Name: Determinazione della respirazione mitocondriale e della glicolisi in campioni di tessuto retinico Ex Vivo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-04T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 45 s
Description: Impara a misurare la respirazione mitocondriale e la glicolisi in tessuto retinico ex vivo di topo. Questo protocollo utilizza sensori fluorescenti per analizzare il metabolismo energetico retinico in tempo reale.

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Questo lavoro è supportato dal programma di ricerca intramurale del National Eye Institute (ZIAEY000450 e ZIAEY000546).

Tutti i protocolli del topo sono stati approvati dall'Animal Care and Use Committee del National Eye Institute (NEI ASP# 650). I topi sono stati alloggiati in condizioni di luce-buio di 12 ore e curati seguendo le raccomandazioni della Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio, l'Istituto delle risorse animali da laboratorio e la politica del servizio sanitario pubblico sulla cura umana e l'uso degli animali da laboratorio.
1. Cartuccia del sensore idratante e preparazione del mezzo di saggio
<ol><li>Il giorno prima dell'esperimento, aggiungere 1 mL del mezzo di calibrazione a ciascun pozzetto della piastra di utilità. Posizionare il coperchio Hydro-Booster sulla parte superiore e abbassare la cartuccia del sensore attraverso l'apertura sul coperchio. Verificare che il sensore sia immerso nel mezzo di calibrazione. Incubare la cartuccia del sensore durante la notte in un incubatore privo di CO2 a 37 °C per attivare i fluorofori. NOTA: per evitare l'evaporazione, l'incubatore viene umidificato mantenendo un vassoio d'acqua all'interno e la cassetta della cartuccia del sensore viene avvolta con un involucro di plastica trasparente.</li>
	<li>Preparare il mezzo di analisi ricostituendo il mezzo DMEM di cavalluccio marino con l'aggiunta di glucosio, piruvato e glutammina alle concentrazioni desiderate. Nei saggi riportati in questo articolo, la concentrazione finale dei substrati nel mezzo di saggio è: 6 mM di glucosio, 0,12 mM di piruvato e 0,5 mM di glutammina. Per ogni piastra di analisi, 40 ml del mezzo di saggio vengono preparati freschi il giorno dell'esperimento.</li>
	<li>Impostare il programma di analisi nell'analizzatore seguendo le istruzioni del produttore26. Nel test qui dimostrato, il protocollo è impostato come segue: 5 cicli di misurazioni per la linea di base, quindi iniettare la porta A, seguita da 4 cicli di misurazioni, quindi iniettare la porta B e seguita da 4 cicli di misurazioni. Ogni ciclo è composto da mix (3 min), attesa (2 min) e misura (3 min).</li>
</ol>2. Rivestimento di inserti a rete di micropiastra di cattura isolotto
<ol><li>Preparare la miscela di rivestimento combinando 20 μL del mezzo di attacco cellulare (ad esempio, Cell-Tak) con 171 μL di bicarbonato di sodio 0,1 M e 9 μL di 1 M NaOH.</li>
	<li>Aprire il coperchio della cassetta contenente inserti a rete. Pipetta 8 μL della miscela di rivestimento per ogni inserto di rete. Utilizzare una punta della pipetta per spalmare / distribuire delicatamente la goccia intorno per distribuire equamente la miscela di rivestimento in tutto l'inserto a rete.</li>
	<li>Chiudere la cassetta e lasciare incubare gli inserti a rete a temperatura ambiente per almeno 25 minuti per adsorbimento.</li>
	<li>Lavare l'inserto a rete pipettando 4 mL del mezzo di dosaggio direttamente sugli inserti a rete. Agitare delicatamente la cassetta per assicurarsi che tutti gli inserti in rete vengano lavati con il mezzo di analisi.</li>
	<li>Tenere da parte l'inserto in mesh. È pronto all'uso.</li>
</ol>3. Preparazione dei composti per iniezione
<ol><li>Estrarre aliquote di riserva di Bam15 (10 mM), Rotenone (10 mM), Antimicina A (10 mM) e 2-DG (500 mM) da congelatore -80 °C e scongelare a temperatura ambiente. NOTA: lo stock 2-DG è pronto per l'uso. Gli altri farmaci devono essere diluiti in scorte di lavoro.</li>
	<li>Riscaldare 10 mL del mezzo di saggio a bagnomaria a 37 °C.</li>
	<li>Diluire 10 mM Bam15 stock a 50 μM di stock di lavoro utilizzando una procedura di diluizione in due fasi: mescolare 20 μL di 10 mM stock con 20 μL di DMSO per ottenere 5 mM di stock intermedio. Quindi mescolare 10 μL del materiale intermedio sopra di 5 mM con 990 μL di mezzo di saggio preriscaldato per ottenere lo stock di lavoro finale di 50 μM.</li>
	<li>Diluire e combinare 10 mM Rotenone e 10 mM Antimycin A stock a 10 μM Rotenone/Antimycin A (Rot/AA) stock di lavoro con due fasi di diluizioni: mescolare 10 μL ciascuno di 10 mM Rotenone e 10 mM Antimycin A stock con 80 μL di DMSO per ottenere 1 mM Rot/AA stock intermedio. Quindi mescolare 10 μL del materiale intermedio di cui sopra 1 mM con 990 μL di mezzo di saggio preriscaldato per ottenere lo stock finale di rot/AA da 10 μM.</li>
	<li>Preparare al momento le scorte di lavoro sopra menzionate di composti di iniezione il giorno dell'esperimento e metterle da parte a temperatura ambiente fino al caricamento nelle porte di iniezione della cartuccia del sensore.</li>
</ol>4. Dissezione retinica e preparazione del punch retinico
<ol><li>Eutanasia di un topo mediante asfissia di CO2 seguendo le linee guida AVMA sull'eutanasia27. NOTA: Non lasciare l'animale in una camera di CO2 più a lungo del tempo necessario per l'eutanasia.</li>
	<li>Enucleare gli occhi e metterli in un tampone PBS 1x vecchio di ghiaccio in una capsula di Petri e poi metterlo sotto un microscopio di dissezione.</li>
	<li>Rimuovere con cura, tagliando con microscissori, i muscoli retti extra attaccati all'esterno del bulbo oculare e tagliare il nervo ottico.</li>
	<li>Utilizzare un ago da 30 G per perforare un foro sul bordo della cornea (limbus); questo funge da sito di inserimento per i microscissori. Quindi, utilizzare un microscissore a dissezione fine per effettuare un taglio circolare lungo il bordo della cornea, separandolo dal padiglione oculare posteriore.</li>
	<li>Usa una pinza di dissezione affilata per rimuovere la cornea, la lente e l'umore vitreo lontano dalla coppa dell'occhio.</li>
	<li>Utilizzare microscissori a dissezione fine per effettuare diversi piccoli tagli sullo strato sclerale sul bordo della coppa oculare. Evitare di tagliare lo strato di retina. Utilizzare due pinze di dissezione affilate per trattenere il tessuto sclerale su ciascun lato del taglio e tirare con molta attenzione lo strato sclerale per rimuoverlo dalla retina neurale. Ripeti questo intorno alla coppa dell'occhio fino a quando tutta la sclera viene rimossa e si ottiene una coppa retinica intatta.</li>
	<li>Utilizzare microscissori di dissezione e fare tagli radiali sulla tazza retinica per appiattirla e generare diverse sezioni distinte. NOTA: A seconda delle capacità di dissezione della persona e dell'esperienza nella gestione del tessuto retinico fresco, la tazza retinica può essere tagliata per generare da 3 a 5 sezioni distinte.</li>
	<li>Utilizzare un perforatore per biopsia di 1 mm di diametro per tagliare un disco retinico da ciascuna sezione della tazza retinica appiattita. NOTA: Bisogna fare attenzione a ottenere i dischi retinici perforati a uguale distanza dalla testa del nervo ottico.</li>
	<li>Utilizzare una pinza per trasferire gli inserti in rete preverniciati nella capsula di Petri di dissezione. Con l'aiuto di due pennelli per ciglia superfini, posizionare il disco di punzonatura retinica sull'inserto a rete. Il disco di punzonatura retinica è posto al centro dell'inserto della rete con lo strato di cellule gangliari rivolto verso il basso che tocca la rete e lo strato di fotorecettore rivolto verso l'alto. NOTA: Spesso, alcune cellule RPE rimangono attaccate ai fotorecettori e la pigmentazione di queste cellule può essere utilizzata come indicatore dell'orientamento del disco di perforazione retinica.</li>
</ol>5. Caricamento delle porte di iniezione della cartuccia del sensore e calibrazione
<ol><li>Estrarre la cassetta della cartuccia del sensore idratata dall'incubatore a 37 °C. Rimuovere il coperchio Hydro-Booster e riposizionare la cartuccia del sensore sulla piastra di servizio.</li>
	<li>Caricare il volume desiderato di soluzioni di stock di lavoro composto per iniezione in porte appropriate. Tenere la punta della pipetta con un angolo di 45 °. Inserire la punta della pipetta a metà strada in una porta di iniezione con la smussatura della punta contro la parete opposta della porta di iniezione e caricare delicatamente il composto in ciascuna porta. Evitare di introdurre bolle d'aria.</li>
	<li>Fare riferimento alla guida per l'utente dello strumento per il volume del composto caricato in ciascuna porta di iniezione per un test specifico. Negli esperimenti presentati in questo articolo, 68 μL di 50 μM Bam15 (per il saggio di stress mitocondriale) o 68 μL di 10 μM Rot/AA di stock di lavoro (per il saggio della velocità glicolitica) vengono caricati nella porta A; 75 μL di 10 μM rot/AA (per il saggio di stress mitocondriale) o 75 μL di 500 mM di stock di lavoro 2-DG (per il saggio della velocità glicolitica) vengono caricati nella porta B.</li>
	<li>Porte di iniezione del carico di tutti i pozzetti della piastra, compresi i pozzetti di correzione di fondo e i pozzetti vuoti per garantire una corretta iniezione. Caricare la rispettiva soluzione composta in ogni porta per i pozzetti di correzione dello sfondo. Il mezzo di saggio può essere sostituito, invece della soluzione composta, in ciascuna delle porte dei pozzi bancari.</li>
	<li>Posizionare la piastra della cartuccia del sensore caricata, con il coperchio spento, nella macchina dell'analizzatore per avviare la calibrazione prima dell'esecuzione del test. Al termine della calibrazione, il programma si fermerà automaticamente, in attesa della sostituzione della piastra di utilità con la piastra di cattura dell'isolotto contenente punzoni retinici.</li>
</ol>6. Caricamento della piastra di cattura dell'isolotto e avvio dell'esecuzione del test
<ol><li>Aggiungere 607 μL del mezzo di analisi a ciascun pozzetto della piastra di cattura dell'isolotto</li>
	<li>Utilizzare una pinza per afferrare il bordo dell'inserto a rete contenente dischi di punzonatura retinica sulla parte superiore ed estrarlo dalla capsula di Petri. Picchiettare leggermente il fondo dell'inserto a rete su un tessuto assorbente per rimuovere il liquido extra e metterlo nel pozzetto della piastra di cattura dell'isolotto. Ripetere questo passaggio fino a quando tutti gli inserti a rete con punzoni retinici vengono inseriti nella piastra di cattura dell'isolotto. Riempire i pozzetti di correzione dello sfondo e i pozzetti vuoti con inserti mesh vuoti.</li>
	<li>Utilizzare due pinze Graefe per premere con attenzione e delicatezza il bordo di ciascun inserto in mesh e assicurarsi che questi siano inseriti saldamente nella parte inferiore della piastra di cattura dell'isolotto.</li>
	<li>Posizionare la piastra di cattura dell'isolotto caricata in un incubatore a 37 °C per 5 minuti per riscaldarsi.</li>
	<li>Espellere la piastra di utilità al termine della calibrazione e sostituirla con una e sostituirla con la piastra di cattura dell'isolotto, con coperchio spento, contenente punzoni retinici.</li>
	<li>Riprendere l'esecuzione del test.</li>
</ol>7. Esegui la terminazione e l'archiviazione dei dati
<ol><li>Al termine dell'esecuzione, espellere la cartuccia del sensore e la piastra di cattura dell'isolotto contenente punzoni retinici. I dati vengono salvati automaticamente come file .asyr.</li>
	<li>Utilizzare il software di analisi dei dati associato per visualizzare e analizzare i dati seguendo la guida per l'utente del produttore26.</li>
	<li>Utilizzare la funzione Esporta per esportare il file .xslx dei dati, che può essere visualizzato e analizzato utilizzando un software per fogli di calcolo.</li>
</ol>8. Salvataggio del campione di punzonatura retinica
<ol><li>Dopo il test, estrarre la piastra dalla macchina, rimuovere la cartuccia del sensore e rimuovere delicatamente il mezzo di dosaggio da ciascun pozzetto utilizzando una pipetta.</li>
	<li>Applicare nuovamente il coperchio e sigillare i lati della piastra con la striscia di parafilm.</li>
	<li>Conservare a -80 °C.</li>
	<li>Per la normalizzazione, quantificare il DNA totale o il contenuto proteico del pugno in ciascun pozzetto.</li>
</ol>9. Analisi dei dati
<ol><li>Test dello stress mitocondriale NOTA: il valore OCR misurato (totalOCR) rappresenta il consumo totale di ossigeno da parte del tessuto. Dopo l'iniezione di Bam15 (uncoupler), l'OCR aumenta dal livello basale (totalOCRbasal) al livello massimo (totalOCRmax) e diminuisce dopo l'iniezione di Rot/AA. Il valore residuo di OCR dopo iniezione di Rot/AA (totalOCRRot/AA) rappresenta il consumo di ossigeno non mitocondriale.<ol>
<li>Calcola il consumo di ossigeno correlato ai mitocondri come: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62914/62914eq01.jpg"> (Eq. 1) 28 anni
</li>
		<li>Calcola la capacità di riserva mitocondriale (MRC) come: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/62914/62914eq2v4.png"> (Eq. 2) 29 anni NOTA: L'ultima lettura tra le 5 misurazioni prima dell'iniezione di Bam15 viene presa come valore "basale" (per totalOCRbasal e mitoOCRbasal). La lettura più alta tra le 4 misurazioni successive all'iniezione di Bam15 viene utilizzata come valore "max" (per totalOCRmax e mitoOCRmax). La lettura più bassa tra le 4 misurazioni successive all'iniezione di Rot/AA viene utilizzata come totalOCRRot/AA.</li>
	</ol></li>
	<li>Saggio della velocità glicolitica NOTA: Il valore ECAR misurato (totalECAR) rappresenta l'acidificazione totale del mezzo da parte dell'attività metabolica del tessuto. In generale, l'acidificazione del microambiente extracellulare risulta principalmente per estrusione del prodotto glicolitico, il lattato. Il catabolismo dei substrati nel ciclo TCA mitocondriale determina la produzione di CO2, che acidifica anche il mezzo extracellulare attraverso l'idratazione a bicarbonato.<ol>
<li>Substract mitochondrial ha contribuito all'acidificazione media (mitoECAR) da totalECAR per ottenere il glycoECAR. <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/62914/62914eq03.jpg"> (Eq. 3) 28 anni NOTA: La respirazione mitocondriale e il ciclo TCA sono processi fortemente accoppiati. La produzione di CO2 dai mitocondri è una funzione del tasso di OXPHOS, che è misurabile da mitoOCR.</li>
		<li>Calcola il mitoECAR come: <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/62914/62914eq04.jpg"> (Eq. 4) 28 anni dove, il CCF (CO2 Contribution Factor) è un valore di rapporto calcolato empiricamente, che rappresenta la quantità di contributo H+ da acidificazione mediata da CO2 rispetto a ciascun consumo di O2 da OXPHOS. Il CCF per questo sistema è predeterminato a 0,6028. La misurazione accurata dell'acidificazione del mezzo è determinata dalla capacità tampone del mezzo, dalla sensibilità del sensore di pH dello strumento e dall'effettiva capacità della camera di misura. Qui, il BF (Buffer Factor) è un parametro della capacità tampone sperimentale in situ, che rappresenta la quantità di H + o OH- aggiunta alla camera di misurazione efficace per modificare il livello di pH di 1 unità. Quando si utilizza un mezzo di saggio personalizzato, il BF può essere determinato titolando quantità note di acido nel mezzo di analisi seguendo il protocollo Buffer Factor30. Il Seahorse DMEM medium pH 7.4 utilizzato in questo protocollo ha un BF predeterminato di 2.60 mmol H+/L/pH. La piastra di cattura dell'isolotto utilizzata in questo protocollo ha una Volmicrochamber = 16,6 μL31. Il fattore di scala del volume, Kvol, è una costante determinata empiricamente. Il valore di Kvol non è disponibile per la piastra di cattura dell'isolotto, ma può essere calcolato dal valore della micropiastra28, tenendo conto della differenza di volume nelle loro microcamere, a 0,41. NOTA: l'iniezione di Rot/AA arresta la respirazione mitocondriale e costringe il tessuto a passare alla glicolisi per la produzione di ATP, portando a una maggiore estrusione di lattato e ad un aumento della misurazione ECAR. La glicolisi viene interrotta con l'iniezione di 2-DG e la misurazione ECAR residua rivela acidificazione non glicolitica e non mitocondriale del mezzo.</li>
		<li>Calcola la capacità di riserva glicolitica (GRC) come: <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/62914/62914eq05.jpg"> (Eq. 5) 32 anni dove, l'ultima lettura tra le 5 misurazioni prima dell'iniezione di Rot/AA viene presa come valore "basale" (glicoECARbasal). La lettura più alta tra le 4 misurazioni successive all'iniezione di Rot/AA viene utilizzata come valore "max" (glycoECARmax). La lettura più bassa tra le 4 misurazioni successive all'iniezione di 2-DG viene utilizzata come glycoECAR2-DG.</li>
	</ol></li>
	<li>Normalizzazione NOTA: La normalizzazione è essenziale quando si confrontano le letture dei tessuti retinici di diverse fasce d'età o tra campioni wild-type e patologici/degenerativi, che potrebbero differire nel numero di cellule.<ol>
<li>Utilizzare kit disponibili commercialmente per valutare il contenuto di DNA in ciascun disco di punzonatura retinica33,34.</li>
		<li>In alternativa, utilizzare il tampone del saggio di radioimmunoprecipitazione (tampone RIPA) per estrarre la proteina totale dal pugno retinico e utilizzare il contenuto proteico per la normalizzazione. NOTA: La superficie di una retina di topo adulto è stata precedentemente determinata intorno ai 20 mm2 e ogni retina contiene circa 6,5 milioni di cellule35. Quindi, ogni punzone retinico di 1 mm di diametro è ~ 1/25 di una singola retina e contiene ~ 260K cellule. Si può fare riferimento a questi numeri quando si confrontano i dati di un pugno retinico con quelli di altri campioni di tessuto o cellule coltivate,</li>
	</ol></li>
</ol>

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<li>Joyal, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+lipid+and+glucose+metabolism+dictates+angiogenesis+through+the+lipid+sensor+Ffar1%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Retinal lipid and glucose metabolism dictates angiogenesis through the lipid sensor Ffar1.</a> Nature Medicine. 22 (4), 439-445 (2016).</li>
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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Di seguito sono fornite istruzioni dettagliate per l'esecuzione di saggi basati su micropiastre della respirazione mitocondriale e dell'attività di glicolisi utilizzando dischi di perforazione retinica ex vivo appena sezionati. Il protocollo è stato ottimizzato per: 1) garantire l'utilizzo di un mezzo di saggio idoneo per il tessuto retinico ex vivo; 2) impiegare dischi di punzonatura retinica di dimensioni adeguate per ottenere letture OCR ed ECAR che rientrano nel campo di rilevamento ottimale della m...

I mitocondri sono organelli essenziali che regolano il metabolismo cellulare, la segnalazione, l'omeostasi e l'apoptosi coordinando molteplici processi fisiologici cruciali1. I mitocondri fungono da centrale elettrica nella cellula per generare adenosina trifosfato (ATP) attraverso la fosforilazione ossidativa (OXPHOS) e fornire energia che supporta quasi tutti gli eventi cellulari. La maggior parte dell'ossigeno cellulare viene metabolizzato nei mitocondri, dove funge da accettore finale di elettroni nella catena di trasporto degli elettroni (ETC) durante la respirazione aerobica. Basse quantità di ATP possono anche essere prodotte dalla glicolisi nel citosol, dove il glucosio viene convertito in piruvato, che può essere ulteriormente convertito in lattato o trasportato nei mitocondri e ossidato in acetil-CoA, un substrato nel ciclo dell'acido tricarbossilico (ciclo TCA).
La retina è uno dei tessuti metabolicamente più attivi nei mammiferi2, che mostra alti livelli di respirazione mitocondriale e un consumo di ossigeno estremamente elevato3. I fotorecettori a bastoncello e cono contengono un'alta densità di mitocondri4 e OXPHOS genera la maggior parte dell'ATP nella retina5. Inoltre, la retina si basa fortemente sulla glicolisi aerobica6,7 convertendo il glucosio in lattato5. I difetti mitocondriali sono associati a varie malattie neurodegenerative8,9; e con le sue elevate richieste energetiche uniche, la retina è particolarmente vulnerabile ai difetti metabolici, compresi quelli che colpiscono OXPHOS4 mitocondriale e glicolisi10. La disfunzione mitocondriale e i difetti della glicolisi sono implicati nelle malattie degenerative della retina11,12 e macular13, nella degenerazione maculare legata all'età10,14,15,16 e nella retinopatia diabetica17,18. Pertanto, misurazioni accurate della respirazione mitocondriale e della glicolisi possono fornire parametri importanti per valutare l'integrità e la salute della retina.
La respirazione mitocondriale può essere misurata attraverso la determinazione del tasso di consumo di ossigeno (OCR). Dato che la conversione del glucosio in piruvato e successivamente in lattato provoca l'estrusione di protoni e l'acidificazione dell'ambiente extracellulare, le misurazioni del tasso di acidificazione extracellulare (ECAR) forniscono un'indicazione del flusso di glicolisi. Poiché la retina è composta da più tipi di cellule con relazioni intime e sinergia attiva, incluso lo scambio di substrati6, è imperativo analizzare la funzione mitocondriale e il metabolismo nel contesto dell'intero tessuto retinico con laminazione e circuiti intatti. Negli ultimi decenni, gli elettrodi O2 di tipo Clark e altri microelettrodi di ossigeno sono stati utilizzati per misurare il consumo di ossigeno nella retina19,20,21. Questi elettrodi di ossigeno hanno importanti limitazioni nella sensibilità, nella necessità di un grande volume di campione e nella necessità di un'agitazione continua del campione sospeso, che di solito porta alla rottura del contesto cellulare e tissutale. Il protocollo qui descritto è stato sviluppato utilizzando una tecnica di fluorescenza basata su micropiastre per misurare il metabolismo energetico mitocondriale nel tessuto retinico di topo ex vivo appena sezionato. Consente misurazioni in tempo reale a medio rendimento di OCR ed ECAR contemporaneamente utilizzando un piccolo campione (punzone da 1 mm) di tessuto retinico ex vivo, evitando la necessità di sospensione e agitazione continua.
Qui è dimostrata la procedura sperimentale per il test dello stress mitocondriale e il test della velocità glicolitica su dischi di punzonatura retinica appena sezionati. Questo protocollo consente la misurazione delle attività metaboliche correlate ai mitocondri in un contesto tissutale ex vivo. A differenza dei saggi eseguiti utilizzando cellule in coltura, le letture qui ottenute riflettono il metabolismo energetico combinato a livello tissutale e sono influenzate dalle interazioni tra i diversi tipi di cellule all'interno del tessuto. Il protocollo è stato modificato da una versione precedentemente pubblicata22,23 per adattarsi alla nuova generazione dell'analizzatore a flusso extracellulare a 24 pozzetti Agilent Seahorse (XFe24) con piastra Islet Capture. Anche il mezzo di dosaggio, le concentrazioni del composto di iniezione e il numero/durata dei cicli di analisi sono stati ottimizzati per il tessuto retinico. Viene fornito un protocollo dettagliato passo-passo per la preparazione dei dischi di punzonatura retinica. Ulteriori informazioni sulla configurazione del programma e sull'analisi dei dati possono essere ottenute dalla guida per l'utente del produttore24,25,26.

<table><tbody><tr><td>1X PBS</td><td>Thermo Fisher</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>2-Deossiglucosio (2-DG), 500 mM di soluzione madre</td><td>Sigma</td><td>D6134</td><td>Sciogliere in cavalluccio marino XF DMEM medium, preparare in anticipo</td></tr><tr><td>ago calibro 30</td><td>BD Precision Glide</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>Antimicina A, 10 mM di soluzione madre</td><td>Sigma</td><td>A8674</td><td>Sciogliere in DMSO, preparare in anticipo</td></tr><tr><td>Bam15, 10 mM stock soluzione</td><td>TimTec</td><td>ST056388</td><td>Dissolvere in DMSO, preparare in anticipo</td></tr><tr><td>Perforatore per biopsia, 1 mm</td><td>Integra Miltex</td><td>33-31AA</td><td></td></tr><tr><td>Cell-Tak</td><td>Corning Life Sciences</td><td>CB40240</td><td></td></tr><tr><td>Camera</td><td></td><td></td><td></td>per asfissia di CO2</tr><tr><td>Pinze per dissezione-Dumont #5</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-10</td> Dissezione <td>con punta dritta</td></tr><tr><td> pinze-Dumont #7</td><td>Fine Science Tools</td><td>11274-20</td><td>Microscopio</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td>da<td>dissezione</td></tr> a punta curva <tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2438</td><td></td></tr><tr><td>Pinza Graefe</td><td>Fine Science Tools</td><td>11051-10</td> Microforbici <td>a punta curva e seghettata</td></tr><tr><td></td><td>Fine Science Tools</td><td>15004-08</td> Soluzione NaOH <td>a punta curva</td></tr><tr><td>, 1 M</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8263</td><td>Soluzione acquosa, preparare in anticipo</td></tr><tr><td>Rotenone, 10 mM soluzione madre</td><td>Sigma</td><td>R8875</td><td>Sciogliere in DMSO, preparare in anticipo il mezzo di</td></tr><tr><td>calibrazione del cavalluccio marino</td><td>Agilent</td><td>100840-000</td><td></td></tr><tr><td>Cavalluccio marino XF 1,0 M glucosio</td><td>Agilent</td><td>103577-100</td><td></td></tr><tr><td>Cavalluccio marino XF 100 mM piruvato</td><td>Agilent</td><td>103578-100</td><td></td></tr><tr><td>Cavalluccio marino XF 200 mM glutammina</td><td>Agilent</td><td>103579-100</td><td></td></tr><tr><td>Cavalluccio marino XF DMEM medio</td><td>Agilent</td><td>103575-100</td><td>pH 7,4, con 5 mM HEPES</td></tr><tr><td>Cavalluccio marino XFe24 Cattura isolotti FluxPak</td><td>Agilent</td><td>103518-100</td><td>Contiene cartuccia sensore e micropiastra per cattura isolotti</td></tr><tr><td>Cavalluccio marino XFe24, Analizzatore di flusso cellulare extra</td><td>Agilent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di bicarbonato di sodio, 0,1 M</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td>Soluzione acquosa, preparare in anticipo</td></tr><tr><td>Pennello per ciglia superfine</td><td>Ted Pella</td><td>113</td><td></td></tr></tbody></table>

determinazione della respirazione mitocondriale e della glicolisi in campioni di tessuto retinico ex vivo

Determination of Mitochondrial Respiration and Glycolysis in Ex Vivo Retinal Tissue Samples

La respirazione mitocondriale è una via critica che genera energia in tutte le cellule, in particolare i fotorecettori della retina che possiedono un metabolismo altamente attivo. Inoltre, i fotorecettori mostrano anche un'elevata glicolisi aerobica come le cellule tumorali. Misurazioni precise di queste attività metaboliche possono fornire preziose informazioni sull'omeostasi cellulare in condizioni fisiologiche e negli stati patologici. Sono stati sviluppati saggi basati su micropiastre ad alto rendimento per misurare la respirazione mitocondriale e varie attività metaboliche nelle cellule vive. Tuttavia, la stragrande maggioranza di questi sono sviluppati per cellule in coltura e non sono stati ottimizzati per campioni di tessuto intatto e per l'applicazione ex vivo. Qui è descritto un protocollo dettagliato passo-passo, che utilizza la tecnologia di fluorescenza basata su micropiastre, per misurare direttamente il tasso di consumo di ossigeno (OCR) come indicatore della respirazione mitocondriale, nonché il tasso di acidificazione extracellulare (ECAR) come indicatore di glicolisi, nel tessuto retinico ex vivo intatto. Questo metodo è stato utilizzato per valutare con successo le attività metaboliche nella retina del topo adulto e dimostrare la sua applicazione nello studio dei meccanismi cellulari dell'invecchiamento e della malattia.

I dati riportati qui sono un test rappresentativo dello stress mitocondriale che mostra tracce OCR (Figura 1) e test della velocità glicolitica che mostra traccia OCR e traccia ECAR (Figura 2), che sono stati eseguiti utilizzando dischi perforati retinici da 1 mm appena sezionati da topi transgenici Nrl-L-EGFP di 4 mesi ( sfondo C57B / L6). Questi topi esprimono GFP specificamente nei fotorecettori a bastoncello senza alterare il...

Qui è descritto un protocollo dettagliato per l'esecuzione del test dello stress mitocondriale e del test della velocità glicolitica in campioni di tessuto retinico ex vivo utilizzando un bioanalizzatore commerciale.

Determinazione della respirazione mitocondriale e della glicolisi in campioni di tessuto retinico Ex Vivo

Mitochondrial respiration is a critical energy-generating pathway in all cells, especially retinal photoreceptors that possess a highly active metabolism. ...

Questo protocollo fornisce l'analisi in tempo reale di due principali vie bioenergetiche: la respirazione mitocondriale e la glicolisi in tessuti retinici di topo ex vivo appena sezionati. L'analisi tradizionale del cavalluccio marino si è concentrata sulle cellule monostrato in coltura, mentre questo protocollo consente ai ricercatori di studiare l'attività mitocondriale nei tessuti appena sezionati, in particolare la retina. Questa tecnica viene utilizzata per studiare le attività dei mitocondri e le bandiere di glicolisi nelle retine di modelli murini di degenerazione retinica ereditaria.È uno strumento utile per la ricerca retinica e ha anche il potenziale per essere applicato ad altri tipi di tessuto per sviluppare potenziali terapie. La parte più difficile di questo protocollo è ottenere dischi di punch di qualità dalla retina del topo appena sezionata, quindi si raccomanda che l'individuo che eseguirà questa tecnica abbia buone capacità di dissezione retinica. Il giorno prima dell'esperimento, aprire la cassetta della cartuccia del sensore e aggiungere un millilitro di mezzo di calibrazione a ciascun pozzetto della piastra di utilità.Incubare durante la notte in un incubatore privo di anidride carbonica a 37 gradi Celsius per attivare i fluorofori. Il giorno dell'esperimento, preparare il mezzo di saggio in farmaci composti diluiti da stock. Riscaldare il mezzo di analisi nel bagno d'acqua a 37 gradi Celsius.Impostare il programma di analisi sulla macchina come descritto nel manoscritto di testo. Aprire il coperchio della cassetta contenente inserti a rete. Pipettare otto microlitri della miscela di rivestimento per ogni inserto a rete, quindi utilizzare una punta di pipetta per distribuire delicatamente la goccia intorno per distribuire equamente la miscela di rivestimento in tutto l'inserto a rete.Chiudere la cassetta e lasciare incubare gli inserti in rete a temperatura ambiente per almeno 25 minuti per l'assorbimento. Dopo l'incubazione, lavare gli inserti a rete pipettando quattro millilitri del mezzo di saggio direttamente sugli inserti. Agitare delicatamente la cassetta per assicurarsi che tutti gli inserti in rete vengano lavati con il mezzo di analisi.Per preparare il punch retinico, enucleare gli occhi da un topo adulto eutanasizzato e metterli in PBS ghiacciato in una capsula di Petri, quindi posizionare la capsula di Petri sotto un microscopio di dissezione. Utilizzando microscissori, tagliare il nervo ottico, quindi rimuovere con cura i muscoli extraretti attaccati all'esterno del bulbo oculare. Usando un ago calibro 30, perforare un foro sul bordo della cornea.Quindi utilizzare microscissori di dissezione fine per effettuare un taglio circolare lungo il bordo della cornea. Usando una pinza di dissezione affilata, rimuovere la cornea, la lente e l'umore vitreo dalla coppa dell'occhio. Fare diversi piccoli tagli sullo strato sclerale sul bordo della coppa dell'occhio usando microscissori di dissezione fine.Utilizzare due pinze di dissezione affilate per trattenere il tessuto sclerale su ciascun lato e tirare lo strato sclerale con molta attenzione per rimuoverlo dalla retina neurale. Ripeti questo intorno alla coppa dell'occhio fino a quando tutta la sclera viene rimossa e si ottiene una coppa retinica intatta. Effettuare tagli radiali sulla tazza retinica per appiattirla e generare diverse sezioni distinte utilizzando microscissori di dissezione.Successivamente, utilizzando un punzonatore per biopsia di un millimetro di diametro, tagliare un disco retinico da ciascuna sezione della tazza retinica appiattita. Punzonatura a una distanza uguale dalla testa del nervo ottico. Trasferire gli inserti in rete preverniciati nella piastra di Petri di dissezione usando una pinza.Con l'aiuto di due pennelli per ciglia super fini, posizionare il disco di punzonatura retinica al centro dell'inserto a rete con lo strato di cellule gangliari lato verso il basso toccando la rete e lo strato di fotorecettore rivolto verso l'alto. Per caricare la cartuccia del sensore, estrarre la cassetta della cartuccia del sensore idratata dall'incubatore a 37 gradi Celsius. Dopo aver rimosso il coperchio dell'idro booster, riposizionare la cartuccia del sensore sulla piastra di utilità.Caricare il volume desiderato di soluzioni composte di iniezione nelle porte appropriate tenendo la punta della pipetta con un angolo di 45 gradi, inserendo la punta della pipetta a metà strada in una porta di iniezione con la smussatura della punta contro la parete opposta della porta di iniezione. Caricare delicatamente il composto in ogni porta. Caricare la cartuccia del sensore nella macchina per la calibrazione facendo clic sul pulsante Avvia esecuzione per aprire il vassoio della macchina.Inserire la cartuccia del sensore nella macchina e fare clic sul pulsante Sono pronto per avviare la calibrazione. Caricare il volume desiderato del mezzo di analisi in ciascun pozzetto della piastra di cattura dell'isolotto. Usando la pinza, afferrare il bordo dell'inserto a rete contenente dischi di punzonatura retinica ed estrarlo dalla capsula di Petri.Picchiettare leggermente il fondo dell'inserto a rete su un tessuto assorbente per rimuovere il liquido extra e metterlo nel pozzetto della piastra di cattura dell'isolotto. Ripetere questo passaggio fino a quando tutti gli inserti mesh con punzoni retinici vengono inseriti nella piastra di cattura dell'isolotto riempiendo i pozzetti di correzione dello sfondo e i pozzetti vuoti con inserti a rete vuoti. Utilizzando due pinze Graefe, premere il bordo di ciascun inserto a rete con attenzione e delicatezza, assicurandosi che questi siano inseriti saldamente nella parte inferiore della piastra di cattura dell'isolotto.Posizionare la piastra di cattura dell'isolotto caricata in un incubatore a 37 gradi Celsius per cinque minuti per riscaldarsi, quindi espellere la piastra di utilità al termine della calibrazione. Sostituirlo con la piastra di cattura dell'isolotto contenente punzoni retinici e riprendere l'esecuzione del test facendo clic sul pulsante della piastra della cella di carico. Al termine dell'esecuzione, espellere la cartuccia del sensore e la piastra di acquisizione dell'isolotto contenente punzoni retinici facendo clic sul pulsante di espulsione, quindi fare clic sul pulsante Fatto in modo che i dati vengano salvati automaticamente come file ASYR e lo schermo cambi automaticamente per visualizzare i risultati.Il test dello stress mitocondriale che mostra una traccia OCR e un test della velocità glicolitica che mostra sia la traccia OCR che la traccia ECAR sono stati eseguiti utilizzando dischi perforati retinici da un millimetro appena sezionati. Nel test dello stress mitocondriale, Bam15 è stato iniettato per disaccoppiare il gradiente protonico dalla produzione di ATP mitocondriale, con conseguente aumento dell'OCR al massimo livello. Rotenone e antimicina A sono stati iniettati per inibire la respirazione dei mitocondri rispettivamente nel complesso uno e nel complesso tre, con conseguente calo dell'OCR al livello minimo.La differenza tra il livello massimo di OCR e l'ultima misurazione del livello di OCR basale riflette la capacità di riserva mitocondriale. Nel test della velocità glicolitica, l'iniezione di rotenone e antimicina A arresta la respirazione mitocondriale e spinge la glicolisi più in alto. La glicolisi viene colta iniettando 2-deossi-d-glucosio, che compete con il glucosio per il legame con l'esochinasi, causando la caduta dell'ECAR al livello minimo.La differenza tra il livello massimo di glico ECAR nell'ultima misura del livello basale di glico ECAR riflette la capacità di riserva di glicolisi. Per produrre dati affidabili, è fondamentale ottenere una buona qualità dei dischi di punzonatura retinica e limitare il tempo totale di dissezione entro 1,5 ore. Seguendo l'esperimento, si può quantificare il DNA del contenuto proteico di un disco retinico in un pozzo e usarlo per normalizzare i dati del cavalluccio marino.Quindi questo protocollo è stato utilizzato per studiare lo sviluppo, l'invecchiamento e la malattia nella retina. È stata anche analizzata la preferenza tissutale o la dipendenza da diversi substrati di carburante come glucosio o acidi grassi.

determination-mitochondrial-respiration-glycolysis-ex-vivo-retinal

Research

Ricerca

JoVE Journal

Neuroscience

Neuroscienze

Sono descritti metodi per la biopsia di vasto laterale, la preparazione dei mitocondri purificati, e profilatura respirometrico. L'uso di piccolo volume muscolare rende questa tecnica adatta per applicazioni di ricerca clinica.

Preparazione e respirometrici valutazione dei mitocondri isolati dal tessuto muscolare scheletrico Ottenuto dalla biopsia percutanea

I metodi presentati forniscono istruzioni passo dopo passo per l'esecuzione di una raccolta di saggi respirometrici basati su micropiastre utilizzando mitocondri isolati da quantità minime di muscolo scheletrico di topo. Questi saggi sono in grado di misurare i cambiamenti/adattamenti meccanicistici nel consumo di ossigeno mitocondriale in un modello animale di uso comune.

Utilizzo di mitocondri isolati da minime quantità di muscolo scheletrico del mouse per High micropiastre rendimento respiratorie Misure

Ad alta risoluzione respirometria è utilizzato per determinare il consumo di ossigeno mitocondriale. Questa è una tecnica semplice per determinare mitocondriale complessi della catena respiratoria '(I-IV) frequenza respiratoria, la capacità del sistema di trasporto degli elettroni mitocondriale massima, e l'integrità della membrana mitocondriale esterna.

Ad alta risoluzione respirometria mitocondriale per valutare la funzione in permeabilizzate e cellule intatte

In questa carta, è descritto un metodo per misurare il consumo di ossigeno utilizzando ad alta risoluzione manometrica in permeabilized toraci di Drosophila. Questa tecnica richiede una minima quantità di tessuto rispetto alla tecnica classica isolamento mitocondriale e i risultati ottenuti sono più fisiologicamente rilevanti.

Misura del consumo di ossigeno mitocondriale nelle fibre Permeabilized di Drosophila utilizzando la minima quantità di tessuto

Questa tecnica viene descritto la registrazione in tempo reale del consumo di ossigeno e tassi di acidificazione extracellulare nei tessuti retinici explanted del mouse utilizzando un analizzatore di flusso extracellulare.

Misurazione del metabolismo energetico in tessuto retinico Explanted usando l'analisi di flusso extracellulare

Abbiamo sviluppato un protocollo pratico e un approccio analitico per valutare la fosforilazione ossidativa mitocondriale e la capacità di trasferimento di elettroni negli omogeneizzati tumorali freschi. Questo protocollo può essere facilmente adattato per esaminare varie funzioni mitocondriali che contribuiscono all'inizio, alla progressione e alla risposta al trattamento del cancro.

Determinazione analitica della funzione mitocondriale degli omogeneizzati tumorali solidi asportati

Qui, descriviamo un metodo dettagliato per l'isolamento dei mitocondri dal muscolo scheletrico del topo e la successiva analisi della respirazione mediante Oxygen Consumption Rate (OCR) utilizzando saggi respirometrici basati su micropiastre. Questa pipeline può essere applicata per studiare gli effetti di molteplici interventi ambientali o genetici sul metabolismo mitocondriale.

Isolamento dei mitocondri dal muscolo scheletrico del topo per saggi respirometrici

Lo stato metabolico delle cellule epiteliali pigmentate retiniche umane (H-RPE) riflette la loro salute e funzione. Qui viene presentato un protocollo ottimizzato per esaminare il flusso metabolico in tempo reale di H-RPE utilizzando respirometria ad alta risoluzione.

Analisi in tempo reale della bioenergetica in cellule epiteliali pigmentate primarie della retina umana mediante respirometria ad alta risoluzione

Presentiamo un nuovo dispositivo per misurare i tassi di consumo di ossigeno (OCR) nelle colture di epiteliale pigmentato retinico (RPE). Il dispositivo è in grado di misurare l'OCR per settimane su RPE coltivate su piastre di coltura cellulare standard con terreni standard mentre le piastre si trovano in un incubatore per colture cellulari standard.

Monitoraggio a lungo termine dei tassi di consumo di ossigeno in colture epiteliali pigmentate retiniche altamente differenziate e polarizzate

Questo protocollo descrive un modo conveniente per eseguire un test di sforzo per la glicolisi al fine di quantificare la riprogrammazione metabolica nella microglia primaria del topo. Dopo l'isolamento e la stimolazione infiammatoria, il tasso di acidificazione extracellulare (ECAR) viene misurato utilizzando reagenti appena preparati e regolati per il pH, seguiti dalla normalizzazione proteica per consentire una valutazione accurata e riproducibile degli spostamenti glicolitici.

Indagine della glicolisi nella microglia primaria tramite test di flusso extracellulare

Impara a misurare la respirazione mitocondriale e la glicolisi in tessuto retinico ex vivo di topo. Questo protocollo utilizza sensori fluorescenti per analizzare il metabolismo energetico retinico in tempo reale.

Determinazione della respirazione mitocondriale e della glicolisi in campioni di tessuto retinico Ex Vivo

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