Utilizzo di Phage Display per sviluppare modulatori varianti di ubiquitina per le ligasi E3
August 27th, 2021
L'ubiquitinazione è una modificazione post-traduzionale critica della proteina, la cui disregolazione è stata implicata in numerose malattie umane. Questo protocollo descrive in dettaglio come la visualizzazione dei fagi può essere utilizzata per isolare nuove varianti di ubiquitina in grado di legare e modulare l'attività delle ligasi E3 che controllano la specificità, l'efficienza e i modelli di ubiquitinazione.
La visualizzazione dei fagi non solo ci aiuta a studiare le caratteristiche di legame di enzimi clinicamente importanti, ma anche a sviluppare modulatori per quegli enzimi e le malattie corrispondenti. Il display dei fagi può essere utilizzato per sviluppare nuovi leganti per una vasta gamma di proteine bersaglio ed è anche più facile da eseguire rispetto ad altri metodi di visualizzazione convenzionali. Questa procedura ha comportato molte azioni ripetitive, quindi la chiave è non pilotare automaticamente e rimanere concentrati per tutto il tempo.
Inizia inoculando 30 millilitri di brodo tetraciclina 2YT con 200 microlitri della coltura dei semi. Incubarlo per circa tre ore a 37 gradi Celsius con scuotimento orbitale a 200 RPM fino a quando i batteri non sono nella fase mid-log. Scartare la soluzione di rivestimento dalla piastra in un lavandino.
Asciugarlo delicatamente con carta assorbente. Quindi aggiungere 200 microlitri di tampone PB a ciascun pozzo rivestito. Scartare il tampone PB dalla piastra e asciugarlo su carta assorbente.
Aggiungere altri 200 microlitri di pb buffer a ciascun pozzetto rivestito della piastra. Incubarlo a temperatura ambiente per un'ora con scuotimento orbitale a 300 RPM. Scongelare la libreria di fagi sul ghiaccio, quindi diluirla a 100 volte la diversità della libreria in PBS.
Aggiungere la soluzione di cloruro di sodio polietilenglicole a un quinto del volume della libreria diluita e incubare la soluzione su ghiaccio per 30 minuti. Quindi, centrifugare la soluzione a 11.000 volte G per 30 minuti a quattro gradi Celsius. Scartare il surnatante e centrifugarlo per altri due minuti per tirare giù il surnatante rimanente e concentrare il pellet di fagi.
Risospentare delicatamente il pellet di fagi in un millilitro di tampone PBT per proteina bersaglio da analizzare, in genere quattro in totale. Aggiungere 100 microlitri di libreria di fagi a ciascun pozzo rivestito nella piastra di controllo. Incubarlo a temperatura ambiente per un'ora con scuotimento orbitale a 300 RPM.
Scartare il tampone PB dalla piastra di destinazione nel lavandino e asciugare la piastra su carta assorbente. Trasferire tutti i 100 microlitri della libreria di fagi nella piastra di controllo a ciascun pozzetto rivestito della piastra target. Incubarlo a temperatura ambiente per un'ora con scuotimento orbitale a 300 RPM.
Quindi, rimuovere la libreria di fagi dalla piastra e lavare i pozzetti rivestiti quattro volte con tampone PT. Capovolgere la piastra e toccare un tovagliolo di carta per rimuovere le ultime gocce di tampone. Aggiungere 100 microlitri di acido cloridrico molare 0,1 a ciascun pozzo rivestito per eluire il fago.
Incubare la piastra a temperatura ambiente per cinque minuti con scuotimento orbitale a 300 RPM. Successivamente, neutralizzare il pH aggiungendo 12,5 microlitri di pH 11 un tris cloridrato molare a ciascun pozzo rivestito. Trasferire il fago eluito da tutti e otto i pozzetti in un singolo tubo microcentrifuga da 1,5 millilitri.
Pipettare su e giù durante il trasferimento per rendere omogenee le soluzioni e aspirare tutto il liquido dai pozzetti. Aggiungere il 10% di BSA al fago eluito per rendere la concentrazione finale dell'1%Conservare il tubo microcentrifuga a quattro gradi Celsius. Questo è l'output del primo round.
Preparare una coltura di semi per la coltivazione dell'input fagico per il prossimo ciclo di selezione inoculando cinque millilitri di coltura di semi di tetraciclina 2YT con una colonia isolata di E.coli da una piastra di agar. Incubarlo durante la notte a 37 gradi Celsius con scuotimento orbitale a 200 RPM. Diluire la proteina bersaglio nei round due e tre tubi con una quantità appropriata di PBS.
Prendi metà del contenuto dei round due e tre tubi e rivesti quattro pozzetti per proteina bersaglio in una piastra legante a 96 pozzetti per il round successivo. Quindi, utilizzare metà dell'uscita del primo round per inoculare tre millilitri di celle di fase mid-log. Incubarlo a 37 gradi Celsius per 30 minuti con scuotimento orbitale a 200 RPM.
Aggiungere il fago helper M13KO7 a una concentrazione finale di 10 miliardi di PFU per millilitro. Incubarlo di nuovo a 37 gradi Celsius per un'ora con scuotimento orbitale a 200 RPM. Dopo un'ora, trasferire tutti e tre i millilitri di coltura a 30 millilitri di soluzione di kanamicina di carbenicillina 2YT.
Crescere durante la notte a 37 gradi Celsius con scuotimento orbitale a 200 RPM. I risultati rappresentativi per una selezione della variante di ubiquitina contro UBE4B sono mostrati qui. Gli ULV sono stati ordinati dalla frequenza più alta a quella più bassa.
Le sequenze rappresentano la regione diversificata dell'ubiquitina nell'UBV con tutti i residui randomizzati. L'affinità di legame relativa dei leganti alla proteina bersaglio wild type, alla proteina bersaglio mutata e alle proteine off-target è misurata mediante saggi immunoassorbenti enzimatici o ELISA. Tutte le assorbanze ELISA sono state normalizzate rispetto a 96 punteggi ELISA BSA medi e 96 punteggi ELISA GST medi.
Il verde più scuro rappresenta il legame relativo più forte. La GST è stata inclusa come controllo per il legame non specifico perché la proteina bersaglio è contrassegnata con GST. I risultati ELISA sono qui presentati graficamente.
L'asse x rappresenta gli UGV e l'asse y rappresenta la corrispondente assorbanza normalizzata. Quando si tenta questa procedura, è importante non scartare la soluzione nella piastra dopo aver aggiunto l'acido cloridrico. I fagi sono ora sospesi in soluzione e si desidera mantenerli in modo da poter eseguire successive analisi finali di arricchimento o entrambe.
Seguendo questa procedura, il sequenziamento deve essere fatto per determinare le frequenze UBV. I saggi ELISA e IC50 possono essere eseguiti rispettivamente per determinare l'efficacia del legame e l'efficacia inibitoria e anche per aiutare a determinare quali ULV caratterizzare ulteriormente.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Panoramica
Questo articolo discute l'uso del phage display per isolare nuove varianti di ubiquitina che possono modulare le E3 ligasi coinvolte nell'ubiquitinazione. L'ubiquitinazione è una modificazione post-traduzionale cruciale legata a varie malattie umane.
Componenti principali dello studio
Area di scienza
- Neuroscienze
- Biochimica
- Ingegneria proteica
Sfondo
- L'ubiquitinazione è essenziale per regolare la degradazione delle proteine e i processi cellulari.
- La disregolazione dell'ubiquitinazione è associata a numerose malattie.
- Il phage display è una tecnica potente per scoprire le interazioni proteiche.
- Questo metodo permette lo sviluppo di modulatori specifici per gli enzimi.
Obiettivo dello studio
- Isolare nuove varianti di ubiquitina utilizzando il phage display.
- Comprendere come queste varianti possono influenzare l'attività delle E3 ligasi.
- Esplorare le implicazioni della modulazione dell'ubiquitinazione nei contesti delle malattie.
Metodi utilizzati
- Inocolamento di colture batteriche in brodo 2YT con tetraciclina.
- Incubazione a 37 gradi Celsius con agitazione orbitale.
- Utilizzo di tecniche di phage display per saggi di legame.
- Isolamento e caratterizzazione delle varianti di ubiquitina.
Risultati principali
- Isolamento con successo di nuove varianti di ubiquitina.
- Caratteristiche di legame dimostrate alle E3 ligasi.
- Potenziale di queste varianti per modulare i modelli di ubiquitinazione.
- Incontri sul ruolo dell'ubiquitinazione nei meccanismi delle malattie.
Concludenze
- Il phage display è un metodo efficace per scoprire varianti di ubiquitina.
- La modulazione dell'attività delle E3 ligasi potrebbe avere implicazioni terapeutiche.
- Ulteriori ricerche sono necessarie per esplorare le applicazioni cliniche di questi risultati.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Phage display-driven engineering of ubiquitin variants (UbVs) enables precise modulation of E3 ligases, a critical inflection point for target validation in ubiquitin-proteasome system research. This approach enhances predictive confidence in early discovery by generating high-affinity, specific binders for mechanistic de-risking and functional interrogation of E3 ligase biology. The resulting UbVs support portfolio triage and prioritization by providing robust tools for downstream assay development and translational research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables systematic interrogation of E3 ligase function using engineered UbVs with improved affinity and specificity.
- Supports biological de-risking by isolating variants that discriminate between wildtype and mutant or off-target proteins.
- Facilitates predictive confidence in target engagement and mechanistic studies through iterative selection and enrichment.
Screening & Assay Development
- Provides validated UbVs for use in ELISA and IC50 assays to quantify binding and inhibitory efficacy.
- Enables reproducible, quantitative assessment of UbV-target interactions across multiple rounds of selection.
- Supports assay standardization and scalability for reliable compound evaluation and screening workflows.
Translational & Preclinical Research
- Aligns engineered UbVs with disease-relevant E3 ligases for translational biomarker studies when supported by downstream characterization.
- Maintains continuity from discovery through preclinical validation by enabling further functional and inhibitory profiling of selected UbVs.
- Reduces mechanistic ambiguity in preclinical models by providing specific molecular tools for pathway interrogation.
Pipeline & Workflow Integration
This phage display platform integrates from early discovery through lead identification, supporting both hypothesis testing and quantitative assay development for E3 ligase modulators.
- Discovery Biology: Iterative selection and enrichment clarify E3 ligase binding pathways and validate target engagement.
- Screening: ELISA and IC50 assays with UbVs deliver reproducible, quantitative outputs for downstream evaluation.
- Analytics: Sequencing and absorbance normalization enable robust comparison of UbV binding profiles and selection frequencies.
- Translational Research: Characterized UbVs can be advanced for further disease-relevant studies as supported by binding and inhibition data.
- Enterprise Reuse: The phage display workflow is adaptable for diverse E3 ligases and other protein targets, supporting platform scalability.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in E3 ligase target validation.
- Operational Value: Standardizes binder selection and assay development for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient advancement of validated targets.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of E3 ligase modulators across discovery programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in phage display, protein engineering, and quantitative binding assays.
- Demands access to bacterial culture, phage handling, and ELISA instrumentation.
- Necessitates cross-team standardization of selection, washing, and analytical protocols.
- Adaptable to various E3 ligases and target proteins with appropriate library design.
- Dependent on rigorous washing and selection to avoid enrichment of weak or promiscuous binders.
