Isolamento magnetico di cellule microgliali da topo neonato per colture cellulari primarie
25 luglio 2022
Le colture primarie di microglia sono comunemente utilizzate per valutare nuove molecole anti-infiammatorie. Il presente protocollo descrive un metodo riproducibile e rilevante per isolare magneticamente la microglia dai cuccioli neonati.
Questo protocollo ci permette di coltivare microglia in condizioni che imitano da vicino le caratteristiche in vivo. Utilizzando la tecnologia di selezione delle cellule magnetiche, il nostro protocollo ci consente di stimolare la microglia solo due giorni in vitro, senza utilizzare alcun siero nel terreno di coltura. Per iniziare, usa piccole forbici per tagliare la pelle dal collo al naso, seguendo la sutura sagittale da 15 a 20 millimetri.
Inserire le punte con il forame magno parallelo al cranio. Tagliare da ogni lato agli occhi. Tagliare tra gli occhi con piccole forbici per staccare il cranio e il cervello dalla testa.
Con due pinze, afferrare il cranio vicino ai bulbi olfattivi e strappare con cura il cranio. Con una lama di rasoio, rimuovere il cervelletto e il bulbo olfattivo e tagliare il cervello in due pezzi. Posizionare i pezzi di cervello in una capsula di Petri contenente 40 millilitri di HBSS senza calcio e magnesio.
Preparare la miscela di dissociazione secondo questa tabella. Trasferire 12 pezzi di cervello in un tubo C per un peso totale di 1,2 grammi per tubo di dissociazione. Quindi posizionare i tubi C sul dissociatore con riscaldamento.
Avviare il programma NTDK ottimizzato nel dissociatore. Centrifugare per 20 secondi. Completare la dissociazione meccanica mediante pipettaggio tre volte.
Trasferire le celle in quattro tubi da 15 millilitri con filtri collegati. Risciacquare i filtri con 10 millilitri di HBSS con calcio e magnesio. Centrifugare per 10 minuti e rimuovere il surnatante con una pipetta da 10 millilitri.
Aggiungere con cautela 10 millilitri di HBSS con calcio e magnesio e risospendere il pellet. Ancora una volta, centrifugare e rimuovere il surnatante. Risospendere il pellet con sei millilitri di tampone di selezione.
Ripetere la centrifugazione ed eliminare il surnatante. Quindi aggiungere 200 microlitri di soluzione di microsfere CD11b e incubare i tubi per 15-20 minuti a quattro gradi Celsius. Dopo l'incubazione, risospendere il pellet con sei millilitri di tampone di selezione.
Ripetere la centrifugazione e risospendere il pellet con otto millilitri di tampone di selezione. Quindi, seguire il programma Possel sul separatore per preparare otto colonne. Passare le celle attraverso la colonna aggiungendo un millilitro di sospensione cellulare alla volta.
Con un millilitro di tampone di selezione, eluire le cellule CD11b-positive su una piastra di eluizione sterile. Raggruppa le celle in un tubo da 50 millilitri. Centrifugare e risospendere il pellet con 10 millilitri di mezzo microglia freddo.
Contare le cellule CD11b-positive. Ri-sospendere le cellule nel mezzo microglia freddo per ottenere una concentrazione finale da 650.000 a 700.000 cellule per millilitro. Erogare la sospensione in piastre di coltura cellulare.
Incubare le piastre durante la notte a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica. Il giorno successivo, sostituire il mezzo con un mezzo microglia preriscaldato e ripetere l'incubazione notturna. Stimolare le cellule prima di questa fase ed eseguire il test fagocitario durante le ultime tre ore della stimolazione.
Calcola il numero di perline secondo questa tabella con un rapporto di 50 perle per cella. Preparare la miscela di perline. Incubare il tubo per un'ora a bagnomaria a 37 gradi Celsius.
Vortice ogni 10 minuti. A ciascun pozzetto, aggiungere il volume calcolato della soluzione di perline e incubare per tre ore. Utilizzando questo approccio, l'attività fagocitaria della microglia è stata valutata dopo la stimolazione da fattori pro-infiammatori, come l'interleuchina-1 beta, più interferone gamma o lipopolisaccaridi.
Dopo la stimolazione da sei a 24 ore, le sfere fluorescenti della microglia Cy3 sono state analizzate al microscopio confocale. Dopo sei ore, la microglia inizia a falciare le perle Cy3 solo in condizioni di interleuchina-1 beta più interferone gamma. Dopo 24 ore, c'è stato un aumento della fluorescenza Cy3 per entrambi i tipi di stimolazione, evidenziando un aumento dell'attività fagocitaria.
La purezza della coltura microgliale è stata elevata dalla citometria a flusso, che ha mostrato un aumento della vitalità cellulare dopo la selezione. Utilizzando la citometria a flusso e i marcatori di popolazione cellulare RT-qPCR sono stati analizzati prima e dopo aver selezionato cellule CD11b-positive dal cervello dei topi all'ottavo giorno postnatale. Queste analisi hanno distinto varie popolazioni di cellule cerebrali, come CX3CR135 per microglia, O4 o OLIG2 per oligodendrociti, NeuN o sinaptofisina, per i neuroni e ACSA-2 o GFAP per astrociti.
Dopo la selezione cellulare con l'anticorpo CD11b, sono state ottenute solo microglia. È importante pipettare molto delicatamente mentre si aggiunge la sospensione alla colonna per evitare l'intasamento ed evitare la morte meccanica delle cellule. Dopo questo metodo, la proteomica trascrittomica, come il sangue occidentale, o Luminex, e persino l'immunochimica possono essere eseguite per vedere l'effetto della stimolazione microgliale.
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Panoramica
Questo studio presenta un protocollo riproducibile per l'isolamento di microglia primaria da topi neonati, mediante l'uso della tecnologia di separazione magnetica. La metodologia consente la coltura della microglia in condizioni che riproducono in modo fedele le caratteristiche in vivo, fornendo informazioni sulla loro attività fagocitica.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Biologia cellulare
- Ricerca sulle microglia
Sfondo
- Le microglia svolgono ruoli cruciali nel sistema nervoso centrale.
- Comprendere le risposte microgliali a stimoli è importante per la ricerca sulle neuroinfiammazioni.
- Il sorting cellulare magnetico rappresenta una strategia valida per l'isolamento delle microglia.
- I protocolli precedenti possono mancare di riproducibilità o di rilevanza rispetto alle condizioni in vivo.
Scopo dello studio
- Sviluppare un protocollo per l'isolamento e la coltura efficiente di microglia primaria.
- Permettere la valutazione delle risposte della microglia a stimoli infiammatori.
- Valutare la purezza e la vitalità della microglia isolata.
Metodi Utilizzati
- Metodo di coltura cellulare che utilizza il sorting magnetico per isolare i microglia da topi neonati.
- Il modello biologico comprende microglia corticali provenienti da cuccioli neonati.
- Sono state impiegate immunoistochimica e citometria a flusso per valutare la purezza cellulare.
- I passaggi chiave includono dissezione, dissociazione enzimatica e sorting mediante microperle anti-CD11b.
- Saggi di fagocitosi hanno valutato l'attività dei microglia in risposta a fattori pro-infiammatori.
Risultati principali
- Le microglia hanno dimostrato un'attività fagocitica aumentata in risposta a specifiche condizioni infiammatorie.
- Un'aumentata vitalità cellulare e purezza sono state confermate mediante citometria a flusso dopo il sorting.
- La microscopia confocale ha evidenziato differenze marcate nell'attività fagocitica in base alla durata della stimolazione.
- Il metodo ha chiarito le distinzioni tra diverse popolazioni cellulari cerebrali.
Conclusioni
- Questo studio stabilisce un metodo affidabile per l'isolamento di microglia murina per esperimenti in vitro.
- I risultati migliorano la comprensione delle funzioni della microglia e delle sue risposte all'infiammazione.
- Questo protocollo costituisce una base per ulteriori indagini sui processi neuroinfiammatori.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Questo protocollo fornisce un metodo riproducibile per isolare microglia primaria da topi neonati, consentendo modelli in vitro fisiologicamente rilevanti per la ricerca neuroinfiammatoria. Raggiungendo un'elevata purezza e vitalità mediante selezione magnetica basata su CD11b, l'approccio supporta la riduzione del rischio meccanicistica nella validazione degli obiettivi e nello sviluppo di saggi per disturbi del sistema nervoso centrale. Il metodo aumenta l'affidabilità predittiva dello screening preclinico mantenendo la funzionalità e gli stati di attivazione della microglia che rispecchiano da vicino le condizioni in vivo.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Valore scientifico: Consente l'analisi dei fenotipi di attivazione dei microglia e delle risposte pro-infiammatorie rilevanti per le ipotesi sulle malattie neurosviluppative e neurodegenerative.
- Valore operativo: Fornisce un sistema di coltura standardizzato e privo di siero che riduce la variabilità biologica e supporta studi coerenti sull'interazione con i bersagli.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Genera output fagocitici e trascrizionali quantitativamente valutabili per lo screening di composti modulatori nelle vie infiammatorie.
- Valore operativo: Fornisce un protocollo di isolamento scalabile e riproducibile, compatibile con piastre multipozzetto e saggi di stimolazione in serie temporale.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Supporta la modellizzazione rilevante per le malattie preservando i marcatori dell'identità microgliale (ad esempio, CX3CR1) e le risposte funzionali a stimoli come IL-1β/IFN-γ e LPS.
- Valore operativo: Facilita la continuità traslazionale dalla scoperta alla validazione preclinica attraverso una purificazione standardizzata e una validazione funzionale mediante citometria a flusso e microscopia confocale.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nel percorso della scoperta precoce, fornendo cellule primarie validate per la verifica delle ipotesi, la preparazione dei saggi e la generazione di dati che guidano l'identificazione dei composti promettenti e la valutazione del rischio preclinico.
- Biologia della scoperta: Permette una riduzione del rischio meccanicistica isolando i microglia per chiarire il coinvolgimento delle vie nei processi neuroinfiammatori.
- Screening: Fornisce cellule pronte per saggi con letture quantitative dell'attività fagocitica e dell'mRNA, utili per lo screening di composti e studi di modulazione del bersaglio.
- Analisi: Consente misurazioni quantitative di variabili dipendenti, inclusa l'attività fagocitica (assorbimento di microsfere Cy3) e l'espressione genica (RT-qPCR), per l'analisi comparativa tra condizioni sperimentali.
- Ricerca traslazionale: Mantiene la fedeltà fenotipica e l'espressione dei marcatori, favorendo l'allineamento dei biomarcatori e la continuità nella validazione preclinica.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma di isolamento riutilizzabile, applicabile in diversi progetti che studiano la funzione dei microglia in modelli di malattie del sistema nervoso centrale.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia nella validazione dell'obiettivo riducendo l'ambiguità meccanicistica grazie a modelli microgliali fisiologicamente rilevanti.
- Valore operativo: Migliora la riproducibilità e la standardizzazione mediante il sorting magnetico e condizioni di coltura definite, minimizzando la variabilità tra un lotto e l'altro.
- Valore strategico: Migliora il processo decisionale di avanzamento o interruzione dello sviluppo fornendo dati preclinici affidabili sulla modulazione dell'obiettivo e sui profili di risposta infiammatoria.
- Impatto sul portafoglio: Consente la priorizzazione dei target per il sistema nervoso centrale in base a dati validati sull'interazione con la microglia e sull'output funzionale, adeguata al livello di rischio.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella dissezione di tessuti neonatali, nella dissociazione enzimatica e nelle tecniche di separazione cellulare magnetica.
- È subordinato all'accesso a dispositivi di separazione cellulare (ad esempio, MACS), centrifughe e infrastrutture sterili per colture cellulari.
- Necessita di una preparazione standardizzata dei reagenti e di tempi di incubazione controllati per garantire un rendimento e una vitalità costanti delle cellule positive per CD11b.
- L'adattamento ad altri sistemi modello o stadi di sviluppo potrebbe richiedere l'ottimizzazione dei parametri di dissociazione e separazione.
- I limiti pratici includono la sensibilità meccanica durante il passaggio attraverso la colonna, che richiede un'aspirazione delicata per evitare occlusioni e danni cellulari.
