DUCT: Double Resin Casting seguito da Tomografia Micro-Computerizzata per Analisi 3D del Fegato

Questo metodo ci consente di analizzare, visualizzare e quantificare l'architettura dei sistemi vascolari e biliari del fegato in 3D. Ora possiamo comprendere meglio gli aspetti spaziali della malattia del fegato e della rigenerazione. Il vantaggio principale di questa tecnica è che non si basa sull'esistenza di anticorpi o imaging a fluorescenza.

Consente inoltre la visualizzazione diretta di quali reti sono correttamente lumenizzate. Questo metodo è adatto per l'analisi dei sistemi tubulari, quindi la ricerca di vasi sanguigni, dotti biliari e vie aeree sono aree ideali. Abbiamo usato DUCT per comprendere i cambiamenti strutturali legati alla rigenerazione biliare.

Prima di iniettare resina nel sistema biliare del topo, iniziare a spostare l'intestino e il pancreas sul lato sinistro del topo, utilizzando un batuffolo di cotone bagnato con PBS per esporre il dotto biliare comune e la vena porta. Quindi fare una piccola incisione trasversale nella vena cava inferiore. Capovolgere il lato ventrale del fegato verso il cuore per esporre la superficie viscerale e la regione ilare, e individuare il dotto biliare comune che corre dalla regione ilare attraverso il pancreas e nell'intestino allo sfintere di Oddi.

Utilizzare la pinza diritta per liberare l'area del tessuto circostante di circa cinque millimetri dal dotto biliare comune. Quindi, posizionando un filo di sutura di seta sotto il dotto biliare comune, legare un nodo overhand sciolto attorno al dotto biliare comune. Tenere le forbici a molla piatte contro il dotto biliare comune per fare un'incisione obliqua al dotto biliare comune nel punto in cui il dotto biliare comune entra nel pancreas e nell'intestino accanto allo sfintere di Oddi.

Quindi, mescolare un millilitro della resina gialla con 50 microlitri dell'agente di polimerizzazione MV e riempire una siringa luer da un millilitro con la miscela di agenti polimerizzanti in resina. Collegare la siringa riempita con il set di tubi uno e premere lo stantuffo per riempire il tubo fino a quando la miscela di agenti polimerizzanti in resina gocciola dalla punta del tubo. Utilizzare la pinza per raddrizzare l'area intorno all'incisione del dotto biliare comune.

Prima di inserire il tubo nell'apertura nel dotto biliare comune con il bordo più lungo della punta smussata verso il basso verso il lato dorsale del dotto biliare. Quindi stringere il nodo del filo di seta per fissare il tubo all'interno del dotto biliare comune. Dopo aver iniettato la resina nel dotto biliare comune, osservare la cistifellea e i singoli lobi del fegato.

Massaggiare il fegato con un batuffolo di cotone bagnato pbS per aiutare a diffondere la resina allo stesso modo. I rami terminali dei dotti biliari pieni di resina saranno debolmente visibili sulla superficie del fegato. Interrompere l'iniezione della resina quando appaiono punti di resina sulla superficie del fegato o quando si incontra resistenza.

Quindi rimuovere il tubo estraendo dal dotto biliare comune e stringere rapidamente il nodo di seta usando una pinza per evitare che la resina fuoriesca. Tagliare le estremità sciolte della sutura di seta, in modo che non interferiscano con l'iniezione della vena porta. Prima di iniettare la resina nella vena porta, eliminare la vena porta dal tessuto circostante a circa due centimetri dal suo ingresso nel fegato, usando una pinza diritta.

Quindi posizionare il filo di sutura di seta sotto l'area liberata della vena porta per legare un nodo sciolto. Nella vena porta distale al fegato, fare un'incisione longitudinale prima di legare il nodo. Quindi, preparare la miscela di agenti polimerizzanti in resina verde nella siringa e riempire il tubo con la miscela come dimostrato in precedenza.

Utilizzare la pinza per raddrizzare la vena porta tirando il tessuto circostante verso il lato della coda prima di inserire il tubo con il bordo più lungo della punta smussata verso il lato dorsale del vaso. Stringere il filo di seta per fissare il tubo nella vena porta. Dopo aver iniettato la resina nella vena porta, osservare i vasi sanguigni che si riempiono di resina e massaggiare il fegato con un batuffolo di cotone bagnato PBS per aiutare a diffondere la resina.

Quando tutti i vasi sanguigni sono pieni, estrarre il tubo dalla vena porta e stringere rapidamente il nodo di seta usando una pinza per evitare che la resina fuoriesca. Per la tomografia micro-computerizzata o la scansione MicroCT del fegato sezionato dal topo, posizionare il lobo epatico mediale destro in un tubo conico da 15 millilitri e riempire il tubo con gel di agarosio all'1% a circa due terzi del volume totale del tubo per ridurre al minimo il movimento indesiderato del campione durante la misurazione MicroCT. Montare il tubo conico da 15 millilitri con il campione sullo stadio rotazionale di un dispositivo CT.

Lasciare che il tubo si adatti termicamente alla camera di misura per almeno un'ora. Quando il campione è adattato termicamente, centrarlo nel campo visivo o FOV, quindi ottimizzare le distanze del campione sorgente e del rilevatore di campioni, o SSD e SDD per raggiungere una risoluzione voxel sufficiente. Una volta impostati i parametri, avviare una misurazione CT.

Utilizzare un software di ricostruzione tomografica dedicato per ricostruire i dati CT. Per analizzare i dati CT, caricare i file selezionando file, importa e comando. Utilizzare la funzione di determinazione della superficie sul pannello superiore per segmentare la resina nei dati utilizzando la soglia globale.

Nella finestra di dialogo, determinare il valore di soglia con la valutazione dell'istogramma impostando la posizione della linea di isovalori rossi per segmentare solo i vasi riempiti di resina. Nel pannello di sinistra, selezionare il modulo crea ROI da volume o CAD o mesh per creare una regione di interesse o ROI dei vasi riempiti di resina. Nella finestra di dialogo, utilizzare l'opzione crea ROI da solido per selezionare e confermare il nome del volume elaborato.

Elimina la segmentazione errata dei cluster di rumore nell'area di sfondo di questo ROI. Contrassegna il ROI nel pannello di destra facendo clic con il pulsante destro del mouse e selezionando il ROI diviso del modulo. Nella finestra di dialogo, impostare il parametro voxel del volume minimo per escludere tutte le particelle di rumore.

Il valore del parametro è dipendente dall'esperimento e dai dati e ottimizzato per ogni campione da analizzare. Sul pannello di sinistra utilizzare il modulo di levigatura per creare maschere di canale lisce, continue e solide senza artefatti, come la presenza di bolle d'aria o perdite di resina nel ROI del costo della resina. Creare un ROI separato come descritto in precedenza per il sistema riempito con la resina più assorbente come la resina gialla utilizzata per l'iniezione del dotto biliare comune con valori di intensità più elevati nei dati CT.

Contrassegnare e mascherare in resina il nuovo ROI facendo clic con il pulsante destro del mouse prima di selezionare i ROI di sottrazione e quindi sottrarre il nuovo ROI dal ROI della maschera in resina per creare un nuovo ROI per il sistema tubolare rimanente. Esportare i ROI risultanti per entrambi i sistemi tubolari in vari formati in base ai riferimenti dell'operatore per la successiva elaborazione in diversi software. Elaborare ulteriormente i ROI risultanti in un software di grafica di volume per esportare la visualizzazione finale sotto forma di immagine o video.

In questo studio, è stata ottenuta una doppia iniezione di resina di successo con dotti biliari intraepatici ben riempiti e vascolarizzazione della vena porta. L'analisi rappresentativa illustra il risultato dei dati segmentati da un fegato ben iniettato per un topo P15 e un topo adulto in cui la resina è visibile nei rami laterali. Nel tipico esempio di iniezione non riuscita, il danno fisico al fegato durante la procedura chirurgica ha provocato la fuoriuscita di resina.

Anche l'indurimento prematuro della resina nell'ago o nella punta del tubo prima dell'iniezione e l'insufficiente perfusione transcardica hanno causato il riempimento insufficiente del sistema. La perdita di resina minore potrebbe essere corretta manualmente durante la segmentazione dei dati MicroCT. Un'alta pressione di iniezione potrebbe rompere vasi o condotti e danneggiare irreversibilmente l'architettura del recipiente o del condotto.

Inoltre, le bolle erano un altro artefatto di iniezione molto comune che portava al riempimento sparso delle reti tubolari. Quando è stata utilizzata la resina appena aperta, è stata osservata una chiara differenza nel contrasto tra i dotti biliari iniettati con resina gialla e le vene porta iniettate di resina verde. Dopo tre mesi di conservazione, il contrasto era sufficiente per distinguere la vena porta dal dotto biliare.

Tuttavia, la precipitazione ha influenzato la miscelazione delle due resine, che era visibile come un'opacità eterogenea nella vena porta riempita. Quando la resina era più vecchia di sei mesi, il contrasto si degradava a un punto in cui non era possibile distinguere il dotto biliare iniettato di giallo dalla vena porta iniettata di verde, in base al loro solo contrasto. È fondamentale fare un'incisione obliqua nel dotto biliare comune.

Altrimenti sarà molto difficile inserire il tubo. La tecnica DUCT illumina nuovi meccanismi architettonici di rigenerazione biliare in un modello clinicamente rilevante con caratteristiche distinte nelle regioni ilare e del lobo periferico.