Name: Imaging a singola molecola dellassemblaggio di condensati EWS-FLI1 sul DNA (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 5 s
Description: Scopri l'imaging a singola molecola con DNA Curtains per studiare l'assemblaggio dei condensati EWS-FLI1 sul DNA. Questo metodo rivela la dinamica della separazione di fase dei fattori di trascrizione nel sarcoma di Ewing.

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Gli autori non hanno conflitti di interesse.

Poiché gli approcci a singola molecola sono estremamente sensibili al contenuto del sistema di reazione, è necessario investire uno sforzo supplementare per garantire una buona qualità di tutti i materiali e le soluzioni durante gli esperimenti di DNA Curtains, in particolare i lipidi preparati nelle sezioni 1 e 2 e i tamponi utilizzati nella sezione 5. I reagenti di purezza superiore devono essere utilizzati per preparare i tamponi e i tamponi devono essere preparati di recente per il saggio a singola molecola.
<p c...

La regolazione trascrizionale è un passo cruciale per una precisa espressione genica nelle cellule viventi. Molti fattori, come la modificazione cromosomica, i fattori di trascrizione (TF) e gli RNA non codificanti, partecipano a questo complicato processo 1,2,3. Tra questi fattori, i TF contribuiscono alla specificità della regolazione trascrizionale riconoscendo e legandosi a specifiche sequenze di DNA note come promotori o enhancer e successivamente reclutando altre proteine funzionali per attivare o reprimere la trascrizione 4,5,6,7. Il modo in cui questi TF riescono a cercare i loro siti bersaglio nel genoma umano e interagire con il DNA rivestito di istoni e proteine leganti il DNA non istoniche ha lasciato perplessi gli scienziati per decenni. Negli ultimi anni, sono stati costruiti diversi modelli classici per il meccanismo di ricerca target dei TF per descrivere come "scivolano", "saltano", "saltano" o "trasferimento intersegmento" lungo la catena del DNA 8,9,10,11. Questi modelli sono focalizzati sul comportamento di ricerca sul DNA di una singola molecola di TF. Tuttavia, studi recenti dimostrano che alcuni TF subiscono la separazione di fase liquido-liquido (LLPS) da soli nel nucleo o con il complesso Mediator12. Le goccioline osservate di TF sono associate alle regioni promotore o enhancer, evidenziando il ruolo della formazione di condensati biomolecolari nella trascrizione e nel genoma tridimensionale13,14,15. Questi condensati biomolecolari sono legati a compartimenti privi di membrana in vivo e in vitro. Sono formati tramite LLPS, in cui le biomacromolecole modulari e le regioni intrinsecamente disordinate (IDR) delle proteine sono due principali forze trainanti delle interazioni multivalenti16. Pertanto, i TF non solo cercano il DNA, ma funzionano anche sinergicamente all'interno di questi condensati 4,17,18. Ad oggi, la proprietà biofisica di questi condensati di trascrizione sul DNA rimane poco chiara.
Pertanto, questo studio mirava ad applicare un metodo a singola molecola - DNA Curtains - per visualizzare direttamente la formazione e la dinamica dei condensati di trascrizione formati dai TF sul DNA in vitro. DNA Curtains, una piattaforma di imaging in vitro ad alto rendimento per studiare l'interazione tra proteine e DNA, è stata applicata nella riparazione del DNA 19,20,21, nella ricerca target22 e nella LLPS17,23,24. La cella di flusso di DNA Curtains è rivestita con doppi strati lipidici biotinilati per passivare la superficie e consentire alle biomolecole di diffondersi sulla superficie. I modelli a zig-zag nanofabbricati limitano il movimento del DNA. I substrati di DNA lambda biotinilato possono allinearsi lungo i bordi della barriera ed essere allungati dal flusso tampone orientato. Le stesse sequenze iniziali e finali di tutte le molecole permettono il tracciamento della proteina sul DNA e descrivono la distribuzione di posizione degli eventi di legame25,26. Inoltre, la combinazione di DNA Curtains con microscopia a fluorescenza a riflessione interna totale (TIRFM) aiuta a ridurre al minimo il rumore di fondo e rilevare i segnali a livello di singola molecola. Pertanto, DNA Curtains potrebbe essere un metodo promettente per studiare la dinamica della formazione di condensati di trascrizione su motivi di DNA. Questo articolo descrive l'esempio di un'oncoproteina di fusione della famiglia FUS/EWS/TAF15 (FET), EWS-FLI1, generata dalla traslocazione cromosomica. Il DNA lambda contenente 25× GGAA - la sequenza di legame di EWS-FLI127 - è stato utilizzato come substrato del DNA negli esperimenti DNA Curtains per osservare come le molecole EWS-FLI1 subiscono LLPS sul DNA. Questo manoscritto discute in dettaglio il protocollo sperimentale e i metodi di analisi dei dati.

<table><tbody><tr><td>laser a stato solido pompato a diodo da 488 nm</td><td>OBIS488LS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>coerente laser a stato solido pompato a diodo da 561 nm</td><td>OBIS561LS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>coerente Agar</td><td>Rhawn</td><td>R003215-50g</td><td></td></tr><tr><td>DOPE biotinilato</td><td>Avanti</td><td>870273P</td><td></td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina</td><td>Sigma</td><td>A7030</td><td></td></tr><tr><td>Cloroformio</td><td>Amresco</td><td>1595C027</td><td></td></tr><tr><td>Rivestimento Electra 92</td><td>Allresist GmbH</td><td>AR-PC 5090.02</td><td>Il rivestimento protettivo conduttivo</td></tr><tr><td>Desossiribonucleasi I bovino</td><td>Sigma</td><td>D5139-2MG</td><td></td></tr><tr><td>DOPC</td><td>Avanti</td><td>850375P</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma</td><td>D9779</td><td></td></tr><tr><td>Vetrino coprioggetti</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-7</td><td></td></tr><tr><td>Hellmanex III</td><td>Sigma</td><td>Z805939-1EA</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>60130</td><td></td></tr><tr><td>Lambda DNA</td><td>NEB</td><td>N3013S</td><td></td></tr><tr><td>Estratti di imballaggio</td><td>Lambda Epicentre</td><td>MP5120</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>s3014</td><td></td></tr><tr><td>Nanoport</td><td>Idex</td><td>N-333-01</td><td></td></tr><tr><td>NheI-HF</td><td>NEB</td><td>R3131S</td><td></td></tr><tr><td>Nikon Microscopio invertito</td><td>Nikon</td><td>Eclipse Ti</td><td></td></tr><tr><td>NZCYM Brodo</td><td>Sigma</td><td>N3643-250G</td><td></td></tr><tr><td>PEG-2000 DOPE</td><td>Avanti</td><td>880130P-1G</td><td></td></tr><tr><td>PEG-8000</td><td>Amresco</td><td>25322-68-3</td><td></td></tr><tr><td>PMMA 200K, LATTATO DI ETILE 4%</td><td>Allresist GmbH</td><td>AR-P 649.04</td><td></td></tr><tr><td>PMMA 950K, ANISOLO 2%</td><td>Allresist GmbH</td><td>AR-P 672.02</td><td></td></tr><tr><td>Prime 95B Telecamera CMOS scientifica</td><td>FOTOMETRICA</td><td>Prime95B</td><td></td></tr><tr><td>proteinasi K</td><td>NEB</td><td>P8107S</td><td></td></tr><tr><td>Vetrino in vetro di silice</td><td>G.Finkenbeiner</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Valvola di iniezione a sei vie</td><td>Idex</td><td>MXP9900-000</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidina</td><td>Thermo</td><td>S888</td><td>Diluito con ddH2O</td></tr><tr><td>Pompa siringa</td><td>Harvard Apparatus</td><td>Pump11 Elite</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligasi</td><td>NEB</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Sigma</td><td>T6066</td><td></td></tr><tr><td>XhoI</td><td>NEB</td><td>R0146V</td><td></td></tr><tr><td>YOYO-1 Ioduro (491/509)</td><td>Invitrogen</td><td>Y3601</td><td>Diluito con DMSO</td></tr></tbody></table>

imaging a singola molecola dell'assemblaggio di condensati ews-fli1 sul dna

Single-Molecule Imaging of EWS-FLI1 Condensates Assembling on DNA

I geni di fusione risultanti dalla traslocazione cromosomica sono stati trovati in molti tumori solidi o leucemia. EWS-FLI1, che appartiene alla famiglia FUS/EWS/TAF15 (FET) di oncoproteine di fusione, è uno dei geni di fusione più frequentemente coinvolti nel sarcoma di Ewing. Queste proteine di fusione della famiglia FET ospitano tipicamente un dominio a bassa complessità (LCD) di proteina FET al loro N-terminale e un dominio di legame al DNA (DBD) al loro C-terminale. È stato confermato che EWS-FLI1 forma condensati biomolecolari nei suoi loci di legame bersaglio a causa delle interazioni LCD-LCD e LCD-DBD, e questi condensati possono reclutare RNA polimerasi II per migliorare la trascrizione genica. Tuttavia, il modo in cui questi condensati vengono assemblati nei loro siti di legame rimane poco chiaro. Recentemente, un metodo biofisico a singola molecola - DNA Curtains - è stato applicato per visualizzare questi processi di assemblaggio dei condensati EWS-FLI1. Qui, il protocollo sperimentale dettagliato e gli approcci di analisi dei dati sono discussi per l'applicazione di DNA Curtains nello studio dei condensati biomolecolari che si assemblano sul DNA bersaglio.

Lo schema delle tende DNA è mostrato nella Figura 1A, nella Figura 1B e nella Figura 1D. La sequenza bersaglio clonata contenente 25 ripetizioni ininterrotte di GGAA si trova nel promotore NORB1 nel sarcoma di Ewing. Questa sequenza target è cruciale per il reclutamento di EWS-FLI128. Le molecole di EWS-FLI1 sono state visualizzate rilevando i segnali EWS-FLI1 marcati con mCherry ottenuti con un lase...

Qui, descriviamo l'uso del metodo di imaging a singola molecola, DNA Curtains, per studiare il meccanismo biofisico dell'assemblaggio dei condensati EWS-FLI1 sul DNA.

Imaging a singola molecola dell'assemblaggio di condensati EWS-FLI1 sul DNA

The fusion genes resulting from chromosomal translocation have been found in many solid tumors or leukemia. EWS-FLI1, which belongs to the FUS/EWS/TAF15 ...

Forniamo un saggio a singola molecola per osservare la separazione di fase dei fattori di trascrizione sul DNA Questa tecnica consente la realizzazione in tempo reale del processo dinamico dei fattori di trascrizione che si assemblano come una goccia liquida sul DNA. EWS-FL1 è uno dei geni di fusione più frequentemente coinvolti nella tumorigenesi del sarcoma di Ewing. La nostra ricerca potrebbe identificare la relazione tra il numero del motivo del DNA e la formazione di condensati EWS-FL1 che è associata a una trascrizione genica sterile nelle cellule tumorali e forse utile per la prognosi.Questo metodo potrebbe essere applicato per studiare eventuali condensati o complessi di trascrizione in vitro, come P53 e MED1. Per preparare una cella di flusso con barriere nano fabbricate a zigzag per un esperimento di tenda di DNA, collegare i tubi di ingresso e uscita nella direzione corretta. Quindi lavare la cella di flusso con 2,5 millilitri di tampone lipidico utilizzando due siringhe da tre millilitri, assicurandosi che non vi sia alcuna bolla nella cella di flusso.Rimuovere la siringa dall'uscita e iniettare un millilitro di soluzione liposomica tre volte con un'incubazione di cinque minuti tra ogni iniezione. Per la guarigione, rilavare lentamente la cella di flusso con 2,5 millilitri di tampone lipidico e incubare a temperatura ambiente per 30 minuti. Durante l'incubazione, preparare il buffer BSA come indicato nel manoscritto testuale.Quindi, dopo 30 minuti di guarigione, lavare la cella di flusso con 2,5 millilitri di tampone BSA dal lato di uscita. Quindi, iniettare 800 microlitri di tampone streptavidina nella cella di flusso dal lato di ingresso in due fasi con un'incubazione di 10 minuti dopo ogni passaggio. Quindi lavare la cella di flusso con 2,5 millilitri di tampone BSA per rimuovere tutte le molecole di streptavidina libera.Quindi, diluire il DNA lambda della biotina con motivi clonati usando il tampone BSA e iniettarlo quattro volte lentamente a intervalli di cinque minuti. Durante l'iniezione, accendere il microscopio nel sistema scientifico a semiconduttore a ossido di metallo gratuito. Quindi lavare il tubo con 10 millilitri di acqua doppia distillata e sciacquare il prisma e il connettore del tubo con acqua, il 2% di detergente per cuvette liquide e il 99% di etanolo.Quindi, aspirare almeno 20 millilitri del tampone di imaging in una siringa da 30 millilitri. Impostare la cella di flusso sullo stadio del microscopio e collegarla al sistema microfluidico. Utilizzando una portata di 0,03 millilitri al minuto, lavare le molecole di DNA alla barriera per 10 minuti.Quindi spegnere il sistema microfluidico e incubare per 30 minuti. con il flusso fermato, permettendo al DNA di diffondersi lateralmente. Per visualizzare la formazione di condensazione EWS-FLI1 sulle cortine di DNA, aprire il software di imaging e trovare e contrassegnare le posizioni dei nove modelli a zigzag sotto il campo luminoso.Quindi accendere il flusso a 0,2 millilitri al minuto per macchiare il DNA con colorante DNA a doppio filamento per 10 minuti. Quindi, diluire la proteina mCherry EWS-FLI1 con il tampone di imaging a una concentrazione di 100 nanomoli in 100 microlitri. Quindi caricare il campione proteico attraverso la valvola con una siringa di vetro da 100 microlitri e modificare la portata a 0,4 millilitri al minuto.Dopo aver acceso il laser a 488 nanometri, ogni regione per verificare lo stato di distribuzione del DNA e selezionare la regione in cui le molecole di DNA si distribuiscono uniformemente. Quindi impostare la potenza del laser al 10% per il laser a 488 nanometri e al 20% per il laser a 561 nanometri. E usando il misuratore di potenza, misurare la potenza reale del laser vicino al prisma.Inizia ad acquisire immagini a intervalli di due secondi con laser a 488 e 561 nanometri contemporaneamente. Quindi cambiare la valvola dalla modalità manuale alla modalità di iniezione per consentire al tampone di imaging di lavare il campione proteico nella cella di flusso dopo 60 secondi. Per rimuovere l'EWS-FLI1 libero, continuare a lavare la cella di flusso con il buffer di imaging per cinque minuti con solo il laser a 561 nanometri acceso.Quindi interrompere il flusso e incubare a 37 gradi Celsius per 10 minuti. Dopo 10 minuti, accendere il flusso a 0,4 millilitri al minuto per consentire al DNA di estendersi e acquisire immagini a intervalli di due secondi tra diversi fotogrammi per ottenere dati ad alta produttività della formazione di condensato EWS-FLI1. Le molecole di EWS-FLI1 sono state visualizzate rilevando i segnali EWS-FLI1 etichettati con mCherry ottenuti con un laser a 561 nanometri.La formazione in vitro di condensato EWS-FLI1 nel sito delle 25 ripetizioni GGAA nel substrato del DNA potrebbe essere visualizzata direttamente. La specificità di mCherry EWS-FLI1 utilizzato nelle tende di DNA è stata confermata da un saggio di spostamento della mobilità elettroforetica utilizzando un modello di DNA con e senza le 25 ripetizioni GGAA separatamente. Quando la concentrazione di EWS-FLI1 è stata titolata da 20 a 500 nanomoli, l'intensità di EWS-FLI1 è aumentata drasticamente.Mentre il cambiamento nell'intensità di FLI one DBD era trascurabile quando le proteine erano sature per coprire le ripetizioni GGAA, suggerendo che EWS-FLI1 formava condensati sul DNA. L'iniezione deve essere molto lenta e morbida in modo che il liposoma e il DNA possano distribuirsi uniformemente sulla cellula a flusso. È importante eseguire MSA per confermare che un fattore di trascrizione purificato si lega specificamente con la sequenza target in vitro.Questa tecnica consente alle persone di esplorare se la condensa faciliterà la ricerca target dei fattori di trascrizione e il suo effetto sulla trascrizione.

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