Name: Generazione di organoidi cerebrali da cellule staminali pluripotenti indotte in mini bioreattori fatti in casa (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 16 s
Description: Scopri come generare organoidi cerebrali da cellule staminali pluripotenti indotte utilizzando mini bioreattori fatti in casa. Questo metodo consente la produzione su larga scala di modelli 3D per lo studio delle patologie del sistema nervoso centrale.

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Questo lavoro è stato sostenuto dalla sovvenzione 075-15-2019-1669 del Ministero della Scienza e dell'Istruzione Superiore della Federazione Russa (analisi RT-PCR) e dalla sovvenzione n. 19-15-00425 della Russian Science Foundation (per tutti gli altri lavori). Gli autori ringraziano anche Pavel Belikov per il suo aiuto con l'editing video. Le figure nel manoscritto sono state create con BioRender.com.

NOTA: utilizzare la tecnica sterile in tutto il protocollo, esclusi i passaggi 1.2 e 1.3. Riscaldare tutti i mezzi di coltura e le soluzioni a 37 °C prima di applicarli a cellule o organoidi. Coltivare le cellule in un incubatore a CO2 a 37 °C in 5% CO2 su 80% di umidità. Lo schema di protocollo è illustrato nella Figura 1.
1. Trasformare le piastre di Petri in mini bioreattori
<ol><li>Tagliare tubi centrifughi sterili da 15 ml in anelli di 7-8 mm di altezza; autoclave gli anelli.</li>
	<li>Rompere le piastre di Petri a bassa adesione, non trattate o microbiologiche in briciole. Sciogliere circa 1 g di briciole di plastica in 10 ml di cloroformio durante la notte per preparare la plastica liquida. ATTENZIONE: Lavorare in una cappa aspirante.</li>
	<li>Controllare che la plastica liquida risultante sia abbastanza viscosa per il pipettaggio; la sua goccia mantiene una forma sferica e non si diffonde sulla superficie. Se è molto liquido, aggiungi altre briciole di plastica. Se è spesso, aggiungere cloroformio.</li>
	<li>Crea una manopola di plastica al centro di una piastra di Petri sterile a bassissima adesione da 6 cm. Ci sono due modi ugualmente adatti, come dettagliato di seguito.<ol>
<li>Metti l'anello di plastica autoclavata al centro e lascia cadere la plastica liquida all'interno dell'anello.</li>
		<li>Senza alcun anello di plastica, far cadere la plastica liquida al centro della capsula di Petri.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lasciare i piatti aperti per 2-3 ore in una cappa a flusso laminare fino a quando l'asciugazione completa. Trattare i piatti essiccati con radiazioni ultraviolette per 15-20 minuti.</li>
</ol>2. Induzione della differenziazione neuronale delle iPSC
<ol><li>Coltivare iPSC nel mezzo per cellule staminali pluripotenti fino al 75-90% di confluenza in piastre di Petri da 35 mm precoate con una matrice costituita da proteine extracellulari.</li>
	<li>Preparare A-SR medio. Vedere la Tabella 1 per i dettagli.</li>
	<li>Aspirare il terreno di coltivazione e aggiungere 2 ml di terreno A-SR al giorno 0 di differenziazione.</li>
	<li>Preparare il mezzo A (vedi Tabella 2).</li>
	<li>Coltivare le cellule nel mezzo A per due settimane dai giorni 2-14, mezzo rinfrescante nelle piastre di Petri a giorni alterni.</li>
</ol>3. La formazione di sferoidi da cellule precursori neuroepiteliali al giorno 14
<ol><li>Al giorno 14, produrre sferoidi da cellule precursori neuroepiteliali utilizzando una speciale piastra di coltura a 24 pozzetti contenente circa 1.200 micro pozzetti in ciascun pozzetti (Figura 2C). Seguire la procedura indicata di seguito. NOTA: In questa fase di differenziazione, una capsula di Petri da 35 mm di solito contiene 3 - 3,5 x 106 cellule precursori neuroepiteliali. Pertanto, una capsula di Petri da 35 mm con cellule precursori neuroepiteliali è sufficiente per 3 - 4 pozzi di piastra di coltura a 24 pozzi con microwell.</li>
	<li>Preparare una piastra di coltura a 24 pozzetti con micro pozzetti: per ogni pozzetti, aggiungere 1 mL di terreno A. Centrifugare brevemente a 1.300 x g per 5 minuti in rotore a benna oscillante dotato di supporto per piastre. Controlla al microscopio che non ci siano bolle nei microwell.</li>
	<li>Preparare il mezzo B (Tabella 3).</li>
	<li>Rimuovere il mezzo dalla capsula di Petri con cellule precursori neuroepiteliali; lavare le cellule con 2 ml di DMEM/F12. Per il distacco cellulare, trattare le cellule con 1,5 mL di soluzione edTA da 0,48 mM preparata in PBS. Controllare il distacco cellulare al microscopio.</li>
	<li>Raccogliere le cellule in un tubo da 15 ml. Aggiungere 5 ml di DMEM/F12 nel tubo per lavare le cellule. Centrifuga a 200 x g per 5 min. Rimuovere le cellule surnatante e resuspend in 2 mL di mezzo B.</li>
	<li>Controllare la concentrazione cellulare e la vitalità mediante la colorazione Trypan Blue e un emocitometro. Calcolare il volume di sospensione necessario per contenere 1 x 106 celle vitali in totale.</li>
	<li>Trasferire la sospensione cellulare contenente 1 x10 6 cellule in ciascun pozzetti di una piastra a 24 pozzetti con micro pozzetti. Aggiungere il mezzo B fino a 2 ml in ciascun pozzo, pipettare delicatamente le cellule su e giù più volte e centrifugare brevemente 100 x g per 1 minuto per catturare le cellule nei micropzzetti. NOTA: il numero di celle per pozzo non deve superare 1 x 106. Altrimenti, gli sferoidi dei microwell vicini si fondono.</li>
	<li>Controllare al microscopio che le cellule siano distribuite uniformemente in microwell. Ripetere il pipettaggio e la centrifugazione se le cellule sono distribuite in modo non uniforme.</li>
	<li>Incubare la piastra durante la notte per consentire alle cellule di aggregarsi in sferoidi.</li>
</ol>4. Ottenimento e coltivazione di organoidi
<ol><li>La mattina successiva (giorno 15), controlla la qualità degli sferoidi al microscopio. Assicurarsi che siano trasparenti e lisci, se sani (Figura 2A,B). Raccogliere con cura gli sferoidi da ciascun pozzo in un tubo da 15 ml, lasciare precipitare gli sferoidi per gravità per 2-3 minuti, quindi rimuovere il surnatante.</li>
	<li>Aggiungere agli sferoidi 2 mL della matrice scongelata durante lo stesso tempo sul ghiaccio. Mescolare delicatamente per pipettaggio e incubare a temperatura ambiente per 30 minuti.</li>
	<li>Per lavare l'eccesso di matrice, aggiungere al tubo 8 mL di media B. Pipetta delicatamente, quindi centrifugare il tubo per 1 minuto a 100 x g. NOTA: Non superare il tempo e la velocità di centrifugazione per evitare l'aggregazione irreversibile di sferoidi.</li>
	<li>Rimuovere il surnatante. Aggiungere al tubo 2 mL di media B, pipettare delicatamente. Dividere la sospensione sferoidale tra due mini bioreattori, ciascuno contenente 4 ml di media B. Posizionare i mini bioreattori in una capsula di Petri da 15 cm per evitare l'evaporazione dell'acqua ed evitare la contaminazione.</li>
	<li>Metti la capsula di Petri con mini bioreattori su uno shaker orbitale. Coltivare gli organoidi ad una velocità di rotazione di 70-75 giri/min.</li>
	<li>Il giorno 16, preparare il mezzo C (Tabella 4).</li>
	<li>Trasferire gli organoidi in tubo da 15 ml. Per 5 minuti, lasciarli cadere sul fondo, aspirare il surnatante, aggiungere 5 ml di C medio. Restituire gli organoidi nei mini bioreattori. NOTA: Fare attenzione a non perdere gli sferoidi, che sono trasparenti e appena visibili.</li>
	<li>Coltivare sferoidi in C medio per due settimane, rinfrescando il mezzo ogni due giorni. Alla fine di queste due settimane, lasciare circa 100 sferoidi per mini bioreattore per la successiva coltivazione. Congelare gli sferoidi eccessivi in un mezzo di congelamento in azoto liquido.</li>
	<li>Il giorno 30, preparare il mezzo D (Tabella 5).</li>
	<li>Cambia il terreno di coltivazione in medio D, che è un mezzo di maturazione. Aggiornare il mezzo di coltivazione ogni 2-3 giorni per tre settimane, quindi utilizzare il mezzo D senza BDNF e GDNF.</li>
</ol>

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<li>Trujillo, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complex+oscillatory+waves+emerging+from+cortical+organoids+model+early+human+brain+network+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Complex oscillatory waves emerging from cortical organoids model early human brain network development.</a> Cell Stem Cell. 25 (4), 558-569 (2019).</li>
<li>Eremeev, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Necessity+Is+the+mother+of+invention%E2%80%9D+or+inexpensive%2C+reliable%2C+and+reproducible+protocol+for+generating+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry+%28Moscow%29%22%5BJournal%5D)">Necessity Is the mother of invention” or inexpensive, reliable, and reproducible protocol for generating organoids.</a> Biochemistry (Moscow). 84 (3), 321-328 (2019).</li>
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<li>Eremeev, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebral+organoids%E2%80%94challenges+to+establish+a+brain+prototype%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Cerebral organoids—challenges to establish a brain prototype.</a> Cells. 10 (7), 1790(2021).</li>
<li>Kadoshima, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-organization+of+axial+polarity%2C+inside-out+layer+pattern%2C+and+species-specific+progenitor+dynamics+in+human+ES+Cell-derived+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Self-organization of axial polarity, inside-out layer pattern, and species-specific progenitor dynamics in human ES Cell-derived neocortex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 110, 20284-20289 (2013).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Il protocollo descritto ha due passaggi cruciali che consentono la generazione di organoidi di alta qualità di dimensioni uniformi. In primo luogo, gli organoidi crescono da sferoidi che sono quasi identici nel numero di cellule e nella maturità cellulare. In secondo luogo, i bioreattori fatti in casa forniscono a ciascun organoide un ambiente uniforme, in cui gli organoidi non si affollano o si attaccano insieme.
La qualità cellulare e lo stato di maturazione cellulare sono essenziali per ese...

I modelli umani derivati da iPSC sono ampiamente utilizzati negli studi sui disturbi dello sviluppo neurologico e neurodegenerativo1. Negli ultimi dieci anni, i modelli di tessuto cerebrale 3D, i cosiddetti organoidi cerebrali, hanno essenzialmente completato le tradizionali colture neuronali 2D2. Gli organoidi ricapitolano in una certa misura l'architettura 3D del cervello embrionale e consentono una modellazione più precisa. Molti protocolli sono pubblicati per la generazione di organoidi che rappresentano diverse regioni del cervello: corteccia cerebrale3,4,5,cervelletto6,mesencefalo,encefalo, ipotalamo7,8,9e ippocampo10. Ci sono stati diversi esempi di utilizzo di organoidi per studiare le malattie del sistema nervoso umano11. Inoltre, gli organoidi sono stati implementati nelle scoperte di farmaci12 e utilizzati in studi di malattie infettive, tra cui SARS-Cov-213,14.
Gli organoidi cerebrali possono raggiungere fino a diversi millimetri di diametro. Quindi, la zona interna dell'organoide può soffrire di ipossia o malnutrizione e alla fine diventare necrotica. Pertanto, molti protocolli includono bioreattori speciali8, scuotitori o sistemi microfluidici15. Questi dispositivi possono richiedere grandi volumi di costosi supporti di coltura cellulare. Inoltre, il costo di tali apparecchiature è solitamente elevato. Alcuni bioreattori sono costituiti da molte parti meccaniche che li rendono difficili da sterilizzare per il riutilizzo.
La maggior parte dei protocolli soffre dell'"effetto batch"16, che genera una variabilità significativa tra gli organoidi ottenuti dalle iPSC identiche. Questa variabilità ostacola i test antidroga o gli studi preclinici che richiedono uniformità. L'alta resa di organoidi sufficiente per selezionare organoidi di dimensioni uniformi può parzialmente risolvere questo problema.
Anche il fattore tempo è un problema significativo. Matsui et al. (2018) hanno dimostrato che gli organoidi cerebrali richiedono almeno sei mesi per raggiungere la maturità17. Trujillo et al. (2019) hanno anche dimostrato che l'attività elettrofisiologica si è verificata negli organoidi solo dopo sei mesi di coltivazione18. A causa del lungo tempo di maturazione degli organoidi, i ricercatori spesso lanciano una nuova differenziazione prima di completare la precedente. Molteplici processi paralleli di differenziazione richiedono spese aggiuntive, attrezzature e spazio di laboratorio.
Abbiamo recentemente sviluppato un mini bioreattore che risolve principalmente i problemi sopra menzionati19. Questo bioreattore fatto in casa è costituito da un'adesione ultra-bassa o da una capsula di Petri non trattata con una manopola di plastica al centro. Questa manopola in plastica impedisce l'affollamento degli organoidi e la loro conglutinazione al centro della capsula di Petri, causata dalla rotazione dello shaker. Questo documento descrive come questo mini bioreattore fatto in casa economico e semplice consente di generare organoidi cerebrali di alta qualità in grandi quantità.

<table><tbody><tr><td>Advanced DMEM/F-12</td><td>Gibco</td><td>12634010</td><td>DMEM/F-12</td></tr><tr><td>AggreWell400</td><td>STEMCELL Technologies Inc</td><td>34425</td><td>Piastra di coltura a 24 pozzetti con micropozzetti</td></tr><tr><td>Integratore B-27</td><td>Gibco</td><td>17504044</td><td>Integratore neuronale B</td></tr><tr><td>GlutaMAX Integratore</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td>200 mM L-alanil-L-glutammina</td></tr><tr><td>BDNF umano</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-285</td><td></td></tr><tr><td>Umano FGF-2</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-839</td><td></td></tr><tr><td>Umano GDNF</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-290</td><td></td></tr><tr><td>KnockOut Siero di Ricambio</td><td>Gibco</td><td>10828028</td><td>Siero di Ricambio</td></tr><tr><td>mTESR1</td><td>STEMCELL Technologies Inc</td><td>85850</td><td>Pliripotente Cellule staminali</td></tr><tr><td>Medium N2 Integratore</td><td>Gibco</td><td></td><td></td>17502001</tr><tr><td>Neurobasal Medium</td><td>Gibco</td><td>21103049</td><td>Terreno basale per il mantenimento delle cellule neuronali</td></tr><tr><td>Soluzione di penicillina-streptomicina</td><td>Gibco</td><td>15140130</td><td></td></tr><tr><td>Plasmocin</td><td>InvivoGen</td><td>ant-mpt-1</td><td>Antimicrobici</td></tr><tr><td>Purmorphamine</td><td>EMD Millipore</td><td>540220</td><td></td></tr><tr><td>StemMACS Y27632</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-106-538</td><td>Y27632</td></tr><tr><td>StemMACS Dorsomorphin</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-104-466</td><td>Dorsomorphin</td></tr><tr><td>StemMACS LDN-193189</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-106-540</td><td>LDN-193189</td></tr><tr><td>StemMACS SB431542</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-106-543</td><td>SB431542</td></tr><tr><td>Trypan Blue Solution</td><td>Gibco</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Versen solution</td><td>Gibco</td><td>15040066</td><td>0,48 mM EDTA in PBS</td></tr><tr><td>&beta;-mercaptoetanolo</td><td>Gibco</td><td>31350010</td><td></td></tr></tbody></table>

generazione di organoidi cerebrali da cellule staminali pluripotenti indotte in mini bioreattori fatti in casa

Brain Organoid Generation from Induced Pluripotent Stem Cells in Home-Made Mini Bioreactors

L'organoide cerebrale derivato da iPSC è una tecnologia promettente per la modellazione in vitro delle patologie del sistema nervoso e lo screening farmacologico. Questa tecnologia è emersa di recente. È ancora agli inizi e ha alcune limitazioni ancora irrisolte. Gli attuali protocolli non consentono di ottenere organoidi sufficientemente coerenti per la scoperta di farmaci e studi preclinici. La maturazione degli organoidi può richiedere fino a un anno, spingendo i ricercatori a lanciare più processi di differenziazione contemporaneamente. Impone costi aggiuntivi per il laboratorio in termini di spazio e attrezzature. Inoltre, gli organoidi cerebrali hanno spesso una zona necrotica al centro, che soffre di carenza di nutrienti e ossigeno. Quindi, la maggior parte dei protocolli attuali utilizza un sistema circolante per il terreno di coltura per migliorare la nutrizione.
Nel frattempo, non ci sono sistemi dinamici economici o bioreattori per la coltivazione di organoidi. Questo documento descrive un protocollo per la produzione di organoidi cerebrali in mini bioreattori fatti in casa compatti ed economici. Questo protocollo consente di ottenere organoidi di alta qualità in grandi quantità.

Lo schema di protocollo è illustrato nella Figura 1. Il protocollo includeva cinque media in cui le iPSC si differenziavano in organoidi cerebrali per almeno un mese. La differenziazione è stata avviata quindi le iPSC hanno raggiunto la confluenza del 75-90% (Figura 2A,B). I primi segni di differenziazione verso i neuroni sono stati osservati nei giorni 10-11 della coltivazione di iPSC nel mezzo A, quando le cellule hanno iniziato a raggrupparsi...

Qui descriviamo un protocollo per la generazione di organoidi cerebrali da cellule staminali pluripotenti indotte umane (iPSC). Per ottenere organoidi cerebrali in grandi quantità e di alta qualità, utilizziamo mini bioreattori fatti in casa.

Generazione di organoidi cerebrali da cellule staminali pluripotenti indotte in mini bioreattori fatti in casa

The iPSC-derived brain organoid is a promising technology for in vitro modeling the pathologies of the nervous system and drug screening. This technology ...

Ad oggi, gli organoidi cerebrali differenziati dalle cellule staminali pluripotenti sono un modello 3D in vitro più vicino al tessuto cerebrale umano nativo. Inoltre, gli organoidi cerebrali sono ugualmente adatti per modellare varie patologie del sistema nervoso centrale, testare sostanze farmacologicamente attive e anche per l'uso in medicina rigenerativa. Nel frattempo, questa tecnologia è ancora nella fase iniziale di sviluppo.Il protocollo può essere diviso in due gruppi a seconda del metodo di ottenimento degli aggregati e dell'ulteriore coltivazione con differenziazione. Il primo comprende protocollo e schemi di differenziazione, diversi nel tempo di coltivazione e induttori di differenziazione con successiva maturazione di organoidi nello shaker in speciali dispositivi a bassa adesione come tubi o piastre di mercato. Un altro gruppo include l'uso di uno speciale bioreattore.L'analisi di vari protocolli ha dimostrato che gli organoidi dovrebbero essere coltivati in condizioni con mezzo nutritivo circolante. Tuttavia, l'assenza di sistemi semplici ed economici per ottenere organoidi con dimensioni e morfologia standard richiedono lo sviluppo di tali dispositivi per ridimensionare il processo. In questo lavoro, descriviamo il nostro metodo per ottenere e testare mini bioreattori semplici ed economici che consentono di ottenere grandi quantità di organoidi di alta qualità.Tagliare i tubi sterili della centrifuga da 15 millilitri negli anelli, 7 o 8 millimetri di altezza. Autoclave gli anelli. Rompere le basse aggregazioni su piastre di Petri trattate o microbiologiche in briciole.Sciogliere circa 1 grammo di briciole di plastica in 10 millilitri di cloroformio durante la notte per preparare una plastica liquida. Fai una manopola di plastica al centro di una piastra di Petri sterile a bassissima adesione di 6 centimetri. Ci sono due modi ugualmente adatti.Il primo, mettere l'autoclave in un anello di plastica su un centro e applicare mezzo millilitri di plastica liquida all'interno dell'anello. Il secondo, senza anelli di plastica, lascia cadere mezzo millilitro di plastica liquida al centro della capsula di Petri. Lasciare i piatti aperti per 2 o 3 ore in una cappa a flusso laminare fino alla completa secchezza.Coltivare cellule staminali pluripotenti indotte nel mezzo per cellule staminali pluripotenti, fino al 75 o 90% di confluenza nelle piastre di Petri da 35 millimetri, pre-rivestite con una matrice disciolta in freddo Dulbecco Modified Eagle Medium e Fisher-12 medium. Preparare il mezzo A più la sostituzione del siero. Coltivare cellule staminali pluripotenti indotte per 1 giorno nel mezzo con sostituzione del siero.Cambiare il mezzo per le cellule staminali pluripotenti in un mezzo di sostituzione del siero al giorno zero della differenziazione. Preparare il mezzo A.Cambiare il mezzo in medio A al giorno 2 di differenziazione. Coltivare le cellule nel mezzo A per 2 settimane, il mezzo rinfrescante nelle piastre di Petri ogni 2 giorni.Al giorno 14, iniziare la formazione di sferoidi utilizzando una speciale piastra di coltura a 24 pozzetti che contiene circa 1.200 microwell in ciascun pozzetti. Preparare una piastra di coltura a 24 pozzetti con micro pozzetti. Aggiungere ad ogni pozzetto 1 millilitro di media A, centrifugare brevemente a 1.300 g per 5 minuti in un rotore a benna oscillante dotato di portapiastre.Controlla al microscopio che non ci siano bolle nei microwell. Preparare il mezzo B.Rimuovere il mezzo dalla capsula di Petri. Per il distacco cellulare, trattare le cellule con 1,5 millilitri di soluzione EDTA preparata su PBS.Controllare il distacco cellulare al microscopio. Raccogliere la cella in un tubo da 15 millilitro. Aggiungere 5 millilitro misti Dulbecco e Fisher medium nel tubo verso le cellule.Centrifugare a 200g per 5 minuti. Rimuovere le cellule surnatante e ri-sospendere le cellule in 2 millilitro di mezzo B.Trasferire la sospensione di cellule contenente 1 miliardo di cellule in ciascun pozzetto di una piastra a 24 pozzetti con micro pozzetti. Pipettare delicatamente le celle su e giù più volte e centrifugare brevemente 100 g per 1 minuto per catturare la cellula in microwell.Controllare al microscopio che le cellule siano distribuite uniformemente in microwell. Incubare la piastra durante la notte per l'aggregazione cellulare in sferoidi. La mattina dopo, giorno 15, controlla al microscopio la qualità degli sferoidi, che sono trasparenti e lisci se sani.Raccogliere con cura gli sferoidi da ciascun pozzetto in un tubo da 15 millilitro, lasciare precipitare gli sferoidi per gravità per 2 e 3 minuti, quindi rimuovere il surnatante. Aggiungere agli sferoidi 2 millilitri della matrice, scongelati ed ex tempore su ghiaccio. Mescolare delicatamente per pipettaggio e incubare a temperatura ambiente per 30 minuti.Per lavare delicatamente l'eccesso di matrice, aggiungere al tubo 8 millilitri di B.Pipette medio, quindi centrifugare il tubo per 1 minuto a 100 g. Rimuovere il surnatante. Aggiungere al tubo 20 millilitri di medio B, pipettare delicatamente, quindi dividere la sospensione sferoide tra mini bioreattori.Quindi posizionare i mini bioreattori in una capsula di Petri di 15 centimetri, che impedisce l'evaporazione dell'acqua e la contaminazione. Metti la capsula di Petri con mini bioreattori su uno shaker orbitale. Coltivare gli organoidi a velocità di rotazione 70, 75rpm.Il giorno 16, preparare l'organoide C.Transfer medio in tubo da 50 millilitro. Per 5 minuti, lasciali cadere sul fondo. Aspirare il surnatante e aggiungere 5 millilitri del mezzo C.Ricongiunti agli organoidi nei mini bioreattori.Coltivare sferoidi in C medio per 2 settimane, rinfrescando il mezzo ogni 2 giorni. Durante queste 2 settimane, selezionare circa 100 sferoidi per mini bioreattori per la successiva coltivazione. Il giorno 30, preparare il mezzo D.Cambia il mezzo di coltivazione in medio D, che è un mezzo di maturazione.Aggiorna il terreno di coltivazione ogni 2 o 3 giorni per 3 settimane. Quindi utilizzare il mezzo D disciolto in F e GDNF. Dopo 1 mese di coltivazione consecutiva nei media A e B, si ottengono organoidi standardizzati per dimensioni e morfologia.Man mano che cresce, hanno bisogno di cambiare il mezzo più spesso, fino a 4 volte a settimana aumenta anche. Dopo 2 mesi di coltivazione, raggiungono i 4 e 5 millimetri di diametro. E dopo un altro mese, 5 e 6 millimetri e la crescita si ferma.La figura mostra l'aspetto dell'enzima organoide, sezioni chiare dipinte con ematossilina ed eosina. L'analisi immunoistochimica per 1 mese mostra la presenza di cluster SOX2 positivi di cellule progenitrici, anche all'interno della parte centrale. Nella periferica degli organoidi, la proteina acida fibrillare gliale, la proteina 2 associata ai microtubuli e la tiazina idrolasi positiva.Le cellule sono concentrate, il che corrisponde alla forma matura dei neuroni. In alcuni casi, gruppi di bianchi sull'area necrotica si formano nella parte centrale. Ciò indica la limitazione di questo protocollo per ottenere organoidi più grandi.Molto probabilmente, il fattore limitante della crescita è il tasso di diffusione di nutrienti e ossigeno. I vari media e tipi di cellule di sferoidi e testare il nostro sistema per alcuni tipi di organoidi. Un sacco di cervello e retina, organoidi combinati da cellule di carcinoma epatico e cellule staminali mesenchimali, organoidi combinati da richiami staminali mesenchimali di blast capitale e la differenziazione delle cellule staminali ematopoietiche da cellule staminali pluripotenti indotte e organoidi intestinali.Era variabile nella composizione iniziale delle cellule? Fattori di differenziazione, coltura e mezzo, matrice extracellulare e possibilmente anche la composizione della miscela di gas, la velocità di rotazione della piattaforma e altri parametri. Sarà possibile ottenere organoidi con la stessa forma, dimensione o modello morfologico in vari organi e tessuti.L'uso di mini bioreattori proposti in questo lavoro.

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Biologia dello sviluppo

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