Name: Meccanobiologia completamente ottica Interrogazione di proteine associate al sì nel cancro umano e nelle cellule normali utilizzando un sistema multifunzionale (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 55 s
Description: Scopri la meccanobiologia completamente ottica per analizzare la sensibilità meccanica della proteina YAP in cellule umane. Questo protocollo automatizzato consente imaging multicanale a lungo termine con correzione del drift.

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Questo progetto è sostenuto finanziariamente dal Cancer Pilot Award dell'UF Health Cancer Center (X. T. e D. S.) e dal Gatorade Award Start-up Package (X. T.). Gli autori apprezzano sinceramente le discussioni intellettuali e i supporti tecnici del Dr. Jonathan Licht (UFHCC), Dr. Rolf Renne (UFHCC), Dr. Ji-Hyun Lee (Biostatistica, UF), Dr. Hugh Fan (MAE, UF), Dr. Warren Dixon (MAE, UF), Dr. Ghatu Subhash (MAE, UF), Dr. Mark Sheplak (MAE & ECE, UF), Dr. Malisa Sarntinoranont (MAE, UF), Dr. Scott Banks (MAE, UF), Dr. Matthew Traum (MAE, UF), Dr. David Hahn (Università dell'Arizona), Dr. Weihong Wang (Oracle Corporation), Dr. Youhua Tan (Hong Kong Polytechnic University) e il team di supporto di Nikon (Drs. Jose Serrano-Velez, Larry Kordon e Jon Ekman). Gli autori sono profondamente grati per il generoso ed efficace sostegno da parte di tutti i membri dei laboratori di ricerca di Tang, Siemann e Guan e di tutti i membri dello staff dei dipartimenti MAE & ECE & Physics & Radiation Oncology, UF.

<ol><li>Werley, C., Boccardo, S., Rigamonti, A., Hansson, E., Cohen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+optical+sensors+in+arrayed+islands+of+cells+for+multimodal+recordings+of+cellular+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Multiplexed optical sensors in arrayed islands of cells for multimodal recordings of cellular physiology.</a> Nature Communications. 11 (1), 3881(2020).</li>
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<li>Wang, W., Kim, C. K., Ting, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+tools+for+imaging+and+recording+neuronal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Molecular tools for imaging and recording neuronal activity.</a> Nature Chemical Biology. 15 (2), 101-110 (2019).</li>
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<li>Carpenter, A. E., Kamentsky, L., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+call+for+bioimaging+software+usability%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A call for bioimaging software usability.</a> Nature Methods. 9 (7), 666-670 (2012).</li>
<li>Skylaki, S., Hilsenbeck, O., Schroeder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+in+long-term+imaging+and+quantification+of+single-cell+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Challenges in long-term imaging and quantification of single-cell dynamics.</a> Nature Biotechnology. 34 (11), 1137-1144 (2016).</li>
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<li>Edelstein, A., Amodaj, N., Hoover, K., Vale, R., Stuurman, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computer+control+of+microscopes+using+manager%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Computer control of microscopes using manager.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 92 (1), 14-20 (2010).</li>
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<li>Guimarães, C. F., Gasperini, L., Marques, A. P., Reis, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+stiffness+of+living+tissues+and+its+implications+for+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Materials%22%5BJournal%5D)">The stiffness of living tissues and its implications for tissue engineering.</a> Nature Reviews Materials. 5, 351-370 (2020).</li>
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<li>Bajaj, P., Tang, X., Saif, T. A., Bashir, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stiffness+of+the+substrate+influences+the+phenotype+of+embryonic+chicken+cardiac+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Materials+Research.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Stiffness of the substrate influences the phenotype of embryonic chicken cardiac myocytes.</a> Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 95 (4), 1261-1269 (2010).</li>
<li>Temples, M. N., Adjei, I. M., Nimocks, P. M., Djeu, J., Sharma, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+three-dimensional+tumor+models+to+study+natural+killer+cell+suppression%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Biomaterials+Science+%26+Engineering%22%5BJournal%5D)">Engineered three-dimensional tumor models to study natural killer cell suppression.</a> ACS Biomaterials Science & Engineering. 6 (7), 4179-4199 (2020).</li>
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<li>Guan, J., Liu, H., Shi, X., Feng, S., Huang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+multiple+genomic+elements+using+correlative+CRISPR+imaging+and+sequential+DNA+FISH%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Tracking multiple genomic elements using correlative CRISPR imaging and sequential DNA FISH.</a> Biophysical Journal. 112 (6), 1077-1084 (2017).</li>
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<li>Martiel, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+cell+traction+forces+with+ImageJ%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Measurement of cell traction forces with ImageJ.</a> Methods in Cell Biology. 125, 269-287 (2015).</li>
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<li>Panciera, T., Azzolin, L., Cordenonsi, M., Piccolo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanobiology+of+YAP+and+TAZ+in+physiology+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Mechanobiology of YAP and TAZ in physiology and disease.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (12), 758-770 (2017).</li>
<li>Yuan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yes-associated+protein+%28YAP%29+functions+as+a+tumor+suppressor+in+breast%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Yes-associated protein (YAP) functions as a tumor suppressor in breast.</a> Cell Death and Differentiation. 15 (11), 1752-1759 (2008).</li>
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<li>Lee, J., Abdeen, A. A., Tang, X., Saif, T. A., Kilian, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Geometric+guidance+of+integrin+mediated+traction+stress+during+stem+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Geometric guidance of integrin mediated traction stress during stem cell differentiation.</a> Biomaterials. 69, 174-183 (2015).</li>
<li>Lee, J., Abdeen, A., Tang, X., Saif, T. A., Kilian, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+directed+adipogenesis+and+neurogenesis+of+mesenchymal+stem+cells+derived+from+adipose+tissue+and+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Matrix directed adipogenesis and neurogenesis of mesenchymal stem cells derived from adipose tissue and bone marrow.</a> Acta Biomaterialia. 42, 46-55 (2016).</li>
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<li>Rape, A., Guo, W. H., Wang, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+regulation+of+traction+force+in+relation+to+cell+shape+and+focal+adhesions%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The regulation of traction force in relation to cell shape and focal adhesions.</a> Biomaterials. 32 (8), 2043-2051 (2011).</li>
<li>Shiu, J. Y., Aires, L., Lin, Z., Vogel, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanopillar+force+measurements+reveal+actin-cap-mediated+YAP+mechanotransduction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Nanopillar force measurements reveal actin-cap-mediated YAP mechanotransduction.</a> Nature Cell Biology. 20 (3), 262-271 (2018).</li>
<li>Fracchia, A., Asraf, T., Salmon-Divon, M., Gerlitz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+lamin+B1+levels+promote+cell+migration+by+altering+perinuclear+actin+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Increased lamin B1 levels promote cell migration by altering perinuclear actin organization.</a> Cells. 9 (10), 2161(2020).</li>
<li>Ramdas, N. M., Shivashankar, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoskeletal+control+of+nuclear+morphology+and+chromatin+o1rganization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Cytoskeletal control of nuclear morphology and chromatin o1rganization.</a> Journal of Molecular Biology. 427 (3), 695-706 (2015).</li>
<li>Khatau, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+perinuclear+actin+cap+regulates+nuclear+shape%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A perinuclear actin cap regulates nuclear shape.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (45), 19017-19022 (2009).</li>
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Non ci sono conflitti di interesse da dichiarare.

Il processo di imaging (fase 6.3) è fondamentale per garantire che le immagini di fluorescenza siano di qualità sufficientemente buona da produrre risultati di quantificazione validi. Le immagini z-stack di proteine fluorescenti o perline dovrebbero avere un intervallo z abbastanza grande da includere le immagini a fuoco per tutte le posizioni Z su cui si estende il campione. Un altro passo critico è la raccolta delle immagini di riferimento delle perle fluorescenti dopo aver sciolto le cellule (fase 6.5). Poiché le immagini di riferimento devono essere prese nelle stesse posizioni nel passaggio 6.3, non deve essere indotto alcuno spostamento relativo tra la capsula di Petri, la camera d'ambiente e il microscopio. Gli investigatori che eseguono la fase di dissoluzione devono fare attenzione a rimuovere il coperchio della capsula di Petri e assicurarsi che la perturbazione meccanica applicata non sia abbastanza grande da alterare la posizione del piatto nella camera dell'ambiente.
Di seguito vengono fornite soluzioni per risolvere alcuni errori che potrebbero verificarsi durante gli esperimenti. Se nessuna macro viene attivata dopo aver fatto clic su Invio nel passaggio 6.4, è molto probabile che l'area inferiore sinistra dello schermo sia occupata da una finestra non Elemento. In tal caso, l'area inferiore sinistra della finestra deve essere deselezionata in modo che le macro possano essere attivate in Elements. Un altro errore comune è che le immagini a campo luminoso appaiono nere. Questo problema è causato da un intervallo di tempo insufficiente tra le acquisizioni di immagini a fluorescenza e in campo luminoso. Lievi ritardi nel conteggio del tempo di imaging a fluorescenza possono accumularsi nel tempo e causare notevoli ritardi e interferire con l'imaging a campo luminoso. Una soluzione consiste nel regolare la durata di un ciclo di imaging di tutte le posizioni in modo che sia inferiore (non uguale a) l'intervallo di tempo tra l'inizio di movimenti consecutivi. Questa operazione aggiorna il conteggio del tempo ed elimina l'errore cumulativo all'inizio di ogni ciclo di imaging.
Questa tecnologia di interrogazione completamente ottica supporta (1) una vasta gamma di hardware / software, inclusi ma non limitati a Nikon, (2) diversi tipi di sistemi idrogel convalidati, tra cui gelatina, PEG, Matrigel e gel di collagene I, e (3) la personalizzazione programmabile in base alle diverse esigenze dei ricercatori. Tuttavia, se una qualsiasi delle funzioni di controllo di livello inferiore non è disponibile da un microscopio commerciale, la personalizzazione delle funzioni utilizzando AMFIP diventa difficile. Un'altra limitazione di questa tecnica è la deriva spaziale del campione sia nel piano XY che in quello di messa a fuoco (Z). Sebbene questa limitazione possa essere superata durante la post-elaborazione delle immagini, è essenziale migliorare la funzione di messa a fuoco automatica per correggere la deriva in tempo reale dei campioni. Questo miglioramento aumenterà la produttività del processo di imaging e ridurrà il potenziale errore causato dalla deriva durante gli esperimenti.
I meccanotroduttori, come YAP, possono servire come nuovi bersagli terapeutici per lo sviluppo di promettenti terapie antitumorali25,26,27. Dati emergenti suggeriscono che YAP promuove la proliferazione e l'invasione delle cellule tumorali. La traslocazione YAP indotta dalla meccanica dal citoplasma al nucleo attiva la trascrizione dei geni relativi alla migrazione cellulare, alla proliferazione, all'invasione e all'apoptosi, portando a comportamenti cellulari aberranti28,29,30,31. Questo lavoro mirava a esplorare la potenziale correlazione del rapporto YAP N / C e della meccanica cellulare in due tipiche carcinoma polmonare umano e linee cellulari normali. Durante il periodo di diffusione cellulare di 10 ore, le cellule PC9 mostrano concentrazioni yap simili nel nucleo e nel citoplasma (Figura 3D e Figura 5A). Le cellule B2B mostrano una concentrazione di YAP più elevata nel nucleo rispetto al citoplasma (Figura 3C e Figura 5A). Questa relazione trovata durante la fase di diffusione precoce è diversa dalla maggior parte dei risultati pubblicati che confrontano la concentrazione di YAP nel nucleo tra cellule normali e tumorali. Sebbene non necessariamente nella fase di diffusione precoce, la maggior parte dei risultati pubblicati mostra che YAP è più concentrato nel nucleo delle cellule tumorali che nel nucleo delle cellule normali27,28. Solo uno studio sul cancro al seno ha riportato un'eccezione32 che mostra che YAP è più concentrato nel citoplasma, che concorda con le nostre attuali osservazioni fatte nelle cellule PC9 del cancro del polmone. Per quanto a conoscenza degli autori, questo lavoro è il primo a mostrare un rapporto YAP N / C più basso in una linea cellulare di cancro del polmone umano. Gli autori ipotizzano che la ragione di un rapporto YAP N/C stabile nelle cellule PC9 potrebbe essere dovuta alla bassa variazione nell'area di diffusione cellulare/nucleo e alla trazione nelle cellule PC9 nella fase iniziale di diffusione. La dissezione dei meccanismi molecolari alla base del basso rapporto YAP N/C nelle cellule PC9 e B2B è in corso.
Durante le prime 10 ore di diffusione, queste due linee cellulari mostrano una relazione distinta tra il rapporto YAP N/C, la trazione cellulare e l'area di diffusione (Figura 5). Per le cellule B2B, un rapporto YAP N/C più elevato è correlato con un'area di diffusione cellulare e del nucleo più elevata (Figura 6A,B), che è coerente con i dati riportati di altre cellule normali33. È interessante notare che, sebbene la tendenza allo sviluppo di questa relazione si trovi generalmente in tutte le cellule B2B registrate, si trovano due diversi gradi (alto e basso) di questa relazione. Le cellule B2B che si diffondono e migrano simultaneamente mostrano una trazione inferiore e un'area di diffusione cellulare e nucleo più elevata con un rapporto YAP N / C più elevato (2,05 ± 0,32). Per le cellule B2B che si diffondono e rimangono nella stessa posizione, mostrano una maggiore trazione e un'area di diffusione cellulare e nucleo più bassa con un rapporto YAP N / C inferiore (1,74 ± 0,21). Questi due gradi di relazioni sono dimostrati nei gruppi di dati sparsi biforcati (Figura 6C,D). Come riportato in letteratura, le cellule normali stazionarie, come le cellule embrionali del fibroblasto NIH 3T3, hanno una trazione maggiore rispetto alle cellule migratorie34. I dati riportati in questo documento suggeriscono che le cellule B2B che si diffondono e non migrano hanno applicato una trazione più elevata rispetto alla diffusione e alla migrazione delle cellule B2B, suggerendo probabilmente che è necessaria un'elevata trazione affinché le cellule non migratorie si stabilizzino sul substrato.
Inoltre, questi dati mostrano che le cellule B2B normali stazionarie generano una forza perinucleare più elevata, mentre ricerche precedenti condotte da altri ricercatori hanno riportato solo una maggiore trazione cellulare generata alla periferia delle cellule stazionarie34,35,36,37. Gli autori pensano che la differenza nella tendenza intrinseca della migrazione negli esperimenti potrebbe causare questi risultati contraddittori. Negli esperimenti pubblicati, il micropatterning di forma quadrata era stato utilizzato per confinare le singole cellule dalla diffusione e inibire la migrazione; non si sa se le cellule avessero la tendenza a migrare. Poiché le cellule migratorie mostrano spesso un'elevata forza di trazione alla periferia delle cellule38, è probabile che le cellule con la tendenza a migrare manterranno comunque un'elevata trazione periferica anche se la loro migrazione è limitata. In questo studio, le cellule stazionarie non sono limitate da alcun micropattern ma non migrano, indicando che le cellule tendono a mantenere il loro stato non migratorio. Un'altra possibilità è che la forma cellulare definita dal micropattern possa influenzare la distribuzione delle aderenze focali e delle forze di trazione39. I risultati di questo studio sono stati generati senza alcun micropatterning confinante e rappresentano la distribuzione della forza delle cellule stazionarie nella loro forma originale.
Per quanto a conoscenza degli autori, solo una pubblicazione fino ad oggi ha riportato specificamente la scoperta di forze perinucleari in cellule normali (fibroblasti embrionali di topo), potenzialmente causate dal cappuccio di actina che si estende attraverso il nucleo40. La traslocazione del citoplasma-nucleo YAP è correlata con l'aumento della forza perinucleare40. Una ricerca approfondita della letteratura pertinente non ha prodotto alcuna pubblicazione che riporti una forza perinucleare o il cappuccio di actina nelle cellule tumorali. Uno studio indiretto sulle cellule tumorali del melanoma ha dimostrato che il bordo dell'actina (un'altra organizzazione di actina perinucleare situata intorno ma che non copre il nucleo) riduce i tassi di migrazione cellulare41, suggerendo indirettamente l'esistenza di una forza perinucleare. Tuttavia, non sono riportati dati sperimentali diretti. In questo studio, gli autori hanno scoperto che sia le cellule PC9 che B2B mostrano spostamento e trazione perinucleari. I meccanismi della generazione delle forze perinucleari e i loro effetti rimangono controversi. Nelle cellule normali, è stato riportato che il cappuccio di actina svolge un ruolo nella regolazione della morfologia del nucleo e dell'organizzazione della cromatina42, trasmettendo segnali meccanici dalle aderenze focali nel nucleo attraverso i linker del complesso nucleoscheletro e citoscheletro (LINC)43 e regolando la migrazione cellulare44. Lamin A/C è correlata alla formazione e all'interruzione del cappuccio di actina40,41,42,43,44. Tuttavia, il rapporto che affermava che il cappuccio di actina genera una forza perinucleare non considerava il ruolo potenziale dell'actina rim40. Nelle cellule tumorali, la sovraespressione di Lamin A facilita la formazione di un bordo di actina e limita la migrazione delle cellule tumorali. La sovraespressione di Lamin B riduce la formazione di actin rim e favorisce la migrazione. La forza perinucleare potrebbe essere coinvolta in questo processo a causa dell'esistenza di un'organizzazione di actina perinucleare e dell'effetto di Lamin A. Tuttavia, i risultati di questo studio non hanno mostrato alcuna evidenza di forze perinucleari misurate o del comportamento del cappuccio di actina. Pertanto, la scoperta di forze peri-nucleari nelle cellule PC9 in questo presente studio è il primo rapporto che mostra forze peri-nucleari e spostamenti nelle cellule tumorali polmonari. Gli autori stanno attualmente studiando i meccanismi molecolari e le funzioni delle forze perinucleari nelle cellule PC9 e B2B ingegnerizzate CRISPR / Cas9.
Oltre all'interrogazione di meccanobiologia completamente ottica che è dimostrata in questo articolo, il sistema multifunzionale integrato può essere applicato per sondare otticamente una miriade di altri segnali fisiologici e patobiologici essenziali nei sistemi viventi. Ad esempio, il laboratorio degli autori ha recentemente stabilito più linee cellulari tumorali umane stabilmente trasdotte che co-esprimono tre proteine di membrana sensibili alla luce: indicatore di tensione di membrana QuasAr2 (eccitazione: 640 nm; emissione: 660 nm-740 nm), depolarizzatore di tensione di membrana CheRiff (eccitazione: 488 nm) e iperpolarizzatore di tensione di membrana eNpHR3 (eccitazione: 590 nm). Queste tre proteine funzionali possono essere attivate da linee laser ortogonali a spettro in modo privo di diafonia, consentendo comunicazioni di segnalazione bidirezionali completamente ottiche (lettura e controllo) dell'elettrofisiologia a membrana. Utilizzando un sistema optoelettronico integrato e un patch-clamp manuale, gli autori hanno convalidato il controllo completamente ottico e la lettura della tensione di membrana (Vm) in singole cellule tumorali umane e sferoidi tumorali multicellulari. L'interrogazione di elettrofisiologia completamente ottica apre la possibilità di esplorazioni dettagliate della bioelettricità precedentemente inaccessibile nelle cellule tumorali, che possono aiutare a far progredire la biologia tumorale da un nuovo asse.

L'obiettivo generale di questo metodo è quello di consentire l'imaging multifunzionale completamente ottico e l'analisi delle cellule viventi. Un programma di imaging all-in-one che consente il coordinamento automatico di dispositivi optoelettronici multifunzionali ridurrà le operazioni manuali ad alta intensità di lavoro e soggette a errori ed è essenziale per i ricercatori per condurre l'imaging a cellule vive a lungo termine1,2,3,4. Tuttavia, la maggior parte dei programmi pubblici esistenti nella comunità di ricerca biomedica si applicano solo a dispositivi optoelettronici limitati o richiedono hardware aggiuntivo per il coordinamento di apparecchiature diverse5,6,7,8,9. Recentemente, è stato sviluppato un programma open source e basato su software, intitolato "Automatic Multi-functional Integration Program (AMFIP)", che consente l'imaging multicanale e time-lapse. Basato sul linguaggio Java e sull'Application Programming Interface (API) di μManager11,12, AMFIP è stato sviluppato come plugin in μManager che esegue script Java personalizzati per realizzare comunicazioni basate su software di più piattaforme hardware e software optoelettroniche, incluse ma non limitate a quelle di Nikon. L'istituzione di AMFIP apre la possibilità di interrogazioni programmabili e multifunzionali dei comportamenti cellulari. In questo articolo viene sviluppato un sistema sperimentale e computazionale integrato che combina AMFIP con l'analisi di imaging digitale e la microscopia della forza di trazione cellulare. Il sistema consente di chiarire la distinta meccanobiologia YAP nelle linee cellulari B2B normali umane (Figura 1) e PC9 (Figura 2) progettate da CRISPR/Cas9. Il sistema fornisce alla comunità scientifica una soluzione completa che evita la richiesta di acquistare dispositivi di controllo aggiuntivi che potrebbero non essere disponibili e/o compatibili con ogni sistema di imaging.
I protocolli presentati in questo documento introducono come (1) applicare AMFIP per condurre l'imaging automatico a lungo termine per entrambe le linee cellulari ingegnerizzate CRISPR / Cas9 che esprimono YAP con tag mNEonGreen2; e (2) combinare Fiji ImageJ, MATLAB e Origin per l'analisi quantitativa del rapporto YAP nucleare/citoplasma (N/C) in base alla loro intensità fluorescente (Figura 3 e Figura 4), campo di spostamento cellulare (Figura 1C e Figura 2C) e campo di trazione cellulare (Figura 1D e Figura 2D) ). I risultati suggeriscono che (1) durante le prime 10 ore di diffusione cellulare sui substrati che hanno rigidità meccanica fisiologicamente rilevante13,14,15,16,17,18, il rapporto YAP N/C delle singole cellule B2B mostra variazioni e fluttuazioni dipendenti dal tempo più evidenti rispetto a quelle delle singole cellule PC9 (Figura 5 e Figura 6 ); e (2) le cellule tumorali PC9 generano una notevole trazione nelle loro regioni perinucleari (Figura 7). Il sistema integrato e le metodologie descritte in questo protocollo trascendono i tipi specifici di cellule e molecole optogenetiche. I ricercatori possono applicare i protocolli per personalizzare i loro specifici esperimenti di interrogazione di cellule vive e chiarire le dinamiche di segnalazione sfaccettate nel contesto della fisiologia e della patologia cellulare.

<table><tbody><tr><td>(3-Aminopropil)trietossisilano</td><td>Sigma-aldrich</td><td>440140</td><td></td></tr><tr><td>0,05 % Tripsina</td><td>Corning</td><td>25-051-CI</td><td></td></tr><tr><td>75 cm2 pallone</td><td>Corning</td><td>430641U</td><td></td></tr><tr><td>8 Centrifuga da banco</td><td>Thermo</td><td>75007210</td><td></td></tr><tr><td>A1R sistema confocale</td><td>Nikon</td><td>HD25</td><td></td></tr><tr><td>Acido</td> <td>aceticoSigma-aldrich</td><td>695092</td><td>glaciale, reagente ACS, &ge; 99,7%</td></tr><tr><td>Cellule BEAS-2B (B2B)</td><td>Sigma-aldrich</td><td>95102433</td><td>cellule epiteliali umane da tessuto polmonare</td></tr><tr><td>Microsfere modificate con carbossilati</td><td>Invitrogen</td><td>F8797</td><td></td></tr><tr><td>Terreno di coltura (RPMI-1640)</td><td>Computer desktop Gibco</td><td>11875093</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Dell</td><td>2018</td><td>con sistema operativo Windows 10</td></tr><tr><td>Camera climatica TIZB</td><td>Tokai Hit</td><td>TIZB</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino (FBS)</td><td>Gibco</td><td>26140</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectina Proteina umana, Plasma</td><td>Gibco</td><td>33016015</td><td></td></tr><tr><td>Fiji ImageJ</td><td>National Institutes of Health e il Laboratorio per la strumentazione ottica e computazionale</td><td>1.53k</td><td></td></tr><tr><td>Piastra di Petri con fondo in vetro</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td></td></tr><tr><td>HEPES tamponato soluzione salina</td><td>Sigma-aldrich</td><td>51558</td><td></td></tr><tr><td>soluzione idrato di idrazina</td><td>Sigma-aldrich</td><td>53847</td><td></td></tr><tr><td>IntelliJ IDEA</td><td>JetBrains</td><td>2020</td><td>Piattaforma di sviluppo Java</td></tr><tr><td>Kit di sviluppo Java</td><td>Oracle</td><td>14.0</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipe</td><td>Kimtech Science</td><td>3066-05</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks</td><td>2020b</td><td></td></tr><tr><td>Monocromatico&nbsp; Telecamera</td><td>FLIR</td><td>BFS-U3-70S7M-C</td><td></td></tr><tr><td>Kit di rilevamento del micoplasma MycoAlert</td><td>Lonza</td><td>LT07-218</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione N,N&prime;-Methylenebisacrylamide</td><td>Sigma-aldrich</td><td>M1533</td><td></td></tr><tr><td>Piattaforma software NIS-Elements</td><td>Piattaforma software</td><td>Nikon</td><td>4.50</td></tr><tr><td>Origin</td><td>OriginLab</td><td>OriginPro 2017 (Learning Edition)</td><td>analisi dei dati e software grafico</td></tr><tr><td>Penicillina-streptomicina</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>cellule PC9</td><td>Sigma-aldrich</td><td>90071810</td><td>cellule di adenocarcinoma umano&nbsp; da tessuto polmonare</td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Phusion DNA polimerasi ad alta fedeltà</td><td>New England Biolabs</td><td>&nbsp; F-553S</td> Nastro adesivo ad <td>alta fedeltà DNA polimerasi</td></tr><tr><td>Nastro</td><td>adesivo</td><td>scozzese</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di sodio dodecil solfato</td><td>Sigma-aldrich</td><td>05030</td><td></td></tr><tr><td>Super colla</td><td>Gorilla</td><td></td><td>cianoacrilato</td></tr><tr><td>Colla Ti2-E Microscopio invertito</td><td>Nikon</td><td>MEA54000</td><td></td></tr><tr><td>TI2-S-SE-E Tavolino motorizzato con encoder</td><td>Nikon</td><td>MEC56120</td><td></td></tr><tr><td>&mu; Software</td><td>di microscopia open source</td> <td>gamma versione 2.0</td> Manager <td></td> (https://micro-manager.org/)</tr></tbody></table>

meccanobiologia completamente ottica interrogazione di proteine associate al sì nel cancro umano e nelle cellule normali utilizzando un sistema multifunzionale

All-optical Mechanobiology Interrogation of Yes-associated Protein in Human Cancer and Normal Cells using a Multi-functional System

L'imaging multifunzionale a lungo termine e l'analisi delle cellule vive richiedono un coordinamento funzionale semplificato di varie piattaforme hardware e software. Tuttavia, il controllo manuale di varie apparecchiature prodotte da diversi produttori richiede molto lavoro e molto tempo, riducendo potenzialmente l'accuratezza, la riproducibilità e la qualità dei dati acquisiti. Pertanto, un sistema all-in-one e programmabile dall'utente che consente l'acquisizione automatica, multifunzionale e a lungo termine ed è compatibile con la maggior parte delle piattaforme di microscopia fluorescente può avvantaggiare la comunità scientifica. Questo documento introduce i protocolli operativi completi dell'utilizzo di un nuovo sistema software integrato che consiste in (1) un programma software costruito in casa, intitolato "Automatic Multi-functional Integration Program (AMFIP)", che consente l'acquisizione automatica di immagini multicanale e (2) una suite di analisi di imaging quantitativo e pacchetti di calcolo della trazione cellulare. 
Questo sistema integrato viene applicato per rivelare la relazione precedentemente sconosciuta tra la distribuzione spazio-temporale della proteina associata al sì meccano-sensibile (YAP) e la meccanica cellulare, compresa la diffusione e la trazione cellulare, nelle cellule normali umane (B2B) ingegnerizzate CRISPR / Cas9 e nelle cellule tumorali polmonari (PC9). Sfruttando la capacità di questo sistema di controllo e lettura multicanale, il risultato mostra: (1) le cellule normali B2B e le cellule tumorali PC9 mostrano una relazione distinta tra espressione YAP, trazione e dinamica cellulare durante i processi di diffusione e migrazione cellulare; e (2) le cellule tumorali PC9 applicano evidenti forze perinucleari sui substrati. In sintesi, questo documento presenta un protocollo graduale dettagliato su come utilizzare un sistema integrato programmabile dall'utente che consente l'imaging e l'analisi multifunzionali automatici per chiarire la meccanosensibilità YAP. Questi strumenti aprono la possibilità di esplorazioni dettagliate di dinamiche di segnalazione sfaccettate nel contesto della fisiologia e della patologia cellulare.

Questo documento presenta un protocollo graduale dettagliato su come utilizzare un sistema integrato multifunzionale e programmabile dall'utente che consente l'imaging multicanale automatico e l'analisi meccanobiologica per chiarire la meccanosensibilità della proteina associata al Sì (YAP).

Meccanobiologia completamente ottica Interrogazione di proteine associate al sì nel cancro umano e nelle cellule normali utilizzando un sistema multifunzionale

Long-term multi-functional imaging and analysis of live cells require streamlined, functional coordination of various hardware and software platforms. ...

Questo metodo aiuterà a illustrare i meccanismi molecolari di un fenomeno biologico sfaccettato. Come la meccanobiologia, l'elettrofisiologia ottica e l'imaging proteico DNA / RNA a super-risoluzione utilizzando tecniche automatiche di imaging di cellule vive. Questo protocollo consente l'acquisizione automatica, multifunzionale, ad alto throughput, auto-drift correcting e a lungo termine.È compatibile con la maggior parte delle piattaforme microscopiche fluorescenti, come NYCOM. Chiunque provi questa tecnica per la prima volta dovrebbe capire la funzione di ogni passaggio, invece di seguire solo rigorosamente il protocollo, per garantire un esperimento di successo. Iniziare posizionando la camera ambientale sullo stadio motorizzato del microscopio invertito.Impostare la portata di CO2 a 160 millilitri al minuto e regolare la temperatura della camera. Quindi aggiungere 40 millilitri di acqua purificata nel bagno della camera. Estrarre la capsula di Petri con fondo di vetro con le cellule dell'incubatrice e posizionarla nella camera dell'ambiente.Accendere il controller confocale e il microscopio invertito. Cambiare il percorso della luce a destra. Osservare le celle che si attaccano utilizzando Micro Manager.Se al gel sono state attaccate cellule sufficienti, trasferire la capsula di Petri all'incubatrice. In caso contrario, continuare l'incubazione cellulare per altri 30 minuti per B2B e 60 minuti per il cancro del polmone o le cellule PC-9. Tagliare 2 piccoli pezzi di nastro adesivo e incollarli sulla camera attorno al foro circolare.Quindi applicare un po 'di colla adesiva sull'area del nastro che la capsula di Petri coprirà. Estrarre la capsula di Petri dall'incubatrice. Posizionare lentamente la capsula di Petri nella camera e lasciare che il fondo del piatto entri in contatto con la colla.Premere il coperchio della capsula di Petri per 1 minuto per consentire alla colla di entrare in pieno contatto con la capsula di Petri e solidificare. Spingere delicatamente la capsula di Petri orizzontalmente per assicurarsi che la colla si sia solidificata e che la piastra di Petri non si muova. Quindi chiudere il coperchio della camera.Aprire IntelliJ e impostare un parametro T1 nella riga 93 del file elements_script.java. Assicurarsi che questo valore sia maggiore del tempo di esecuzione della macro e degli elementi utilizzati per l'imaging confocale di un campo visivo. Fare clic sul pulsante Esegui per avviare il progetto AMFIP IntelliJ.Fare clic sul pulsante live e multi-deacquisition sull'interfaccia principale di Micro Manager, quindi spostare il percorso della luce del microscopio invertito a destra per l'imaging in campo luminoso. Passare all'obiettivo 10 volte e aprire la luce LED con l'intensità impostata al 5% Fare clic sull'obiettivo del microscopio del percorso luminoso e sul pulsante della lampada a LED nel pannello ti2 degli elementi. Regolare il joystick XY e la manopola del piano Z per trovare la posizione corretta e il piano di messa a fuoco del gel sulla capsula di Petri.Utilizzare l'obiettivo 10 volte per trovare i campi visivi appropriati di più singole cellule attaccate al gel. Selezionare la casella XY a più posizioni nella finestra di acquisizione multidimensionale. Fare clic sul pulsante Modifica elenco posizioni e osservare la finestra dell'elenco delle posizioni dello stage che viene visualizzata.Modificare l'obiettivo a 40 volte, aumentare l'intensità della luce LED al 15% Riadattare lo stadio motorizzato XY per individuare i campi visivi e registrare le coordinate facendo clic sul pulsante di marcatura nella finestra dell'elenco delle posizioni dello stage. Registra da 6 a 7 campi visivi desiderati. Fare clic sul pulsante Salva con nome nella finestra dell'elenco delle posizioni dello stage per registrare le coordinate e immettere T1 come sezione dell'intervallo di tempo dell'acquisizione dell'immagine su T1 nella sezione del punto temporale nella finestra di acquisizione multidimensionale.Aprite gli elementi, cambiate il percorso della luce verso destra per l'imaging confocale e spegnete la luce a LED. Quindi fare clic sul pulsante rimuovi interblocco e attivare il canale laser FITC per l'imaging YAP selezionando la casella FITC. Dopo aver regolato la velocità di scansione a 1 fotogramma per 2 secondi, ruotare la manopola del piano Z per trovare rapidamente la posizione Z delle celle collegate.Registrare i limiti inferiore e superiore per lo stack Z. Fare clic sulla macro sulla barra multifunzione in alto, selezionare l'editor macro nel menu a discesa macro e immettere i limiti inferiore e superiore per lo stack Z in un file macro. Attivare il canale laser DAPI per l'imaging delle perline selezionando la casella DAPI per trovare e registrare la posizione Z focalizzata delle perline.Vai all'editor di macro e inserisci i valori registrati nel file macro. Per impostare il compito di spostare lo stadio motorizzato utilizzando AMFIP, vai su Micro Manager, fai clic su automazione plug-in per aprire l'interfaccia utente grafica di AMFIP. Quindi fare clic sui pulsanti Aggiungi punto o Rimuovi punto per acquisire il numero esatto di campi visivi selezionati.Inserite le coordinate registrate dei campi visivi nel pannello delle coordinate. Definire il tempo totale dell'esperimento nel campo di testo Tempo totale dell'esperimento. Fare clic sul pulsante di configurazione del tempo aggiuntivo e definire l'intervallo di tempo T2 per spostare lo stadio motorizzato su ciascun FOV.Ingrandisci le dimensioni della finestra degli elementi e trascina la GUI di AMFIP sul lato destro dello schermo per evitare che la GUI disturbi le operazioni automatiche del cursore e quindi fai clic sul pulsante Invio. Al termine della prima macro. fare clic sul pulsante Acquisisci nella finestra di acquisizione multidimensionale.Dopo aver completato l'imaging a lungo termine, interrompere l'attività AMFIP facendo clic sul pulsante di pausa nella finestra del plug-in di automazione e sul pulsante di arresto nella finestra di acquisizione multidimensionale. Apri gli elementi e imposta l'imaging dello stack Z facendo clic sui pulsanti superiore e inferiore nella finestra di acquisizione ND. Cambiare il percorso della luce a destra e aprire la luce a LED.Rimuovere lentamente e con attenzione i coperchi della camera e della capsula di Petri mentre si monitora la vista del campo luminoso per qualsiasi deriva del campo visivo. Utilizzare una pipetta di plastica per assorbire 0,5 millilitri di soluzione SDS. Tenere con attenzione la pipetta di plastica un po 'sopra il terreno di coltura nella capsula di Petri e aggiungere da 1 a 2 goccioline della soluzione SDS nel terreno di coltura.Una volta dissolte le celle e la vista del campo luminoso, chiudere la luce a LED, cambiare il percorso della luce a sinistra, fare clic sul pulsante rimuovi interblocco. Eseguire l'imaging dello stack Z e salvare lo stack di immagini come reference_N, dove N è il numero di sequenza di ciascun campo visivo. Fare clic sul pulsante XY a più posizioni nella finestra di acquisizione multidimensionale.Quindi selezionare il campo visivo successivo e fare clic sul pulsante go-to per spostare lo stadio motorizzato sul secondo FOV. Ripetere questo passaggio per ogni campo visivo. La localizzazione nucleare è di proteina associata a yes o YAP in B2B ells aumentata con l'aumentare della rigidità del substrato, mentre le cellule PC-9 hanno mostrato una concentrazione di YAP simile nel nucleo e nel citoplasma su substrati di rigidità variabile.La cellula B2B ha aumentato monotonamente l'area di diffusione nel tempo, insieme a una diminuzione del rapporto nucleare / citoplasmatico YAP, mentre la cellula PC-9 ha mantenuto un'area di diffusione cellulare relativamente invariata, orientamento e rapporto nucleare YAP / citoplasmatico durante il processo di diffusione di 10 ore. Durante la durata di 10 ore della diffusione precoce, la cellula B2B rappresentativa ha deformato costitutivamente la superficie del substrato e ha applicato la trazione cellulare in evoluzione temporale su tutta l'area cellulare. Al contrario, la cellula PC-9 rappresentativa ha sviluppato solo spostamento e trazione alle 2 estremità del corpo cellulare e la sua trazione è diminuita dopo 7,5 ore.Il rapporto nucleare/citoplasmatico YAP e la trazione di dipolo delle cellule B2B sembravano seguire due tendenze distinte, suggerendo che potrebbero esserci stati due gruppi di cellule B2B che coesistevano nell'esperimento. Nel primo gruppo, il rapporto nucleare/citoplasmatico YAP e la trazione del dipolo sono aumentati insieme all'allargamento dell'area di diffusione cellulare e hanno raggiunto i loro massimi a circa 1.000 micrometri quadrati. Nel secondo gruppo, il rapporto nucleare/citoplasmatico YAP e la trazione del dipolo sono aumentati a un ritmo più lento con l'allargamento dell'area di diffusione cellulare e hanno mantenuto valori quasi costanti quando l'area di diffusione cellulare ha continuato ad aumentare.Le gamme dello stack Z per tutti i canali laser devono essere determinate attentamente per superare la potenziale deriva del campo visivo durante il movimento del palcoscenico nell'imaging a lungo termine. Questa nuova tecnica consente l'imaging automatico, non invasivo a lungo termine e multiposizione e può aiutare a chiarire il meccanismo di biologia molecolare che richiede il monitoraggio temporale e spaziale di cellule e organelli.

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