Name: Sul posto Ibridazione in larve di zebrafish e giovani durante lo sviluppo di Mesonephros (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-13T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 16 s
Description: Scopri l'ibridazione in situ ottimizzata per analizzare l'espressione genica in larve e giovani di zebrafish durante lo sviluppo del mesonefros. Questo metodo migliora la penetrazione della sonda e la visualizzazione del rene.

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Il finanziamento è stato fornito dalla Pennsylvania Academy of Science, dal Commonwealth of Pennsylvania Biologists e dall'Indiana University of Pennsylvania (School of Graduate Studies and Research, Department of Biology e Cynthia Sushak Undergraduate Biology Fund for Excellence). La linea transgenica Tg (lhx1a-EGFP) è stata fornita dal Dr. Neil Hukriede (Università di Pittsburgh).

L'uso di larve e novellame di zebrafish è approvato dalla IUP IACUC (protocollo #02-1920, #08-1920). I dettagli del contenuto della soluzione sono elencati nella Tabella dei materiali.
1. Allevamento di larve
NOTA: Ci vorranno fino a 21 giorni o più per allevare larve e giovani allo stadio di interesse.
<ol><li>Prepara il pesce zebra adulto ad accoppiarsi aggiungendo 1 pesce maschio e 1 femmina in una vasca di accoppiamento nel tardo pomeriggio dopo il loro ultimo pasto. NOTA: non tutte le coppie di pesci si accoppiano. Inizia impostando 20 coppie per determinare il tasso di accoppiamento e regolare di conseguenza negli esperimenti futuri.</li>
	<li>Il giorno successivo, dopo che i pesci hanno terminato l'accoppiamento (intorno alle 13:00), raccogliere gli embrioni con il mezzo E3 in piastre di Petri.<ol>
<li>Assicurarsi che non ci siano più di 30 embrioni per piastra.</li>
		<li>Rimuovere i detriti (come le feci) dalle piastre di Petri e aggiungere 20 ml di mezzo E3.</li>
		<li>Incubare a 28,5 °C per 1 giorno.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Rimetti il pesce zebra adulto nel sistema acquatico.</li>
	<li>A 1 dpf, sostituire il mezzo E3 con E3 fresco.<ol>
<li>Incubare a 28,5 °C per altri 4 giorni fino a 5 dpf.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mettere uno schermo da 400 μm in un serbatoio da 2,8 L e riempirlo con 2 cm di acqua di sistema.<ol>
<li>Aggiungere le 5 larve dpf da 1 piastra (fino a 30 larve totali).</li>
		<li>Metti il serbatoio nel sistema acquatico, ma non avviare il flusso d'acqua.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Nutrire le larve con 4 ml di cibo in polvere due volte al giorno fino a 14 dpf.</li>
	<li>A 6 dpf, avviare il flusso d'acqua a 1 goccia al secondo. NOTA: Controllare il flusso d'acqua ogni giorno e regolare di conseguenza.</li>
	<li>A 8 dpf, aumentare il flusso d'acqua in un flusso lento e costante.</li>
	<li>A 14 dpf, nutrire i gamberetti vivi in salamoia oltre al cibo in polvere.</li>
</ol>2. Giorno 1 - 2: Fissaggio delle larve
<ol><li>Rimuovere un serbatoio di larve nel punto temporale desiderato.</li>
	<li>Riempire una piastra di Petri con 20 ml di acqua di sistema.</li>
	<li>Utilizzare una rete a maglie sottili per raccogliere delicatamente le larve e portarle sulla superficie dell'acqua.<ol>
<li>Tagliare la punta di una pipetta di trasferimento per dare un'apertura più ampia e trasferire le larve nella piastra di Petri. La bocca della pipetta più grande consente il trasferimento di diverse piccole larve o di alcune più grandi contemporaneamente.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aggiungere 2 ml di tricaina (2%, pH 7 stock) per immobilizzare le larve.<ol>
<li>Dopo che le larve hanno smesso di muoversi, rimuovere la maggior parte dell'acqua e aggiungere 10 ml di tricaina. Attendere 15 minuti per l'eutanasia delle larve.</li>
		<li>Opzionale: per i giovani di lunghezza superiore a 8 mm, tagliare le teste e le code con una lama di rasoio (dopo eutanasia) sotto un microscopio di dissezione per migliorare la penetrazione della soluzione di fissaggio. Assicurati di registrare la lunghezza totale di ogni animale prima di tagliare la testa e la coda e isolare ciascuno nella propria piastra di Petri. Fare riferimento al passaggio 3 per come misurare gli animali.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sostituire la tricaina con 20 ml di soluzione fissante (4% paraformaldeide, 1% DMSO). Rimettere il coperchio sulla piastra di Petri e dondolare lentamente in una cappa aspirante. NOTA: è importante utilizzare una piattaforma a dondolo. Una piattaforma vibrante con un movimento circolare causerà la curvatura dell'asse animale. Utilizzare solo una soluzione fissante fresca (non preconfezionata congelata). ATTENZIONE: La soluzione fissante contiene paraformaldeide, che è un probabile cancerogeno. Utilizzare cappa aspirante (o maschera) e guanti per misurare la polvere.</li>
	<li>Dopo 30 minuti, sostituire la soluzione di fissaggio con una nuova soluzione di fissaggio.<ol>
<li>Raccogliere la soluzione fissante utilizzata in un contenitore separato per il corretto smaltimento.</li>
		<li>Trasferire le larve in un tubo da 50 ml contenente 25 mL di soluzione fissante fresca.</li>
		<li>Assicurarsi che il cappuccio sia stretto e oscillare lentamente a 4 °C per 2 giorni. È possibile incubare più a lungo per comodità.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Giorno 3: Misurazione delle larve
<ol><li>In una cappa aspirante, sostituire la soluzione di fissaggio con 20 ml di PBST.</li>
	<li>Trasferire le larve in una piastra di Petri.</li>
	<li>Metti un righello piatto su un microscopio di dissezione e metti la piastra di Petri sopra il righello.</li>
	<li>Usa un manipolatore di ciglia per spostare ogni larva sul righello per misurarne la lunghezza totale (dal muso alla punta della pinna caudale) (Figura 1).</li>
	<li>Combinare diverse larve di lunghezze simili (ad esempio, 5,0 mm e 5,1 mm) in una fiala di vetro da 5,5 ml, fino a 10 larve per fiala.</li>
</ol>4. Giorno 3 - 4: Disidratazione
<ol><li>Sostituire il PBST con 4 ml di metanolo al 100%. Cullare il flaconcino per 5 minuti a temperatura ambiente.</li>
	<li>Sostituire il metanolo con metanolo fresco e roccia per 5 minuti. Ripeti ancora una volta.</li>
	<li>Conservare il flaconcino a -20 °C per 2 giorni. È possibile incubare più a lungo per comodità.</li>
</ol>5. Giorno 5: Reidratazione
<ol><li>Riscaldare il flaconcino a temperatura ambiente.</li>
	<li>Sostituire il metanolo con 4 ml di metanolo al 75% / PBST al 25%. Roccia per 5 minuti a temperatura ambiente.</li>
	<li>Sostituire la soluzione nel passaggio 5.2 con 4 ml di metanolo al 50% / PBST al 50% e roccia per 5 minuti.</li>
	<li>Sostituire la soluzione nel passaggio 5.3 con 4 mL di metanolo al 25% / PBST al 75% e roccia per 5 minuti.</li>
	<li>Sostituire la soluzione nel passaggio 5.4 con 4 ml di PBST e roccia per 10 minuti.</li>
	<li>Sostituire il PBST con 4 ml di PBST fresco e roccia per 10 min. Ripeti ancora una volta.</li>
</ol>6. Giorno 5: Proteinasi K digest
<ol><li>Sostituire il PBST con 2 mL della soluzione di proteinasi K (20 μg/mL, concentrazione finale dmSO all'1% in PBST) e oscillare a temperatura ambiente per 30 min. NOTA: le larve più lunghe di 6 mm avranno bisogno di un tempo di incubazione più lungo e/o di una concentrazione di proteinasi K più elevata. Il tempo esatto e la concentrazione dovranno essere determinati empiricamente. Inizia con un aumento di 10 minuti del tempo di incubazione per ogni 0,5 mm più lungo di 6 mm.</li>
	<li>Sostituire la soluzione di proteinasi K con 4 mL di PBST e roccia per 10 min.</li>
	<li>Sostituire il PBST con 4 ml di PBST fresco e roccia per 10 min. Ripeti ancora una volta.</li>
	<li>Sostituire il PBST con 4 mL di soluzione di fissaggio fresco e roccia per 1 ora. È possibile incubare più a lungo a 4 °C per comodità.</li>
</ol>7. Giorno 5: Sbiancamento
<ol><li>Sostituire la soluzione di fissaggio con 4 ml di PBST e rocciare a temperatura ambiente per 10 minuti.</li>
	<li>Sostituire il PBST con 4 ml di PBST fresco e roccia per 10 min. Ripeti ancora una volta.</li>
	<li>Trasferire le larve in una piastra a 6 pozzetti (fino a 10 larve per pozzetto).</li>
	<li>Sostituire il PBST con 3 ml di soluzione sbiancante fresca.</li>
	<li>Roccia a temperatura ambiente e monitorare la pigmentazione al microscopio sezionante ogni 5 minuti. Cerca la scomparsa della pigmentazione lungo il mesonefro (dorsale alla vescica natatoria e all'intestino). NOTA: Per le larve lunghe fino a 6 mm, ci vorranno fino a 20 minuti per sbiancare la pigmentazione che circonda il mesonefro. Non sbiancare più a lungo del necessario per preservare l'integrità delle larve.</li>
	<li>Trasferire nuovamente le larve in una fiala di vetro.</li>
	<li>Sostituire la soluzione sbiancante con 4 ml di PBST. Roccia per 10 min.</li>
	<li>Sostituire il PBST con 4 ml di PBST fresco e roccia per 10 min. Ripeti ancora una volta.</li>
	<li>Sostituire il PBST con 4 mL di soluzione di fissaggio fresco e roccia per 1 ora. È possibile incubare più a lungo a 4 °C per comodità.</li>
</ol>8. Giorno 5: Preibridizzazione
NOTA: per i passaggi eseguiti a 70 °C, è importante lavorare rapidamente per ridurre al minimo il raffreddamento del flaconcino.
<ol><li>Sostituire la soluzione di fissaggio con 4 ml di PBST e rocciare a temperatura ambiente per 10 minuti.</li>
	<li>Sostituire il PBST con 4 ml di PBST fresco e roccia per 10 min. Ripeti ancora una volta.</li>
	<li>Sostituire il PBST con 4 mL della soluzione Hyb- e dondolare a temperatura ambiente per 10 min. ATTENZIONE: Le soluzioni Hyb-, Hyb+ e sonda contengono formammide, che può irritare la pelle. Utilizzare i guanti per maneggiare queste soluzioni.</li>
	<li>Sostituire l'Hyb- con 4 ml di Hyb fresco- e roccia per 10 min. Ripeti ancora una volta.<ol>
<li>Raccogliere le soluzioni Hyb-, Hyb+ e probe usate in un contenitore separato per il corretto smaltimento.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sostituire Hyb- con 4 mL della soluzione Hyb+.</li>
	<li>Incubare il flaconcino a 70 °C durante la notte.</li>
	<li>Diluire la sonda EGFP-fluoresceina 1:100 in 500 μL di Hyb+ e incubarla O/N a 70 °C. NOTA: seguire le istruzioni del produttore per la sintesi della sonda.</li>
</ol>9. Giorno 6: Ibridazione della sonda
<ol><li>Sostituire la soluzione di Hyb+ nel flaconcino con la sonda preriscaldata e incubare a 70 °C durante la notte. NOTA: le larve più lunghe di 6 mm necessitano di 2 giorni di incubazione.</li>
	<li>Preriscaldare il tampone di lavaggio, 2 soluzioni SSCT e 0,2x SSCT a 70 °C per la notte.</li>
</ol>10. Giorno 7: Lavaggio della sonda
<ol><li>Sostituire la sonda con 4 mL del tampone di lavaggio preriscaldato e incubare a 70 °C per 30 min.<ol>
<li>Raccogliere la sonda usata in un contenitore separato per il corretto smaltimento.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sostituire il tampone di lavaggio con 4 mL di tampone di lavaggio fresco e incubare a 70 °C per 30 minuti.</li>
	<li>Sostituire il tampone di lavaggio con 4 mL della soluzione preriscaldata 2x SSCT e incubarlo a 70 °C per 15 min.</li>
	<li>Aggiungere 50 mL di SSCT preriscaldato 0,2x in un tubo da 50 mL.<ol>
<li>Inserire un filtro cellulare (100 μm) nella parte superiore del tubo. Assicurarsi che il filtro cellulare venga spinto fino in fondo fino a quando non si ferma.</li>
		<li>Trasferire le larve dalla fiala di vetro nel colino cellulare. Assicurarsi che le larve siano immerse nel tampone e incubare a 70 °C per 2 ore.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparare un nuovo tubo contenente 50 ml di SSCT preriscaldato 0,2x.<ol>
<li>Trasferire il filtro cellulare dal passaggio 10.4.2 nel nuovo tubo di 0,2x SSCT e incubare a 70 °C per 2 ore.</li>
		<li>Ripetere il passaggio 10.5 ancora una volta.</li>
	</ol>
</li>
</ol>11. Giorno 7: Blocco
<ol><li>Trasferire le larve in una nuova fiala di vetro e raffreddare a temperatura ambiente.</li>
	<li>Sostituire lo 0,2x SSCT con 4 mL del 67% 0,2x SSCT/33% MABT e oscillare a temperatura ambiente per 10 min.</li>
	<li>Sostituire la soluzione nel passaggio 11.2 con 4 mL di 33% 0,2x SSCT/67% MABT e roccia per 10 min.</li>
	<li>Sostituire la soluzione nel passaggio 11.3 con 4 mL di MABT e roccia per 10 min.</li>
	<li>Sostituire il MABT con 4 ml di MABT fresco e roccia per 10 minuti. Ripeti ancora una volta.</li>
	<li>Sostituire il MABT con 4 mL della soluzione bloccante e incubare a 4 °C durante la notte. È possibile incubare più a lungo per comodità.</li>
</ol>12. Giorno 8 - 9: Incubazione degli anticorpi
<ol><li>Diluire l'anticorpo anti-fluoresceina 1:5.000 in soluzione bloccante da 500 μL.</li>
	<li>Sostituire la soluzione bloccante con la soluzione anticorpale e incubare a 4 °C per 2 giorni. È possibile incubare più a lungo per comodità.<ol>
<li>Ruotare la fiala due volte al giorno per agitare le larve. NOTA: le larve più lunghe di 6 mm hanno bisogno di 1-2 giorni in più di incubazione.</li>
	</ol>
</li>
</ol>13. Giorno 10 - 11: Lavaggio degli anticorpi
<ol><li>Sostituire la soluzione anticorpale con 4 mL di PBST e oscillare a temperatura ambiente per 10 minuti.</li>
	<li>Sostituire il PBST con 4 ml di PBST fresco e roccia per 10 min. Ripeti ancora una volta.</li>
	<li>Trasferire le larve in un tubo da 50 ml.</li>
	<li>Aggiungere 40 ml di PBST2. Posare il tubo su un lato e oscillare a 4 °C durante la notte.</li>
	<li>Sostituire il PBST2 con 40 ml di PBST2 fresco e dondolare a 4 °C durante la notte. È possibile incubare più a lungo per comodità. NOTA: le larve più lunghe di 6 mm richiedono 1-2 giorni in più di lavaggio.</li>
</ol>14. Giorno 12: Colorazione
<ol><li>Trasferire le larve in una piastra a 6 pozzetti.</li>
	<li>Sostituire il PBST2 con 3 mL di tampone di colorazione e roccia a temperatura ambiente per 5 minuti.</li>
	<li>Sostituire il tampone di colorazione con 3 mL di tampone di colorazione fresco e roccia per 5 minuti. Ripeti ancora una volta.</li>
	<li>Sostituire il tampone colorante con 3 mL della soluzione colorante. Coprire con un foglio di alluminio e monitorare la colorazione nelle prossime ore.<ol>
<li>Per le sonde con un segnale debole, incubare a 4 °C durante la notte e sostituire la soluzione colorante con una soluzione colorante fresca una volta nel mezzo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Quando viene raggiunta l'intensità di colorazione desiderata, sostituire la soluzione di colorazione con 3 ml della soluzione di arresto e roccia per 30 minuti.</li>
	<li>Sostituire la soluzione di arresto con 3 mL di soluzione di arresto fresco e roccia per 30 minuti. Ripeti ancora una volta.</li>
	<li>Trasferire le larve in un nuovo flaconcino di vetro e sostituire la soluzione di arresto con 4 mL di soluzione fissante fresca e incubare per 1 ora a temperatura ambiente. È possibile incubare più a lungo a 4 °C per comodità.</li>
	<li>Conservare le larve nella soluzione fissante al buio a 4 °C per un massimo di un anno.</li>
</ol>15. Giorno 12: Imaging
<ol><li>Sostituire la soluzione di fissaggio con 4 ml di PBST e rocciare a temperatura ambiente per 10 minuti.</li>
	<li>Trasferire le larve in una piastra a 6 pozzetti.</li>
	<li>Sostituire il PBST con 4 ml di PBST fresco e roccia per 10 min. Ripeti ancora una volta.</li>
	<li>Sostituire il PBST con 3 ml di glicerolo al 50% (in PBST) e roccia per 10 minuti.</li>
	<li>Sostituire la soluzione nel passaggio 15.4 con 3 ml di glicerolo al 100% senza dondolare per 10 minuti.</li>
	<li>Utilizzare un microscopio di dissezione per visualizzare le larve direttamente nella piastra a 6 pozzetti o trasferire le larve in un vetrino di depressione a immagine sotto un microscopio composto. Usa un manipolatore di ciglia per orientare le larve.</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori non hanno conflitti di interesse.

Il metodo di ibridazione in situ qui descritto ha lo scopo di studiare lo sviluppo del mesonefro. Tuttavia, può essere applicato per studiare lo sviluppo di altri tessuti e organi durante la metamorfosi, come l'intestino, il sistema nervoso, le squame e la pigmentazione14. Le sonde possono essere generate per geni endogeni o marcatori fluorescenti in linee transgeniche.
È fondamentale che le larve rimangano intatte per osservare gli organi e i tessuti nel loro ...

L'embrione di zebrafish è un modello importante per lo studio dello sviluppo dei tessuti grazie alle sue piccole dimensioni, alla trasparenza, agli strumenti disponibili e alla sopravvivenza senza nutrirsi fino a cinque giorni1,2. Ha notevolmente contribuito alla comprensione dello sviluppo renale e alla conservazione tra zebrafish e mammiferi3,4,5. Il rene svolge un ruolo essenziale nel mantenimento dell'omeostasi fluida, nel filtraggio del sangue e nell'escrezione dei rifiuti6. Il nefrone, l'unità funzionale del rene, comprende un filtro del sangue collegato a un lungo tubulo. Nel pesce zebra, due strutture renali si formano per tutta la sua vita. Il pronephros (il rene embrionale temporaneo) si forma prima durante lo sviluppo precoce. È costituito da due nefroni che corrono lungo l'asse anteriore-posteriore e diventa funzionale a circa 2 giorni dopo la fecondazione (dpf). L'utilità del pronephros sta nella sua semplicità, avendo solo due nefroni che sono per lo più lineari e facili da visualizzare (anche se il tubulo contorto prossimale inizia a ruotare a tre dpf)3. Ciò ha facilitato non solo gli studi sul suo sviluppo precoce dal mesoderma intermedio, ma anche il modello di segmentazione e la riparazione dei tubuli7,8.
L'utilità del pesce zebra diventa limitata dopo cinque dpf, quando il tuorlo è diminuito e le larve si affidano all'alimentazione nel sistema acquatico9. A circa 2 settimane di età, le larve subiscono metamorfosi in giovani, dove si formano nuovi tessuti e i vecchi tessuti vengono persi e/ o riorganizzati9. Questo è anche quando il mesonephros (il rene adulto permanente) forma10,11,12. Il primo nefrone adulto si forma vicino al sesto somite e si fonde con il tubulo distale precoce del pronephros. Ulteriori nefroni vengono aggiunti posteriormente a questa posizione inizialmente, ma anche verso l'anteriore in seguito. I nefroni primari in questa prima ondata si fondono con i tubuli del pronephros e condividono un lume comune per depositare i loro rifiuti. I nefroni secondari si formano nell'onda successiva e si fondono con i nefroni primari. Questo processo ripetitivo crea un mesonephros che è ramificato, in qualche modo simile al rene dei mammiferi. Presumibilmente, il pronephros alla fine perde la sua identità tubulare e diventa due importanti condotti di raccolta in cui tutti i nefroni drenano i loro rifiuti13.
Prima della formazione del primo nefrone adulto, le singole cellule progenitrici iniziano ad apparire in larve di ~ 4 mm (lunghezza totale) (~ 10 dpf). Queste cellule, che sono marcate nella linea transgenica Tg(lhx1a-EGFP ), aderiscono al pronephros e sembrano migrare verso futuri siti di nefrogenesi. Le singole cellule si fondono in cluster, che si differenziano in nuovi nefroni12. Non è chiaro dove risiedano queste cellule o quali geni esprimano prima dell'inizio della mesonefrogenesi.
Comprendere lo sviluppo del mesonefro fornisce informazioni sul rene dei mammiferi in modi che il pronephros non può. Questi includono la formazione di aggregati nefrogenici da singole cellule progenitrici, l'integrazione funzionale di nuovi nefroni con quelli esistenti e la morfogenesi ramificata. Tuttavia, ci sono limitazioni allo studio dello sviluppo postembrionale. Le larve sono meno trasparenti a causa delle loro dimensioni maggiori e della pigmentazione. La linea temporale dello sviluppo non è sincrona tra i singoli animali ed è fortemente dipendente da fattori ambientali, come l'alimentazione e l'affollamento9,14. Sebbene esistano reagenti knockdown, sono meno efficaci nelle larve rispetto agli embrioni15. In questo protocollo, viene descritto un metodo di ibridazione in situ per determinare l'espressione genica durante lo sviluppo del mesonephros zebrafish. Diversi passaggi sono ottimizzati per aumentare la visualizzazione del mesonefro e la penetrazione e il lavaggio della sonda e dell'anticorpo. La linea transgenica Tg (lhx1a-EGFP) viene utilizzata insieme a una sonda per EGFP per etichettare singole cellule progenitrici, aggregati nefrogenici e tubuli distali dei nefroni nascenti. Questo metodo fornirà una comprensione più profonda dello sviluppo del mesonefro e una visione approfondita delle terapie rigenerative.

<table><tbody><tr><td>Anticorpo anti-fluoresceina</td><td>Roche/Sigma-Aldrich</td><td>11426338910</td><td></td></tr><tr>Soluzione <td></td><td></td><td>sbiancante</td><td>0,8% KOH, 0,9% H2O2 in PBST</td></tr><tr><td>Reagente bloccante</td><td>Roche/Sigma-Aldrich</td><td>11096176001</td><td>Utilizzare per la soluzione bloccante, preparare secondo le istruzioni del produttore</td></tr><tr><td>Filtro cellulare</td><td>Fisher Scientific</td><td>&nbsp; 22-363-549</td><td>100 &mu; m</td></tr><tr><td>E3 medium</td><td></td><td></td><td>5 mM NaCl, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mM MgSO4, 0,17 mM KCl, 0,0001% blu di metilene</td></tr><tr><td>Manipolatore di ciglia</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC1083208</td><td>Utilizzare per manipolare le larve</td></tr><tr><td>Soluzione di fissaggio</td><td></td><td></td><td>4% paraformaldeide, 1% DMSO in PBS; calore a 65 gradi; C agitando fino a quando la polvere non si scioglie, quindi aggiungere DMSO dopo che si è raffreddato</td></tr><tr><td>Sintesi della sonda di fluoresceina</td><td>Roche/Sigma-Aldrich</td><td>11685619910</td><td></td></tr><tr><td>Fiala di vetro</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-338B</td><td></td></tr><tr><td>Incapsulamento di Hatchfry</td><td>Soluzione di Argent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hyb-</td><td></td><td></td><td>50% formammide, 5X SSC, 0,1% Soluzione di Tween-20</td></tr><tr><td>Hyb+</td><td></td><td></td><td>HYB-, 5 mg/mL di torula RNA, 50 ug/mL di eparina</td></tr><tr><td>MAB (10X)</td><td></td><td></td><td>1 M di acido maleico, 1,5 M di NaCl, pH 7,5</td></tr><tr><td>MABT</td><td></td><td></td><td>1X MAB, 0,1% Tween-20</td></tr><tr><td>Acido maleico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0375</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>PBS (10X)8</td><td></td><td></td><td>% NaCl, 0,2% KCl, 1,44% Na2HPO4, 0,24% KH2PO4</td></tr><tr><td>PBST</td><td></td><td></td><td>1X PBS, 0,1% Tween-20</td></tr><tr><td>PBST2</td><td></td><td></td><td>1X PBS, 0,2% Tween-20</td></tr><tr><td>Cibo</td><td></td><td></td> in polvere <td>Mescolare 2 g di spirulina e encapsulon di avannotti in 50 ml di acqua del sistema di pesce e agitare bene</td></tr><tr><td>Proteinasi K</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5568</td><td>Utilizzare per permeabilizzare le larve</td></tr><tr><td>Soluzione di proteinasi K</td><td></td><td></td><td>20&nbsp; &mu; g/mL, 1% di DMSO concentrazione finale in PBST</td></tr><tr><td>Spirulina polvere microfine</td><td>Argent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SSC (20X)</td><td></td><td></td><td>3 M NaCl, 0,3 M acetato di sodio anidro, pH 7, autoclave</td></tr><tr><td>SSCT (0,2X)</td><td></td><td></td><td>Diluire da 20X SSC, 0,1% Tween-20</td></tr><tr><td>SSCT (2X)</td><td></td><td></td><td>Diluire da 20X SSC, 0,1% Tween-20</td></tr><tr><td>Tampone</td><td></td><td></td> <td>di colorazione100 mM Tris pH 9,5, 50 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 0,1% Tween-20</td></tr><tr><td>Soluzione colorante</td><td></td><td></td><td>200 &mu; g/mL di cloruro di iodonitrotetrazolio, 200 &mu; g/mL di sale disodico di 5-bromo-4-cloro-3-indolil fosfato, in tampone di colorazione</td></tr><tr><td>Soluzione di arresto</td><td></td><td></td><td>1 mM EDTA, pH 5,5, in PBST</td></tr><tr><td>Torula (lievito) RNA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R6625</td><td></td></tr><tr><td>Tricaina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E10521</td><td>2%, pH 7</td></tr><tr><td>Tampone</td><td></td><td></td> di lavaggio <td>50% formammide, 2X SSC, 0,1% Tween-20</td></tr></tbody></table>

sul posto ibridazione in larve di zebrafish e giovani durante lo sviluppo di mesonephros

In Situ Hybridization in Zebrafish Larvae and Juveniles during Mesonephros Development

Il pesce zebra forma due strutture renali nel corso della sua vita. Il pronephros (rene embrionale) si forma durante lo sviluppo embrionale e inizia a funzionare a 2 giorni dopo la fecondazione. Costituito da soli due nefroni, il pronephros funge da unico rene durante la vita larvale fino a quando non è richiesta una maggiore funzionalità renale a causa dell'aumento della massa corporea. Per far fronte a questa maggiore domanda, il mesonephros (rene adulto) inizia a formarsi durante la metamorfosi. I nuovi nefroni primari si fondono con il pronephros e formano lumen collegati. Quindi, i nefroni secondari si fondono con quelli primari (e così via) per creare una rete ramificata nel mesonefro. La stragrande maggioranza della ricerca si concentra sul pronephros a causa della facilità di utilizzo degli embrioni. Pertanto, è necessario sviluppare tecniche per studiare larve più vecchie e più grandi e pesci giovani per comprendere meglio lo sviluppo del mesonephros. Qui, un protocollo di ibridazione in situ per l'analisi dell'espressione genica è ottimizzato per la penetrazione della sonda, il lavaggio di sonde e anticorpi e lo sbiancamento dei pigmenti per visualizzare meglio il mesonefro. La linea transgenica Tg(lhx1a-EGFP) viene utilizzata per etichettare le cellule progenitrici e i tubuli distali dei nefroni nascenti. Questo protocollo colma una lacuna nella ricerca sul mesonefro. È un modello cruciale per capire come i nuovi tessuti renali si formano e si integrano con i nefroni esistenti e fornire approfondimenti sulle terapie rigenerative.

Utilizzando la linea transgenica Tg (lhx1a-EGFP), è stato dimostrato che questo protocollo di ibridazione in situ è efficace nell'etichettare le cellule progenitrici renali e varie strutture di nefroni durante lo sviluppo di mesonefro. Come previsto, anche il sistema nervoso centrale è etichettato in questa linea transgenica (non mostrata). Il nefrone mesonefrico iniziale si forma a circa 5,2 mm, dorsale al pronephros (Figura 2A), e il tubulo distale di questo nefrone è eti...

Il pesce zebra è un modello importante per comprendere lo sviluppo del rene. Qui, un protocollo di ibridazione in situ è ottimizzato per rilevare l'espressione genica nelle larve di zebrafish e nei giovani durante lo sviluppo del mesonephros.

Sul posto Ibridazione in larve di zebrafish e giovani durante lo sviluppo di Mesonephros

The zebrafish forms two kidney structures in its lifetime. The pronephros (embryonic kidney) forms during embryonic development and begins to function at ...

Questo protocollo è significativo perché consente la determinazione dell'espressione genica nelle larve di zebrafish più vecchie e nei giovani durante la metamorfosi. Il vantaggio di questa tecnica è che diversi passaggi sono stati ottimizzati per la penetrazione della sonda e la visualizzazione del rene. Per iniziare, prepara il pesce zebra adulto ad accoppiarsi aggiungendo un pesce maschio e una femmina in una vasca di accoppiamento nel tardo pomeriggio dopo il loro ultimo pasto.Il giorno dopo, raccogli gli embrioni in piastre di Petri contenenti E3 medium. Cinque giorni dopo la fecondazione, posizionare uno schermo da 400 micrometri in un serbatoio da 2,8 litri e riempirlo con 2 centimetri di acqua di sistema. Quindi aggiungere la larva da una piastra di Petri.Per fissare la larva, rimuovere un serbatoio di larva nel punto temporale desiderato, quindi, utilizzando una rete e trasferire la pipetta con la punta tagliata, trasferire la larva nella piastra di Petri. Quindi, aggiungere due millilitri di tricaina al 2% per immobilizzare la larva. Dopo l'immobilizzazione, sostituire la tricaina con 20 millilitri di soluzione fissante.Dopo 30 minuti, trasferire la larva in un tubo da 50 millilitri contenente 25 millilitri di soluzione fissante fresca. Quindi, assicurandosi che il cappuccio sia stretto, scuotere lentamente il tubo a quattro gradi Celsius per due giorni. Il terzo giorno, sostituire la soluzione fissante con 20 millilitri di PBST, quindi trasferire la larva su una piastra di Petri.Per misurare la larva, posiziona la piastra di Petri sopra un righello piatto sotto un microscopio sezionante, quindi, usando un manipolatore di ciglia, sposta ogni larva sul righello per misurarne la lunghezza totale. Dopo aver misurato tutte le larve, combinare diverse larve di lunghezze simili su una fiala di vetro da 5,5 millilitri con PBST. Per la disidratazione, sostituire il PBST nel flaconcino di vetro con quattro millilitri di metanolo al 100%, quindi conservare il flaconcino a meno 20 gradi Celsius per due giorni.Per la reidratazione, sostituire il metanolo al 100% con quattro millilitri di una soluzione al 75% di metanolo e al 25% di PBST e scuotere il flaconcino per cinque minuti. Quindi, sostituire la soluzione di metanolo e PBST con quattro millilitri di PBST fresco e scuotere nuovamente il flaconcino per 10 minuti. Per la digestione della proteinasi K, sostituire il PBST con due millilitri di una soluzione di proteinasi K e scuotere il flaconcino a temperatura ambiente per 30 minuti.Successivamente, per lo sbiancamento, trasferire la larva in una piastra a sei pozzetti e sostituire il PBST con tre millilitri di soluzione sbiancante fresca. Dopo la completa scomparsa della pigmentazione lungo il mesonefro, trasferire nuovamente la larva in una fiala di vetro, sostituire la soluzione sbiancante con quattro millilitri di PBST e scuotere la fiala per 10 minuti. Per la pre-ibridazione, sostituire la soluzione di fissaggio con quattro millilitri di PBST e scuotere la fiala per 10 minuti, quindi sostituire il PBST con quattro millilitri di soluzione Hyb e roccia per 10 minuti.Dopo due ulteriori incubazioni nella soluzione Hyb, sostituire la soluzione con quattro millilitri della soluzione Hyb+. Diluire contemporaneamente la sonda di fluoresceina EGFP da uno a 100 in 500 microlitri di ibridazione più soluzione e incubare la fiala e la sonda a 70 gradi Celsius durante la notte. Il giorno successivo, per ibridare la sonda, sostituire la soluzione Hyb+nel flaconcino con la sonda preriscaldata e incubare a 70 gradi Celsius durante la notte.Il giorno seguente, aggiungere 50 millilitri di SSCT preriscaldato 0,2 volte in un tubo da 50 millilitri. Quindi, inserire un filtro cellulare da 100 micrometri nella parte superiore del tubo, trasferire la larva dalla fiala di vetro nel filtro cellulare e assicurarsi che la larva sia immersa nel tampone, incubare la fiala a 70 gradi Celsius per due ore. Dopo l'incubazione, trasferire il filtro cellulare in un nuovo tubo contenente preriscaldato 0,2 volte SSCT e incubare nuovamente a 70 gradi Celsius per due ore.Successivamente, per il blocco, trasferire la larva in una nuova fiala di vetro e lasciarla raffreddare a temperatura ambiente. Quindi, sostituire la soluzione 0,2 volte SSCT con quattro millilitri di una soluzione 67%0,2 volte SSCT e 33% MABT e scuotere il flaconcino a temperatura ambiente per 10 minuti. Quindi, sostituire la soluzione SSCTT MABT con quattro millilitri di MABT fresco e incubare il flaconcino su un bilanciere per 10 minuti.Quindi, sostituire il MABT con quattro millilitri di soluzione bloccante e incubare quattro gradi Celsius durante la notte. Il giorno successivo, sostituire la soluzione bloccante con una soluzione anticorpale e incubare a quattro gradi Celsius per due giorni. Per il lavaggio degli anticorpi, trasferire la larva in un tubo da 50 millilitri, quindi aggiungere 40 millilitri di PBST2 e posare il tubo posato su un lato per l'incubazione notturna a quattro gradi Celsius.Il giorno 12, dopo aver trasferito la lava in una piastra a sei pozzetti, sostituire il PBST2 con tre millilitri di tampone di colorazione. Dopo un'incubazione di cinque minuti su un bilanciere, sostituire il tampone di colorazione con tre millilitri della soluzione di colorazione. Quando viene raggiunta l'intensità di colorazione desiderata, sostituire la soluzione di colorazione con tre millilitri della soluzione di arresto e roccia per 30 minuti.Quindi, trasferire la larva in una nuova fiala di vetro, sostituire la soluzione di arresto con quattro millilitri di soluzione fissante fresca e incubare per un'ora a temperatura ambiente. Per l'imaging, sostituire la soluzione di fissaggio con quattro millilitri di PBST fresco. Dopo un'incubazione di 10 minuti su un bilanciere, trasferire la larva in una piastra a sei pozzetti, quindi sostituire il PBST con quattro millilitri di PBST fresco e scuotere nuovamente la piastra per 10 minuti.Quindi, aggiungere tre millilitri di glicerolo al 50% in PBST e roccia per 10 minuti, quindi, utilizzando un microscopio di dissezione, visualizzare la larva direttamente nella piastra a sei pozzetti. Questo protocollo di ibridazione in situ etichetta efficacemente le cellule progenitrici renali e varie strutture di nefrone utilizzando lo sviluppo di mesonefro. Il nefrone mesonefrico iniziale si forma a circa 5,2 millimetri dorsale al pronephros.Gruppi di cellule progenitrici sono presenti durante lo sviluppo di mesonefros oltre alle singole cellule progenitrici. Nei giovani più grandi, la colorazione di fondo può verificarsi nei somiti. Nel complesso, questo metodo può essere utilizzato per studiare altri tessuti che si formano durante la metamorfosi, oltre agli organi adulti sezionati.

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Sul posto Ibridazione in larve di zebrafish e giovani durante lo sviluppo di Mesonephros

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