Misurazione quantitativa assistita da software dello spessore osseo subcondrale osteoartritico
18 marzo 2022
Questo articolo metodologico presenta un protocollo di misurazione quantitativa assistito da software per quantificare lo spessore osseo subcondrale istologico nelle articolazioni del ginocchio osteoartritico murino e nelle articolazioni normali del ginocchio come controlli. Questo protocollo è altamente sensibile all'ispessimento sottile ed è adatto per rilevare i primi cambiamenti osteoartritici dell'osso subcondrale.
L'ispessimento osseo subcondrale, o sclerosi, è uno dei tratti distintivi dell'osteoartrite, sia nei modelli animali che negli esseri umani. Attualmente, la gravità dell'ispessimento osseo subcondrale istologico è per lo più determinata da una stima visiva basata su sistemi di classificazione semi-quantitativi. Questo studio mira a sviluppare un protocollo riproducibile e facilmente eseguibile per misurare quantitativamente lo spessore dell'osso subcondrale in un modello murino di OA del ginocchio indotto dalla destabilizzazione del menisco mediale.
Abbiamo creato un modello murino per l'artrosi del ginocchio mediante destabilizzazione chirurgica del menisco mediale che viene eseguita al microscopio chirurgico e la condizione sterile. Il processo istologico delle articolazioni del ginocchio del topo include la fissazione dei tessuti, la decalcificazione, il taglio, l'elaborazione, l'incorporamento, il sezionamento e la colorazione, seguiti dall'imaging microscopico. L'immagine sullo schermo mostra l'artrosi del ginocchio del topo con lesioni della cartilagine articolare, formazione di osteofiti e ispessimento osseo subcondrale Misurazione quantitativa dell'osso subcondrale osteoartritico con il software ImageJ.
Scarica ImageJ da imagej.nih.gov/ij. Aprire ImageJ. Fare clic sulla scheda File e quindi sull'opzione Apri per aprire l'immagine istologica.
Individuare l'indirizzo della directory del file, selezionare il file di immagine e fare clic su Apri. Utilizzate lo strumento linea retta per tracciare un'unità di lunghezza, un micrometro, quindi fate clic su Analizza (Analyze), quindi su Imposta scala (Set Scale). Impostare la distanza nota e le proporzioni pixel su uno e fare clic su Ok.ImageJ può convertire la lunghezza dei pixel nella lunghezza dell'unità, un micrometro.
Impostare il fattore misurato su area. Fare clic su Analizza, quindi su Imposta misurazione e selezionare la casella Area e Limita a soglia nella nuova finestra. Questo passaggio imposta ImageJ per misurare l'area dei parametri all'interno della soglia selezionata.
Definita l'area ossea subcondrale totale di interesse come mostrato in radio che copre la piastra corticale subcondrale e una porzione dell'osso trabecolare sottostante adiacente alla piastra corticale. Tracciate il contorno dell'area totale dell'osso subcondrale utilizzando lo strumento di selezione sotto la finestra principale dell'immagine. Gli strumenti di selezione forniscono al sistema una soglia per limitare la misurazione dopo la selezione della soglia.
Fare clic su Analizza, quindi su Misura. Si aprirà una finestra dei risultati con la misurazione dell'area. Fare clic su Modifica, quindi su Cancella all'esterno per escludere l'area esterna all'area totale dell'osso subcondrale.
Solo l'area ossea subcondrale totale è visibile dopo aver fatto clic sull'opzione Cancella esterno. Fare clic su Immagine, quindi su Regola, quindi su Soglia colore per aprire la finestra del colore della soglia. Fare clic su Originale nella parte inferiore della finestra del colore di soglia per ripristinare lo stato originale dell'immagine.
Utilizzare gli strumenti di selezione per disegnare una piccola scatola nella regione della sostanza ossea. Fare clic su Opzione campione nella parte inferiore della finestra per definire l'area della sostanza ossea. L'area della sostanza ossea selezionata diventerà rossa.
Fare clic su Seleziona nella parte inferiore della finestra del colore della soglia per creare la soglia di misurazione dell'area. Fare clic su Analizza, quindi su Misura nel menu principale di ImageJ. Il risultato della misurazione dell'area della sostanza ossea verrà visualizzato nella finestra dei risultati.
Salvare i dati dell'area ossea subcondrale totale e dell'area della sostanza ossea. La variabilità inter e intraobserver e la riproducibilità sono state determinate dall'analisi del coefficiente di correlazione di Pearson. Il significato della differenza tra i gruppi di studio è stato determinato utilizzando Student t-test o ANOVA unidirezionale, seguito da test post-hoc.
Questa figura mostra i pannelli superiore e inferiore. Il pannello superiore mostra fotomicrografie di immagini istologiche dei gruppi Sham e DMM per la classificazione ossea subcondrale basata sulla stima visiva. I pannelli inferiori mostrano fotomicrografie di immagini istologiche dei gruppi Sham e DMM per la misurazione quantitativa dell'osso subcondrale assistita da ImageJ.
Le caselle delineate con una linea gialla tratteggiata realizzata con Adobe Illustrator definiscono l'area totale dell'osso subcondrale di interesse. L'area della sostanza ossea all'interno delle scatole è evidenziata in arancione. Un notevole ispessimento osseo subcondrale nel condilo femorale mediale e nel plateau tibiale mediale può essere quantificato utilizzando il software ImageJ.
In questa figura, i test di variazione interosservatore indicano un'elevata riproducibilità tra osservatori sia per la prima che per la seconda misurazione dello spessore osseo subcondrale nel plateau tibiale mediale e nelle regioni mediali del condilo femorale di interesse. In questa figura, i test di variazione intraobserver indicano un'elevata riproducibilità tra la prima e la seconda misurazione dello spessore osseo subcondrale nelle regioni di interesse del plateau tibiale mediale e del condilo femorale mediale. La Tabella 1 mostra l'analisi comparativa della riproducibilità tra la gradazione visiva e la misurazione quantitativa assistita da ImageJ dello spessore osseo subcondrale.
Il test del coefficiente di correlazione suggerisce che la misurazione quantitativa era relativamente più riproducibile rispetto al sistema di classificazione visiva. Questa figura mostra l'analisi comparativa della sensibilità del grading visivo e la misurazione quantitativa assistita da ImageJ dello spessore osseo subcondrale nel condilo femorale mediale e nel plateau tibiale mediale. Le immagini istologiche per la valutazione della stima visiva sono state divise in tre gruppi.
Il valore quantitativo dello spessore osseo subcondrale di tutti e tre gli osservatori per le immagini DMM con un punteggio visivo pari a zero era significativamente superiore a quello delle immagini Sham con un punteggio visivo pari a zero, indicando che la misurazione quantitativa è più sensibile della gradazione visiva a un lieve ispessimento osseo subcondrale. Il protocollo di nuova concezione per la misurazione quantitativa dello spessore osseo subcondrale osteoartritico è più sensibile ai lievi cambiamenti dell'osso subcondrale rispetto ai sistemi di classificazione visiva ampiamente utilizzati. E questo protocollo può essere utilizzato per rilevare i primi cambiamenti dell'osso subcondrale osteoartritico e per valutare l'efficacia in vivo dei trattamenti di osteoartrite in concerto con la classificazione della cartilagine dell'osteoartrite.
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Panoramica
Questo articolo di metodologia presenta un protocollo assistito da software per la misurazione quantitativa dello spessore osseo subcondrale istologico nelle articolazioni del ginocchio di topi con osteoartrite e nelle articolazioni del ginocchio normali utilizzate come controllo. Il protocollo è stato progettato per essere altamente sensibile a lievi aumenti di spessore, rendendolo adatto al rilevamento di cambiamenti osteoarticolari precoci.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Ricerca sull'artrosi
- Organizzazione dei tessuti
Sfondo
- L'ispessimento dell'osso subcondrale è un segno distintivo dell'osteoartrite.
- I metodi attuali si basano su una stima visiva e su una valutazione semiquantitativa.
- È necessario un protocollo riproducibile per una misurazione accurata.
- Lo studio utilizza un modello murino indotto dalla destabilizzazione del menisco mediale.
Scopo dello studio
- Sviluppare un protocollo di misurazione quantitativa dello spessore dell'osso subcondrale.
- Migliorare la sensibilità nel rilevamento di cambiamenti osteoartrosici precoci.
- Fornire un metodo standardizzato per la ricerca futura.
Metodi Utilizzati
- Destabilizzazione chirurgica del menisco mediale nei topi.
- Processi istologici inclusi fissazione, decalcificazione e colorazione.
- Acquisizione di immagini al microscopio per l'analisi.
- Misurazione quantitativa mediante software ImageJ.
Risultati principali
- Creazione con successo di un modello murino per l'osteoartrosi del ginocchio.
- Dimostrazione di lesioni della cartilagine articolare e formazione di osteofiti.
- Valutazione quantitativa dell'ispessimento dell'osso subcondrale ottenuta.
- Il protocollo mostra un'elevata sensibilità ai cambiamenti nello spessore osseo.
Conclusioni
- Il protocollo sviluppato consente una misurazione accurata dello spessore dell'osso subcondrale.
- Questo metodo può migliorare la comprensione della progressione dell'osteoartrite.
- Studi futuri potranno utilizzare questo protocollo per ulteriori ricerche nell'ambito dell'osteoartrite.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La misurazione quantitativa dello spessore dell'osso sottocartilagineo affronta un'importante lacuna nella validazione degli obiettivi nell'artrosi, sostituendo la valutazione visiva soggettiva con un'analisi riproducibile assistita da software. Questo approccio aumenta la fiducia predittiva nei modelli preclinici consentendo il rilevamento di precoci cambiamenti strutturali sottili che precedono il degrado evidente della cartilagine. Il metodo supporta la riduzione del rischio meccanicistico dei farmaci per l'OA fornendo un biomarcatore standardizzato e traslabile per i percorsi di rimodellamento osseo.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi di ipotesi terapeutiche mirate ai percorsi di rimodellamento dell'osso subcondrale nell'osteoartrite.
- Valore operativo: Fornisce letture quantitative e riproducibili per la validazione funzionale di bersagli nei modelli murini di OA.
- Valore predittivo: Supporta la selezione del portafoglio identificando un lieve ispessimento osseo invisibile ai sistemi di valutazione visiva.
Sviluppo di screening e saggi
- Prontezza del saggio: Prepara campioni istologici validati per un'analisi standardizzata ad alto rendimento mediante ImageJ.
- Output quantitativo: Genera misurazioni continue e indipendenti dalla soglia dell'area dell'osso subcondrale per lo screening di composti.
- Scalabilità: Consente il riutilizzo della piattaforma in diversi studi sull'artrosi, con definizioni coerenti delle regioni di interesse nel condilo femorale mediale e nella piastra tibiale.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Rilevanza per la malattia: È allineato alla patologia umana di OA in cui la sclerosi sottocartilaginea è un segno distintivo della progressione.
- Continuità traslazionale: Collega le fasi di scoperta e preclinica fornendo un biomarcatore compatibile con la valutazione del danno cartilagineo.
- Decisioni aggiustate per il rischio: Supporta criteri di prosegui/non prosegui basati su variazioni quantitative dello spessore osseo negli studi sull'efficacia del trattamento.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il protocollo si inserisce nel percorso di scoperta dell'artrosi, dalla validazione del bersaglio fino all'ottimizzazione del composto promettente e alla valutazione dell'efficacia preclinica, in particolare quando il rimodellamento osseo rappresenta un aspetto meccanicistico fondamentale.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica di ipotesi su bersagli coinvolti nella sclerosi ossea subcondrale e nella meccanotrasduzione.
- Screening: Fornisce output quantitativi pronti per il saggio e riproducibili per valutare gli effetti dei composti sullo spessore osseo.
- Analisi: Consente il confronto statistico dello spessore osseo tra gruppi mediante correlazione di Pearson e test t/ANOVA come descritto.
- Ricerca traslazionale: Si collega alla validazione preclinica offrendo un biomarcatore che rispecchia le metriche di progressione clinica dell'OA.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce un flusso di lavoro di analisi istologica riutilizzabile in diversi modelli di OA e bracci di trattamento.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la certezza della validazione dell'obiettivo riducendo l'ambiguità nella valutazione del fenotipo osseo.
- Valore operativo: Standardizza le misurazioni tra osservatori e sessioni, con bassa variabilità intra- e inter-osservatore.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione identificando precoci cambiamenti strutturali non rilevati dai punteggi semi-quantitativi.
- Impatto sul portafoglio: Consente un avanzamento calibrato sul rischio basato su endpoint quantitativi e sensibili del rimodellamento osseo.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella preparazione istologica e nell'analisi della soglia di ImageJ.
- È dipendente da una microscopia calibrata e da una definizione coerente della regione di interesse.
- Necessita di una standardizzazione intersquadre dei protocolli di misurazione per garantire la riproducibilità.
- Le considerazioni per l'adattamento includono l'anatomia ossea specifica del modello e i protocolli di colorazione.
- Limite pratico: il delimitare manualmente le aree può introdurre variabilità se le definizioni delle regioni di interesse non sono rigorosamente standardizzate.
