidere di installare uno spettrofotometro per letture continue della densità ottica. Se si desidera il controllo della temperatura del mezzo, è possibile aggiungere un refrigeratore a ricircolo. Questi PBR sono una preziosa aggiunta a un laboratorio che cerca di espandere la sua capacità di ricerca microalgale senza ingenti investimenti finanziari. Sono particolarmente adatti a chi lavora con specie ad alta alcalinità e ad alto pH come la Spirulina. Questi PBR offrono flessibilità del regime di luce e sono validi per confronti di crescita rapidi, replicati e di laboratorio.

Microalghe e cianobatteri, collettivamente chiamati microalghe per semplicità, sono sostenuti per il loro potenziale nella biotecnologia sostenibile. Sono candidati interessanti per la loro rapida crescita, la capacità di essere coltivati su terreni non coltivabili e per il loro uso della luce solare per guidare la conversione dell'anidride carbonica in biomassa 1,2,3. La biomassa microalgale può essere convertita in prodotti come la bioenergia sotto forma di petrolio o gas, coloranti alimentari e integratori alimentari e materiali come i biopolimeri 1,4,5,6,7. Inoltre, possono essere utilizzati per trattare le acque reflue o bonificare i corpi idrici consumando nutrienti in eccesso 8,9. Detto questo, la ricerca microalgale è diffusa e consolidata. Il campo cresce man mano che la società riconsidera l'intensità di carbonio e la sostenibilità ambientale degli attuali approcci di produzione e generazione di energia.
Tre requisiti fondamentali degli studi di microalgali basati su laboratorio sono un vaso di coltura, una fonte di luce e un metodo per quantificare la crescita. Il termine fotobioreattore (PBR) descrive un set-up in cui i vasi di coltura sono illuminati10. Comunemente, gli studi sulle microalghe mirano a confrontare la crescita tra due o più trattamenti, ad esempio diversi mezzi di crescita, regimi di luce o specie 11,12,13. Per rilevanza statistica, ogni condizione, ad esempio il trattamento e il controllo, deve essere replicata. Se il controllo e il trattamento vengono eseguiti contemporaneamente, ciò significa che molti PBR devono essere monitorati e campionati per la durata di un esperimento. La sfida con il funzionamento di più PBR è duplice. In primo luogo, fornire un'intensità luminosa uniforme a ciascun PBR è essenziale per la riproducibilità, ma può essere difficile. La quantità di luce incidente sulla superficie del recipiente è influenzata dalla sua distanza dalla sorgente luminosa, dall'ombreggiatura dai vasi adiacenti e dalle fluttuazioni della luce di fondo14. In secondo luogo, è necessario selezionare un metodo per quantificare con precisione la crescita.
La crescita è comunemente misurata dal conteggio cellulare, dalla densità ottica (OD), dal contenuto di clorofilla A, dalla densità di peso secco (DW) e dalla densità di peso secco senza ceneri (AFDW)15. Il conteggio delle cellule, il contenuto di clorofilla A e i metodi gravimetrici sono processi manuali che producono punti dati discreti. L'OD può essere misurato in modo continuo e non invasivo con uno spettrofotometro, a condizione che sia ben calibrato rispetto a un altro metodo come la densità AFDW15. Tuttavia, le misurazioni OD e il contenuto di clorofilla A possono essere inaffidabili in quanto i risultati variano in diverse condizioni di coltura, ad esempio tra le specie e durante tutto il ciclodi crescita 15,16. Per la clorofilla A, il metodo di estrazione può anche influire sulla resa del pigmento17. Il contenuto di clorofilla A è particolarmente utile per tracciare la crescita delle microalghe all'interno di comunità microbiche che contengono anche organismi non fotosintetici17,18. Quando si sceglie un metodo per determinare la crescita, è essenziale considerare la morfologia della sospensione. Quando gli organismi si aggregano e non sono ben miscelati, la conta OD e cellulare non è possibile15. Un singolo metodo non è adatto a tutte le applicazioni sperimentali: i ricercatori devono decidere quali metodi sono pratici e rilevanti per i loro obiettivi sperimentali.
AFDW è un metodo affidabile che consente confronti di crescita tra varie condizioni di coltura, in particolare, tra specie e terreni di coltura 15,19,20. Per calcolare l'AFDW, un campione di coltura microalgale viene prima concentrato, mediante filtrazione o centrifugazione, ed essiccato. In questa fase, è possibile determinare il DW. Di solito, il campione DW contiene almeno l'8-10% di materiale inorganico di cenere come sali e particolato15. DW tiene traccia delle tendenze di crescita, ma può essere distorto se il contributo degli inorganici varia. Per determinare la densità AFDW, la biomassa secca viene bruciata ad alta temperatura; questo vaporizza la porzione organica o utile lasciando cenere (inorganica) dietro19. Per calcolare l'AFDW, il peso della frazione di cenere viene sottratto da quello della frazione DW. Tipicamente, nelle sospensioni microalgali, l'AFDW varia da 0,1 a 3 g / L 12,21,22. Piccoli volumi di sospensioni diluite producono poca biomassa secca, <10 mg. Dopo la combustione, la cenere può pesare solo 1 mg. Pertanto, a seconda della densità di coltura, questo metodo richiede volumi compresi tra 5-100 ml e scale analitiche accurate a 0,1 mg 12,15,19,22. I PBR di laboratorio sono in genere piccoli, un paio di litri al massimo, quindi ogni campione liquido esaurisce il volume di coltura. Inoltre, il metodo AFDW è manuale e richiede 2-3 giorni. Per gli esperimenti replicati e ripetitivi, è preferibile un processo automatizzato e continuo.
Per le microalghe che utilizzano il bicarbonato come fonte di carbonio, due metriche di crescita aggiuntive possono essere misurate continuamente. La fotosintesi consuma bicarbonato e produce ossigeno. Il consumo di bicarbonato aumenta il pH medio23. Una sonda di pH immersa può misurare questo cambiamento. La produzione di ossigeno fotosintetico aumenta la concentrazione di ossigeno disciolto (DO) del mezzo fino a quando il mezzo non è saturo. Oltre la saturazione, l'ossigeno esiste come bolle. La produzione di ossigeno viene misurata con molte tecniche diverse: le sonde misurano la concentrazione di DO, i dispositivi manometrici valutano la pressione dello spazio di testa, la gascromatografia misura la composizione dello spazio di testa e i sensori volumetrici registrano il deflusso di gas 24,25,26,27. Quando l'ossigeno viene utilizzato come proxy di crescita, i vasi di coltura devono essere completamente sigillati o consentire solo il deflusso di gas. Per le misurazioni del pH e dell'ossigeno, il carbonio deve essere fornito sotto forma di bicarbonato, non mediante sparging di CO2. Lo sparging di CO2 riduce il pHmedio 23 e, come gas, può disturbare le misurazioni dell'ossigeno. Un vantaggio del pH e dell'ossigeno rispetto alla densità ottica è che il metodo non è compromesso se le microalghe formano grumi. Sebbene indiretti, sia il pH che l'ossigeno sono efficaci nel confrontare la crescita tra i trattamenti.
I PBR in uso oggi variano in complessità. I laboratori possono utilizzare semplici palloni da banco, prototipi personalizzati o prodotti disponibili in commercio. Per i gruppi di ricerca che cercano di aggiornare dai palloni, il costo dei PBR commerciali o le competenze tecniche e la fabbricazione di parti necessarie per costruire molti prototipi possono essere una barriera. Questo manoscritto mira a descrivere la progettazione, la costruzione e il funzionamento passo-passo dei PBR di laboratorio che colmano questa lacuna. Questi PBR hanno un regime di luce personalizzabile e monitorano continuamente la crescita registrando la produzione volumetrica di ossigeno. Questo progetto ospita tre vasi di coltura per la replica triplicata e può essere costruito con moderata abilità e materiali facilmente accessibili. Questo PBR è una preziosa aggiunta a un laboratorio che cerca di espandere la sua capacità di ricerca microalgale senza investire in prodotti molto tecnici o costosi. Quando scelgono di acquisire o costruire un PBR, i ricercatori devono considerare l'idoneità di un progetto alle loro condizioni culturali, alla posizione finanziaria e alle domande di ricerca.

<table><tbody><tr><td>Canali in alluminio Imperial: 0,90" x 39,37" Metric: 2,3 cm x 100 cm Quantità: 4</td><td>LED World</td><td>AC-AR1-1M</td><td>Richiesto come dissipatore di calore</td></tr><tr><td>Corde elastiche, small Quantità: 5</td><td>-</td><td>-</td><td>Per fissare le bottiglie</td></tr><tr><td>Computer - desktop/laptop Quantità: 1</td><td></td> <td>---</td><td></td></tr> <tr><td>Registratore di dati, stazione meteorologica USB HOBO U30 Quantity: 1</td><td>HOBO, Hoskin</td><td>U30-NRC-VIA-10-S100-000</td><td>Registra le informazioni sul sensore di luce</td></tr><tr><td>Modulo di interfaccia digitale, Rigamo, 4 canali Quantità: 1</td><td>Ritter</td><td>N / A</td><td>Questo serve a trasmettere i dati del sensore di gas al computer</td></tr><tr><td>Decoder DMX, 12~24 VDC, DMX-CV-4X5A Quantità: 1</td><td>LITECH, LED World</td><td>LT-840-6A</td><td>Trasmette messaggi che alterano il modello di luce</td></tr><tr><td>Controller di illuminazione DMX, SUSHI-RB-RJ Quantità: 1</td><td>Arcolis, Nicolaudie America Inc.</td><td>SUSHI-RB-RJ DMX</td><td>Codifica il programma di illuminazione</td></tr><tr><td>Liquido di imballaggio del sensore di gas (Silox) Quantità</forte>: 1 L</td><td>Ritter</td><td>https://www.ritter.de/en/data-sheets/silox</td><td></td></tr><tr><td>Sensore di gas, volumetrico <forte>Quantità</forte>: 3</td><td>Ritter</td><td>MGC-1 V3.4 PMMA (https://www.ritter.de/downloads/mgc-milligascounter-en)</td><td>Misura la produzione di ossigeno</td></tr><tr><td>Bottiglie di vetro, rotonde 1 L con collo GL45 Quantità: 3</td><td>Corning, Capitol Scientific</td><td>1395-1L</td><td>Recipienti per colture</td></tr><tr><td>Hardware - tappi terminali per acciaio scanalato Quantità: 10</td><td>Paulin, Home Depot</td><td>142-612</td><td>Per coprire gli spigoli vivi dell'acciaio scanalato</td></tr><tr><td>Hardware - ganci a occhiello Quantità: 6</td> <td>-</td><td></td> <td>Per fissare le bottiglie</td></tr><tr><td>Hardware - bretelle angolari in metallo (grandi) Imperial: 4 "x 4 " Metric: 10 cm x 10 cm Quantity: 8</td> <td>-</td><td></td> <td>Staffe più grandi per costruire un supporto</td></tr> <tr><td>in metalloFerramenta - bretelle angolari in metallo (piccole) Imperial: 2 1/2" x 2 1/2" Metric: 6,4 cm x 6,4 cm Quantità: 6</td><td>-</td><td>-</td><td>Staffe piccole per collegare le piattaforme delle bottiglie al tubo in PVC</td></tr><tr><td>Ferramenta - soffietti angolari in metallo Imperial: 3" x 3" Metrico: 7,6 cm x 7,6 cm Quantità: 6</td><td>Paulin, Home Depot</td><td>142-616</td><td>Staffe piatte per costruire il supporto in metallo</td></tr><tr><td>Ferramenta - cerniera per pianoforte Imperial: 36" Metric: 91 cm Quantità: 1</td><td>-</td><td>-</td><td>Collega due metà del tubo in PVC</td></tr><tr><td>Hardware - rivetti Quantità: 40</td><td>-</td><td>-</td><td>Per fissare la cerniera del pianoforte al tubo in PVC</td></tr><tr><td>Hardware - set di bulloni, dadi, rondelle Quantità: 60</td><td>-</td><td>-</td><td>Sono necessari bulloni lunghi e sottili per fissare le piattaforme delle bottiglie attorno agli agitatori magentic</td></tr><tr><td>Hardware - set di bulloni, dadi, rondelle Quantità: 30</td><td>-</td><td>-</td><td>Sono necessari bulloni più corti più grandi per costruire il driver LED del supporto in metallo</td></tr><tr><td>, tensione costante, 96W 24VDC Driver IP65 omologato UL Alimentatore regolato di classe 2 Quantità: 1</td><td>Magnitude Lighting, LED World</td><td>CVN96L24DC</td><td>Regola l'alimentazione delle luci</td></tr><tr><td>Luci a LED, Cinco Bright LED Flex Strip Quantità: rotolo da 4 m</td><td>EvenBright, LED World</td><td>FA128M57-4M-24V-X</td><td>Il rotolo è tagliato in 4 lunghezze da 1 m e fissato all'interno del tubo in PVC</td></tr><tr><td>Esposimetro, portatile con sonda sferica sommergibile Quantità: 1</td><td>LI-COR</td><td>LA-250A</td><td>Calibrare l'intensità luminosa dei reattori</td></tr><tr><td>Sensori di luce Luce fotosintetica (PAR) Smart Sensor Quantity: 2</td><td>HOBO, Hoskin</td><td>S-LIA-M003</td><td>Ne è richiesto solo uno, tuttavia due sarebbero una buona pratica in caso di malfunzionamento</td></tr><tr><td>Agitatori magnetici (MIXdrive 1 XS) con unità di controllo esterne e alimentazione (MIXcontrol eco) Quantity: 3</td><td>2Mag, 2MAG USA</td><td>MF 40300</td><td>Gli agitatori si trovano inseriti in piattaforme per bottiglie</td></tr><tr><td>Piastra metallica Imperial: 24" x 8" Metric: 61 cm x 20,3 cm Quantità: 1</td><td>-</td><td>-</td><td>Questa è una superficie su cui fissare l'elettronica, è attaccato alla parte posteriore del reattore</td></tr><tr><td>Tubo, bianco PVC Imperial: 6" diametro x 42" di altezza Metrico: 15,2 cm x 106,7 cm Quantità: 1</td><td>-</td><td>-</td><td>Tagliato longitudinalmente in due metà, utilizzato per alloggiare luci e bottiglie</td></tr><tr><td>Fogli di plastica (HDPE Imperial: 4" x 4" x 1/4" Metric: 10 cm x 10 cm x 1 cm Quantità: 6</td><td>Inventables</td><td>30291-01</td><td>Per piattaforme di bottiglie che ospitano agitatori magentici</td></tr><tr><td>Tappi in gomma - GL45 size Quantità</forte>: 3</td><td>Duran, VWR</td><td>76289-760</td><td>Sigilla i recipienti di coltura</td></tr><tr><td>Tappi a vite - con apertura e collo GL45 <forte>Quantità</forte>: 3</td><td>Corning, Capitol Scientific</td><td>1395-45HTSC</td><td>Genera la tenuta dei recipienti di coltura</td></tr><tr><td>Lunghezze angolari scanalate in acciaio <forte>Imperiale</forte>: 1-1/2" X 48" x 0,074" <forte>Metrico</forte>: 3,8 cm x 122 cm x 0,19 cm Quantità: 6</td><td>Paulin, Home Depot</td><td>142-202</td><td>Costituisce il corpo del supporto in</td></tr><tr><td>metallo Lunghezze in acciaio piatto scanalato Imperial: 1-3/8" x 48" x 0,074" Metric: 3,5 cm x 122 cm x 0,19 cm Quantità: 3</td><td>Paulin, Home Depot</td><td>142-222</td><td>Costituisce il corpo del supporto in metallo</td></tr><tr><td>Software - Easy Stand Alone (ESA)</td><td></td><td>https://www.dmxsoft.com/#apps</td><td>AKA Software di controllo LED</td></tr><tr><td>Software - Rigamo v3.1</td><td></td><td></td><td>AKA Software di acquisizione dati</td></tr><tr><td>Software - Strumenti di aggiornamento dello storage (SUT)</td><td></td><td>https://store.dmxsoft.com//</td><td></td></tr> <tr><td>Stir bar Imperial: 1" x 5/16" Metric: 2,5 cm x 0,8 cm Quantità: 3</td><td>Fisherbrand</td><td>14-513-59</td><td>Mescola la coltura</td></tr><tr><td>Cambia la scatola Quantità: 1</td><td>-</td><td>-</td><td>Accende/spegne il reattore</td></tr><tr><td>Siringa, 10 mL Quantità</forte>: Multiplo</td><td>-</td><td>-</td><td>Opzionale se si desidera estrarre la coltura</td></tr><tr><td>Raccordi dell'adattatore per provette, plastica - Rubinetto 1-way Quantità</forte>: 6</td><td>Masterflex, Cole Palmer</td><td>RK-12023-33</td><td>Chiudere/aprire la linea</td></tr> <tr><td>di recipienti per coltureRaccordi adattatori per tubi, in plastica - varietà di raccordi luer lock maschio e femmina Imperial: per tubi con diametro interno da 1/16" e 1/8 Metric: per tubi da 1,59 mm e 3,18 mm Quantità: Pacchetti multipli</td><td>Masterflex, Cole Palmer</td><td>RK-30800-16; RK-30800-18; RK-45518-26; RK-45501-00; RK-45501-04</td><td>Molte combinazioni diverse possono ottenere lo stesso risultato finale, meglio ordinare una varietà di raccordi</td></tr><tr><td>Raccordi adattatori per tubi, plastica - varietà di connettori diritti Imperial: per adattarsi a tubi ID da 1/16" e 1/8" Metric: per adattarsi a tubi da 1,59 mm e 3,18 mm Quantità: Pacchetti multipli</td><td>Masterflex, Cole Palmer</td><td>RK-40616-04</td><td>Molte combinazioni diverse possono ottenere lo stesso risultato finale, meglio ordinare una varietà di raccordi</td></tr><tr><td>Tubi, flessibili, trasparenti Imperial: ID=1/16", OD=1/8" Metric: ID = 1,59 mm, 0D = 3,18 mm Quantità: 4 m</td><td>Masterflex, Cole Palmer</td><td>RK-06422-02</td><td>Linea dal recipiente di coltura al sensore di gas</td></tr><tr><td>Tubi, flessibili, trasparenti Imperial: ID=1/8", OD=1/4" Metric: ID = 3,18 mm, 0D = 6,35 mm Quantità: 2 m</td><td>Masterflex, Cole Palmer</td><td>RK-06422-05</td><td>Sensore di gas dimensioni standard del tubo</td></tr><tr><td>Tubo, rigido, trasparente Imperial: ID=1/16", OD=1/8" Metric: ID = 1,59 mm, 0D = 3,18 mm Quantità: 1 m</td><td>Masterflex, Cole Palmer</td><td>RK-06605-27</td><td>Tappi in gomma che consentono l'uscita del gas</td></tr><tr><td>Tubi, rigidi, trasparenti Imperial: ID=1/8", OD=1/4" Metric: ID = 3,18 mm, 0D = 6,35 mm Quantità: 1 m</td><td>Masterflex, Cole Palmer</td><td>RK-06605-30</td><td>Tappo in gomma che consente l'uscita del gas</td></tr><tr><td>Fascette, small Quantity: 1 pacchetto</td><td></td><td></td><td>Raccordi per tubi sicuri</td></tr></tbody></table>

funzionamento di fotobioreattori da laboratorio con misurazioni di crescita online e regimi di luce personalizzabili

Operation of Laboratory Photobioreactors with Online Growth Measurements and Customizable Light Regimes

Lo studio di laboratorio delle microalghe può essere sperimentalmente impegnativo. Oltre ai requisiti di coltivazione di microrganismi non fotosintetici, i fototrofi richiedono anche l'illuminazione. Di routine, i ricercatori cercano di fornire forniture di luce personalizzate, cioè variare l'intensità della luce e il tempo in cui viene consegnata. Tale flessibilità è difficile con le luci da banco standard. Di solito, gli studi di coltivazione richiedono anche confronti di crescita tra trattamenti sperimentali. Spesso, la crescita viene valutata per una durata prolungata, ad esempio, più volte al giorno per una prova di una settimana. Le misurazioni manuali possono richiedere molto tempo e non avere risoluzione dei dati. Pertanto, i fotobioreattori (PBR) con monitoraggio automatico della crescita e alimentazione della luce personalizzabile sono utili per esperimenti replicati con trattamenti multipli. Il lavoro attuale presenta la progettazione, la costruzione e il funzionamento dei PBR di laboratorio. I materiali sono facilmente reperibili e relativamente economici. Il design potrebbe essere duplicato con moderata abilità. Ogni struttura ha un'impronta di ~ 40 cm2 e ospita tre bottiglie di vetro da 1 L per la replica triplicata. Le bottiglie poggiano su piattaforme contenenti agitatori magnetici e sono disposte verticalmente all'interno di un tubo di cloruro di polivinile (PVC) alto 1 m e diametro 15 cm. L'interno del tubo è rivestito con diodi emettitori di luce (LED). Questi LED producono intensità luminose continue da fotoni 0-2400 μmol m-2 s-1 di radiazione fotosinteticamente attiva (PAR). Gli utenti progettano un programma di illuminazione personalizzato. L'intensità della luce può essere regolata ogni secondo o mantenuta costante per periodi più lunghi. L'ossigeno prodotto dalla fotosintesi esce da ogni bottiglia tramite un sensore di gas volumetrico unidirezionale. Il software viene utilizzato per registrare i dati del sensore di gas. La quantità di ossigeno prodotta può essere correlata alla crescita della biomassa. Se sono necessari campioni di biomassa, è possibile utilizzare una siringa per estrarre la coltura. Il metodo è adatto per le microalghe coltivate con bicarbonato come fonte di carbonio. Questi PBR sono preziosi per un laboratorio che richiede esperimenti replicati, flessibilità del regime di luce e dati di crescita continui ad alta risoluzione.

Questa pubblicazione descrive la progettazione di fotobioreattori da laboratorio (PBR) con regimi di luce personalizzabili. La crescita di cianobatteri o microalghe, utilizzando il bicarbonato come fonte di carbonio, viene monitorata continuamente misurando la produzione volumetrica di ossigeno. Questi PBR facilitano confronti di crescita di laboratorio rapidi e replicati con un piccolo intervento dell'utente durante gli esperimenti.

Funzionamento di fotobioreattori da laboratorio con misurazioni di crescita online e regimi di luce personalizzabili

The laboratory study of microalgae can be experimentally challenging. In addition to the cultivation requirements of non-photosynthetic microorganisms, ...

Questo protocollo consente esperimenti di microalghe replicati con poco input da parte dell'utente. È progettato per i ricercatori che desiderano passare da boccette monitorate manualmente a boccette da banco senza acquistare bioreattori fotografici commerciali tecnici e costosi. Questo bioreattore fotografico consente il rapporto di luce e la flessibilità, il monitoraggio continuo della crescita e la replicazione triplice.Per iniziare, apri il software di acquisizione dati. Compilare la pagina di configurazione e assegnare i file di calibrazione ai rispettivi sensori. Sotto il nome del file di directory, selezionare la cartella corrispondente del numero di porta del modulo di input digitale.Fare clic sulla cartella corrente e ripetere l'operazione per tutte le porte. Quindi fare clic su OK per passare alla pagina di registrazione. Quindi, riempire le bottiglie di vetro al volume desiderato con il terreno di coltura e centrifugare la coltura stock in tre tubi bilanciati da 50 millilitri per ottenere tre pellet.Aggiungere un pellet a ciascun flacone utilizzando una pipetta sierologica e un terreno fresco. Quindi rilasciare un agitatore magnetico da 25 per otto millimetri in ciascuna bottiglia prima di sigillare l'apertura della bottiglia con un tappo di gomma e un tappo a vite filettato ad apertura. Se sono installate porte di campionamento opzionali, chiudere le valvole.Dopo aver individuato l'estremità di ciascuna linea del gas all'interno del tubo in PVC, collegare un ago alla porta di richiamo della posta della valvola. Collegare ogni bombola al suo sensore di gas perforando ogni tappo di gomma con l'ago corrispondente. Quindi, avvia ciascun sensore di gas singolarmente selezionando la casella di controllo sul lato sinistro dello schermo, facendo clic su Start e inserendo un nome file.Fare clic su OK e ripetere l'operazione per tutti i sensori. Quindi, accendere il fotoreattore bio e assicurarsi che il controller di illuminazione multiplex digitale sia collegato a un alimentatore. Utilizzando il pulsante sul controller multiplex digitale, passare dalla scena di supporto alla scena di luce personalizzata per garantire che il dispositivo funzioni correttamente.Per il campionamento delle bottiglie, preparare altri 500 millilitri di terreno fresco prima di iniziare l'esperimento. Per raccogliere il campione, chiudere la valvola sulla linea del gas e collegare una siringa da 10 millilitri alla valvola della porta di campionamento. Dopo aver collegato la siringa, aprire la valvola della porta di campionamento e prelevare otto millilitri di coltura.Quindi chiudere la valvola della porta di campionamento e scollegare la siringa. Quindi, collegare una siringa contenente otto millilitri di mezzo fresco alla valvola della porta di campionamento. Quindi aprire la valvola e iniettare il mezzo fresco.Infine, chiudere la valvola della porta di campionamento e scollegare la siringa. Per esportare i dati, selezionare file e dati offline. Dopo aver selezionato tutti i file di registro pertinenti, esportare i dati nel software del foglio di calcolo e salvarli.Un esperimento di successo è caratterizzato da un modello diurno strettamente replicato di produzione di ossigeno. La portata dell'ossigeno funge da proxy per il tasso di crescita di una coltura. Durante le ore illuminate, la produzione di gas aumenta costantemente e durante le ore non illuminate, la produzione di gas si ferma.Il volume totale di ossigeno prodotto in quattro giorni variava da 316 millilitri nel trattamento A a 902 millilitri nel trattamento C.In il regime di luce di 300 micro mole per metro quadrato al secondo, la temperatura aumentava di un massimo di 1,4 gradi Celsius durante il giorno. Le temperature di coltura sono tornate al basale durante la notte. Nonostante le diverse concentrazioni iniziali di biomassa, i trattamenti B e C hanno generato la stessa quantità di biomassa totale causando identici spostamenti nel pH medio.I dati online sulla portata di ossigeno hanno rivelato che ogni trattamento aveva tassi di crescita giornalieri variabili, che si riflettevano anche nelle misurazioni del pH due volte al giorno. Il primo giorno, il tasso di crescita del trattamento B era inferiore a quello del trattamento C.Mentre al terzo giorno, i tassi di crescita del trattamento B hanno superato quelli del trattamento C.I dati sulla velocità di flusso dell'ossigeno hanno indicato che la crescita più elevata si è verificata il terzo giorno nel trattamento B.Le stime di crescita basate sull'ossigeno totale misurato dovrebbero sottostimare leggermente la crescita della biomassa, che era valida per cinque esempi su sette. Due esempi hanno sovrastimato la crescita.Questo potrebbe essere stato influenzato dagli esperimenti determinati alla fine della notte. La respirazione notturna sostanziale aumenta il consumo di ossigeno, genera un vuoto spaziale della testa della bottiglia, aspirando la confezione con il liquido dai sensori di gas. Se la respirazione può essere alta, apriamo lo spazio della testa durante la notte.

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JoVE Journal

Biology

Biologia

Fonte: Hemmerich, J., et al. Protocollo per l'ottimizzazione della produzione di proteine eterologhe utilizzando la tecnologia automatizzata dei microbioreattori. J. Vis. Esp. (2017).Questo video dimostra l'uso di un microbioretore automatizzato per monitorare la crescita batterica e la secrezione di proteine fluorescenti in risposta a diverse formulazioni di mezzi. Un batterio geneticamente modificato che esprime una proteina fluorescente secretoria viene coltivato sotto selezione antibiotica...

Monitoraggio della crescita batterica in formulazioni di mezzi distinti con un microbioreattore automatizzato

In questo protocollo viene introdotta la fabbricazione, l'impostazione e il funzionamento di base di un bioreattore microfluidico picolitro (PLBR) per l'analisi di singole cellule di microrganismi procarioti. I microrganismi rilevanti a livello industriale sono stati analizzati come prova di principio che consente di comprendere il tasso di crescita, la morfologia e l'eterogeneità fenotipica in determinati periodi di tempo, difficilmente possibili con i metodi convenzionali.

Bioreattore microfluidico picolitro per l'analisi microbica di singole cellule: fabbricazione, configurazione del sistema e funzionamento

Gas di combustione delle centrali elettriche è una conveniente fonte di CO 2 per la crescita delle alghe. Abbiamo costruito "dei fumi delle alghe coltivazione" prototipo dei sistemi e descritto come scalare il processo di coltivazione algale. Abbiamo dimostrato l'utilizzo di un modello bio-reazione di trasferimento di massa per simulare e progettare il funzionamento ottimale del gas di combustione per la crescita di Chlorella sp. in alghe foto-bioreattori.

Ottimizzare le impostazioni dei gas di scarico per promuovere la crescita di microalghe in fotobioreattori tramite simulazioni al computer

L'integrazione della coltivazione di microalghe con i gas di combustione industriali introdurrà infine metalli pesanti e altri composti inorganici nei mezzi di crescita. Questo studio presenta una procedura utilizzata per determinare il destino finale e l'impatto dei metalli pesanti e dei contaminanti inorganici sulla crescita di Nannochloropsis salina coltivata in fotobioreattori.

Quantificazione dei metalli pesanti e altri contaminanti inorganici sulla produttività delle microalghe

Abbiamo progettato una apparecchiatura per le colture in continuo per l'uso con i sistemi optogenetic per illuminare le culture di microbi e regolarmente celle di immagine negli effluenti con un microscopio invertito. La coltura, il campionamento, l'imaging, e l'analisi delle immagini sono completamente automatizzati in modo che le risposte dinamiche a illuminazione possono essere misurati per diversi giorni.

Progettazione e Realizzazione di un Illuminating automatizzato, Coltura, e di campionamento per microbica optogenetic Applicazioni

Questo documento descrive il processo di assemblaggio e il funzionamento di un bioreattore fotosintetico su scala a banco che può essere utilizzato, in combinazione con altri metodi, per stimare i parametri di crescita cinetici pertinenti. Questo sistema controlla costantemente il pH, la luce e la temperatura utilizzando sensori, un'unità di acquisizione e controllo di dati e un software di acquisizione dati open-source.

Costruzione e messa a punto di un biotestattore fotosintetico di alghe a bilanciere a banco con monitoraggio della temperatura, della luce e del pH per test di crescita cinetica

Questo manoscritto descrive un approccio generico per la progettazione su misura di media di coltura microbica. Questa opzione è attivata da un flusso di lavoro iterativo che unisce Kriging sperimentale design e microbioreactor tecnologia per una velocità effettiva coltivazione sufficiente, che è supportata da robotica lab per aumentare affidabilità e velocità nella gestione dei mezzi liquidi preparazione.

Protocollo generico per l'ottimizzazione della produzione di proteine eterologhe utilizzando tecnologia automatizzata di Microbioreactor

Qui, presentiamo un protocollo per costruire su scala di laboratorio bolla colonna fotobioreattori e li usa per cultura microalghe. Esso fornisce inoltre un metodo per la determinazione del tasso di crescita della cultura e del contenuto di lipidi neutri.

Coltivazione di microalghe verdi in bolla colonna fotobioreattori e un saggio di lipidi neutri

La coltivazione ascia su scala bench facilita la caratterizzazione delle microalghe e l'ottimizzazione della produttività prima della successiva scalabilità del processo. I fotobioreattori forniscono il controllo necessario per esperimenti di microalghe affidabili e riproducibili e possono essere adattati per coltivare in modo sicuro le microalghe con i gas corrosivi (CO2, SO2, NO2) dalle emissioni di combustione municipale o industriale.

Coltivazione di microalghe e quantificazione della biomassa in un fotoreattore in scala di panca con gas di scarico corrosivo

Il controllo optogenetico del metabolismo microbico offre un controllo dinamico flessibile sui processi di fermentazione. Il protocollo qui mostra come impostare fermentazioni regolate dalla luce blu per la produzione chimica e proteica a diverse scale volumetriche.

Fermentazioni a controllo leggero per la produzione chimica microbica e proteica

Impara a progettare fotobioreattori da laboratorio per microalghe con monitoraggio continuo dell'ossigeno e regimi luminosi personalizzabili. Questo protocollo riduce l'intervento manuale e ottimizza la coltivazione.

Funzionamento di fotobioreattori da laboratorio con misurazioni di crescita online e regimi di luce personalizzabili

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