Name: Valutazione della produzione epatica di glucosio in un modello murino di sindrome dellovaio policistico (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-05T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 44 s
Description: Scopri come misurare la produzione epatica di glucosio in un modello murino di sindrome dell'ovaio policistico utilizzando traccianti isotopici stabili e GCMS. Questo metodo permette di quantificare il metabolismo glucidico in condizioni di digiuno e carico.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Questo lavoro è stato supportato da sovvenzioni di formazione dal Dipartimento di Ostetricia e Ginecologia, Baylor College of Medicine (ALG) e R-01 research grant (Grant # DK114689) per CSB, SC e JM dal National Institutes of Health.

Tutte le procedure per gli animali sono state approvate dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) del Baylor College of Medicine.
1. Preparazione di [6,6-2H2]glucosio
<ol><li>Un giorno prima della procedura, preparare il tracciante di glucosio isotopico stabile in soluzione salina normale. Per questo esperimento, il glucosio [6,6-2H2] è stato usato come tracciante per misurare il tasso di comparsa del glucosio plasmatico. NOTA: In questo esperimento, è stata misurata la produzione di glucosio durante il digiuno e le condizioni ricche di glucosio, quindi l'isotopo del glucosio è stato preparato in due diversi preparati. Preparare le soluzioni in modo tale che la dose finale di infusione sia vicina rispettivamente a 1 mg/(kg·min) e 2 mg/(kg·min). Queste concentrazioni sono state ottimizzate da diversi studi pilota precedenti.</li>
	<li>Preparare il primo infuso con solo [6,6-2H2]glucosio come tracciante per rappresentare la condizione di digiuno sciogliendo glucosio sterile e privo di pirogeni [6,6-2H2] in soluzione sterile di cloruro di sodio allo 0,9%.</li>
	<li>Preparare il secondo infuso sciogliendo sia il tracciante di glucosio [6,6-2H2] che il glucosio non isotopico (~ 20 mg / kg·min) in una soluzione sterile di cloruro di sodio allo 0,9% per simulare la condizione alimentata. NOTA: Nel presente esperimento, è stata utilizzata un'infusione a velocità costante innescata di [6,6-2H2]glucosio a (~) 1,08 mg/(kg·min) (condizione di digiuno) e (~) 1,9 mg/kg·min (condizione ricca di glucosio). Al fine di imitare la "condizione ricca di glucosio", la velocità di infusione di D-glucosio è stata fissata a (~) 18,8 mg/(kg·min).</li>
	<li>Una volta preparate le soluzioni, filtrare sterili le soluzioni con un filtro da 0,22 μm e conservare a 4 °C. Riscaldare le soluzioni a temperatura ambiente prima dell'infusione. Caricare le soluzioni su siringhe preetichettate da 1 mL.</li>
	<li>Impostare la pompa per facilitare un'infusione a velocità costante innescata del primo infusato (per condizioni basali) contenente solo il tracciante e programmare la pompa per un'infusione a velocità costante dell'isotopo a 150 μL/h per 3 ore.</li>
	<li>Al termine dell'impostazione del digiuno di 3 ore, sostituire la prima siringa infusata con la seconda siringa infuso contenente il tracciante isotopico e D-glucosio (per lo stato di alimentazione simulato) e innescare l'infusione per l'iniziale 15 min a 600 μL/h. Impostare la pompa su un'infusione a velocità costante a 150 μL/h per le ulteriori 3 ore.</li>
</ol>2. Impostazione degli esperimenti di infusione
<ol><li>Rimuovi i topi dalle loro gabbie domestiche e mettili nelle loro gabbie di digiuno 3 ore prima dell'inizio dell'esperimento. Per questo esperimento, è stata utilizzata una topa femmina di 4 mesi del ceppo C57BL / 6J. NOTA: Questa procedura non richiede alcuna analgesia prima o durante la procedura data la sua natura minimamente invasiva.</li>
	<li>Assemblare l'attrezzatura di ingabbiamento raggruppando i topi in un determinato numero di topi per pompa di insulina. Posiziona le partizioni sopra una base piatta e stabile per creare stalli individuali per i topi. È importante avere accesso al catetere della vena della coda per far funzionare l'infusione, quindi assicurarsi che ci sia una tacca nella parte inferiore della porta della gabbia. NOTA: Le gabbie mostrate nel video sono state realizzate appositamente per questo esperimento. Le gabbie sono chiare e realizzate in plexiglass. C'è una base piatta e stabile (attrezzatura di ingabbiamento standard) su cui si trovano le partizioni. Questa configurazione è composta da diversi pezzi per consentire una facile installazione in diversi ambienti a seconda dell'altezza del tavolo e delle esigenze dello sperimentatore. La porta della gabbia scorre per chiudersi e ha una tacca nella parte inferiore per consentire alla coda di passare.</li>
	<li>Assemblare le siringhe da 1 mL contenenti 1 mL di infusato basale, quindi collegarle al tubo della pompa di infusione utilizzando il tubo di polietilene 0,28 mm ID x 0,61 mm.</li>
	<li>Preparare la pompa per infusione impostando la velocità su 150 μL/h, che è la velocità basale.</li>
	<li>Riscaldare un bagno d'acqua a 48 °C.</li>
	<li>Preparare la stazione di inserimento del catetere adiacente al bagno d'acqua contenente gli aghi da 30 G da 0,5 pollici, il tubo silastico ID da 0,3 mm x 0,64 mm e il nastro trasparente da 1 pollice.</li>
	<li>Dopo 3 ore di digiuno, iniziare il processo di inserimento del catetere, che è dettagliato di seguito.</li>
</ol>3. Inserimento del catetere
<ol><li>Selezionare un mouse e posizionarlo in un supporto sicuro con accesso alla coda. Un esempio di cosa usare è una bottiglia tagliata a metà con una tacca per la coda. Posizionare il supporto su una base piatta. Posizionare un pezzo di nastro adesivo sulla porzione prossimale della coda per consentire lo spazio per l'inserimento del catetere in modo più distale. NOTA: il tipo di nastro scelto per questa attività deve avere una resistenza e un'adesività moderate. In questo esperimento è stato utilizzato un nastro di etichettatura multiuso a base di carta in quanto è delicato e facile da staccare.</li>
	<li>Preparare il catetere (ago da 30 G attaccato a un tubo silastico da 0,3 mm e PE-10 sterilizzato a gas) attaccandolo a una siringa da 1 mL contenente lavaggio salino eparinizzato sterile. Lavare delicatamente il catetere.</li>
	<li>Portare il mouse a bagnomaria e inserire la coda nel bagno d'acqua per circa 30-45 s. Questo aiuta a dilatare la vascolarizzazione della coda per il posizionamento del catetere.</li>
	<li>Eseguire l'inserimento del catetere in condizioni sterili. Una volta riscaldata la coda, pulire la coda con salviette benzalconio e posizionare un piccolo morsetto di alligatore rame e sdentato, che in precedenza era sagomato a forma di coda, come un laccio emostatico all'estremità prossimale della coda. Visualizzare la vena laterale della coda sotto una lente d'ingrandimento, quindi inserire con attenzione il catetere nella vena della coda e prelevare l'ago. Lavare delicatamente la soluzione per garantire la pervietà del catetere.</li>
	<li>Avvolgere un pezzo di nastro transporo da 1 pollice attorno al sito di inserimento per fissare il catetere. Rimuovere il piccolo laccio emostatico dalla coda.</li>
</ol>4. Impostazione dell'infusione e prima infusione
<ol><li>Posiziona il mouse nella sua gabbia individuale e chiudi la porta scorrevole, assicurandoti che la coda sporga attraverso la tacca e rimanga all'esterno della gabbia.</li>
	<li>Posizionare un ulteriore pezzo di nastro adesivo su tutto il catetere e la coda per fissarlo alla piastra di base della gabbia. Per questo passaggio è stato utilizzato un nastro per etichette colorato multiuso.</li>
	<li>Scollegare il filo dal catetere della vena di coda e posizionare un piccolo morsetto sul tubo silastico del catetere per evitare il riflusso mentre si collega la linea di infusione dalla pompa.</li>
	<li>Una volta fissato saldamente, rimuovere il morsetto e sciacquare con la soluzione di adescamento, che consiste nell'infuso. Assicurarsi che la soluzione sia limpida nel tubo e non macchiata di sangue.</li>
	<li>Prendere nota del tempo di inizio dell'infusione per assicurarsi che funzioni per il tempo totale di circa 3 ore. Se vengono utilizzate più gabbie contemporaneamente, devono essere sfalsate per gestire efficacemente i tempi di infusione.</li>
	<li>Una volta che le linee di infusione sono notate per funzionare correttamente, rimuovere il coperchio dal mouse. Posiziona la biancheria da letto standard attorno al mouse.</li>
	<li>Iniziare l'infusione con il primo infuso contenente il tracciante ed eseguirlo per 3 ore ininterrottamente. Per tutta la durata dell'infusione, continuare a controllare il benessere dei topi e le linee di infusione. Assicurarsi che il tubo di infusione sia fissato correttamente e che non vi siano perdite dai punti di connessione della linea.</li>
</ol>5. Prelievo di sangue
<ol><li>Al termine della prima infusione, interrompere l'infusione, posizionare un morsetto sul tubo silastico sul catetere per impedire il riflusso. Rimuovere delicatamente i topi dai loro recinti senza disturbare il catetere per raccogliere il sangue. Posizionali in un punto vicino alle gabbie per il prelievo di sangue. Per questo esperimento, i topi sono stati sottoposti a venipuntura della guancia usando una lancetta da 4 mm.</li>
	<li>Raccogliere ~75 μL di sangue nel flaconcino desiderato. Per deproteinizzare i campioni in preparazione per la spettrometria di massa, aggiungere circa 15 μL di sangue a 500 μL di acetone. Il sangue rimanente può essere utilizzato per controllare il livello di glucosio nel sangue tramite il glucometro e / o centrifugato per separare il plasma per futuri saggi ormonali.</li>
</ol>6. Seconda infusione
<ol><li>Rimuovere gli infusi dalle pompe della siringa scollegando il tubo dalle siringhe e sostituirlo con il secondo infusato contenente il tracciante insieme al glucosio. Ripetere i passaggi da 4,2 a 4,7 utilizzando l'infusione isotopica di glucosio ricca di glucosio.<ol>
<li>Per raggiungere uno stato stazionario, eseguire un bolo del secondo infuso a 600 μL/h per 15 min. Nota l'ora di inizio per ogni gruppo di gabbie. Ridurre la velocità di infusione a 150 μL/h per completare le 3 ore di tempo totale di infusione.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ripetere i passaggi 5.1 e 5.2.</li>
	<li>Arrestare la pompa di infusione e rimuovere delicatamente il catetere della vena di coda, applicare pressione sui siti del catetere fino a quando l'emorragia si ferma e riportare i topi alle loro gabbie domestiche.</li>
	<li>Santizzare e disinfettare accuratamente la configurazione di ingabbiamento con acqua e sapone standard. NOTA: Questa è una procedura di sopravvivenza. I topi possono essere restituiti alle gabbie e tenuti per ulteriori esperienze, se necessario. Si raccomanda di non eseguire ulteriori esperienze per almeno una settimana dopo questa procedura per garantire un adeguato benessere degli animali.</li>
</ol>7. Spettrometria di massa
<ol><li>Inviare i campioni per la spettrometria di massa.</li>
	<li>Analisi<ol>
<li>Misurare l'arricchimento isotopico del glucosio [6,6-2H2] mediante gascromatografia - spettrometria di massa (GCMS) utilizzando il derivato pentaacetato21,22. In breve, questo metodo prevede la preparazione del derivato pentaacetato del glucosio, seguita da analisi del campione utilizzando GCMS 20,22.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Calcoli<ol>
<li>Eseguire tutte le misurazioni cinetiche in condizioni di stato stazionario. Il tasso di comparsa totale del glucosio plasmatico (glucosio Ra) è stato calcolato dall'arricchimento M+2 del [6,6-2H2]glucosio nel plasma utilizzando equazioni di diluizione isotopica stabilite21. In condizioni di stato stazionario, si presume che il tasso di comparsa del glucosio sia uguale al tasso di scomparsa del glucosio. Tasso di produzione di glucosio endogeno (mg/(kg·min)) (GPR) = glucosioRa - glucosio esogeno.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>March, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+prevalence+of+polycystic+ovary+syndrome+in+a+community+sample+assessed+under+contrasting+diagnostic+criteria%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">The prevalence of polycystic ovary syndrome in a community sample assessed under contrasting diagnostic criteria.</a> Human Reproduction. 25 (2), 544-551 (2009).</li>
<li>Yildiz, B. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence%2C+phenotype+and+cardiometabolic+risk+of+polycystic+ovary+syndrome+under+different+diagnostic+criteria%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Prevalence, phenotype and cardiometabolic risk of polycystic ovary syndrome under different diagnostic criteria.</a> Human Reproduction. 27 (10), 3067-3073 (2012).</li>
<li>Rotterdam ESHRE/ASRM-Sponsored PCOS Consensus Workshop Group
. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revised+2003+consensus+on+diagnostic+criteria+and+long-term+health+risks+related+to+polycystic+ovary+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Fertility+and+Sterility%22%5BJournal%5D)">Revised 2003 consensus on diagnostic criteria and long-term health risks related to polycystic ovary syndrome.</a> Fertility and Sterility. 81 (1), 19-25 (2004).</li>
<li>Goodarzi, M. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polycystic+ovary+syndrome%3A+etiology%2C+pathogenesis+and+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Polycystic ovary syndrome: etiology, pathogenesis and diagnosis.</a> Nature Reviews. Endocrinology. 7 (4), 219-231 (2011).</li>
<li>Azziz, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introduction%3A+Determinants+of+polycystic+ovary+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Fertility+and+Sterility%22%5BJournal%5D)">Introduction: Determinants of polycystic ovary syndrome.</a> Fertility and Sterility. 106 (1), 4-5 (2016).</li>
<li>Baskind, N. E., Balen, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypothalamic-pituitary%2C+ovarian+and+adrenal+contributions+to+polycystic+ovary+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Best+Practice+and+Research.+Clinical+Obstetrics+%26+Gynaecology%22%5BJournal%5D)">Hypothalamic-pituitary, ovarian and adrenal contributions to polycystic ovary syndrome.</a> Best Practice and Research. Clinical Obstetrics & Gynaecology. 37, 80-97 (2016).</li>
<li>Burghen, G. A., Givens, J. R., Kitabchi, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+of+hyperandrogenism+with+hyperinsulinism+in+polycystic+ovarian+disease%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Correlation of hyperandrogenism with hyperinsulinism in polycystic ovarian disease.</a> The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 50 (1), 113-116 (1980).</li>
<li>Bremer, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polycystic+ovary+syndrome+in+the+pediatric+population%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolic+Syndrome+and+Related+Disorders%22%5BJournal%5D)">Polycystic ovary syndrome in the pediatric population.</a> Metabolic Syndrome and Related Disorders. 8 (5), 375-394 (2010).</li>
<li>Dunaif, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excessive+insulin+receptor+serine+phosphorylation+in+cultured+fibroblasts+and+in+skeletal+muscle.+A+potential+mechanism+for+insulin+resistance+in+the+polycystic+ovary+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Excessive insulin receptor serine phosphorylation in cultured fibroblasts and in skeletal muscle. A potential mechanism for insulin resistance in the polycystic ovary syndrome.</a> The Journal of Clinical Investigation. 96 (2), 801-810 (1995).</li>
<li>Højlund, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+insulin-stimulated+phosphorylation+of+Akt+and+AS160+in+skeletal+muscle+of+women+with+polycystic+ovary+syndrome+is+reversed+by+pioglitazone+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Impaired insulin-stimulated phosphorylation of Akt and AS160 in skeletal muscle of women with polycystic ovary syndrome is reversed by pioglitazone treatment.</a> Diabetes. 57 (2), 357-366 (2008).</li>
<li>Moghetti, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Divergences+in+insulin+resistance+between+the+different+phenotypes+of+the+polycystic+ovary+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Divergences in insulin resistance between the different phenotypes of the polycystic ovary syndrome.</a> The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 98 (4), 628-637 (2013).</li>
<li>Ovalle, F., Azziz, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin+resistance%2C+polycystic+ovary+syndrome%2C+and+type+2+diabetes+mellitus%5BTitle%5D)+AND+%22Fertility+and+Sterility%22%5BJournal%5D)">Insulin resistance, polycystic ovary syndrome, and type 2 diabetes mellitus.</a> Fertility and Sterility. 77 (6), 1095-1105 (2002).</li>
<li>Dunaif, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profound+peripheral+insulin+resistance%2C+independent+of+obesity%2C+in+polycystic+ovary+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Profound peripheral insulin resistance, independent of obesity, in polycystic ovary syndrome.</a> Diabetes. 38 (9), 1165-1174 (1989).</li>
<li>Hutchison, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+exercise+on+insulin+resistance+and+body+composition+in+overweight+and+obese+women+with+and+without+polycystic+ovary+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Endocrinology+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Effects of exercise on insulin resistance and body composition in overweight and obese women with and without polycystic ovary syndrome.</a> The Journal of Clinical Endocrinology Metabolism. 96 (1), 48-56 (2011).</li>
<li>Stepto, N. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Women+with+polycystic+ovary+syndrome+have+intrinsic+insulin+resistance+on+euglycaemic-hyperinsulaemic+clamp%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Women with polycystic ovary syndrome have intrinsic insulin resistance on euglycaemic-hyperinsulaemic clamp.</a> Human Reproduction. 28 (3), 777-784 (2013).</li>
<li>Basu, R., Schwenk, W. F., Rizza, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Both+fasting+glucose+production+and+disappearance+are+abnormal+in+people+with+%26%2334%3Bmild%26%2334%3B+and+%26%2334%3Bsevere%26%2334%3B+type+2+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%2C+Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Both fasting glucose production and disappearance are abnormal in people with &#34;mild&#34; and &#34;severe&#34; type 2 diabetes.</a> American Journal of Physiology, Endocrinology and Metabolism. 287 (1), 55-62 (2004).</li>
<li>Blesson, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex+dependent+dysregulation+of+hepatic+glucose+production+in+lean+Type+2+diabetic+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Sex dependent dysregulation of hepatic glucose production in lean Type 2 diabetic rats.</a> Frontiers in Endocrinology. 10, Lausanne. 538(2019).</li>
<li>Caldwell, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+reproductive%2C+metabolic%2C+and+endocrine+features+of+polycystic+ovary+syndrome+in+female+hyperandrogenic+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Characterization of reproductive, metabolic, and endocrine features of polycystic ovary syndrome in female hyperandrogenic mouse models.</a> Endocrinology. 155 (8), 3146-3159 (2014).</li>
<li>Chappell, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prenatal+androgen+induced+lean+PCOS+impairs+mitochondria+and+mRNA+profiles+in+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrine+Connections%22%5BJournal%5D)">Prenatal androgen induced lean PCOS impairs mitochondria and mRNA profiles in oocytes.</a> Endocrine Connections. 9 (3), 261-270 (2020).</li>
<li>Chacko, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+gluconeogenesis+using+glucose+fragments+and+mass+spectrometry+after+ingestion+of+deuterium+oxide%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physiology%22%5BJournal%5D)">Measurement of gluconeogenesis using glucose fragments and mass spectrometry after ingestion of deuterium oxide.</a> Journal of Applied Physiology. 104 (4), 944-951 (2008).</li>
<li>Bier, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+%26%2334%3Btrue%26%2334%3B+glucose+production+rates+in+infancy+and+childhood+with+6%2C6-dideuteroglucose%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Measurement of &#34;true&#34; glucose production rates in infancy and childhood with 6,6-dideuteroglucose.</a> Diabetes. 26 (11), 1016-1023 (1977).</li>
<li>Chacko, S. K., Sunehag, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gluconeogenesis+continues+in+premature+infants+receiving+total+parenteral+nutrition%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Disease+in+Childhood.+Fetal+and+Neonatal+Edition%22%5BJournal%5D)">Gluconeogenesis continues in premature infants receiving total parenteral nutrition.</a> Archives of Disease in Childhood. Fetal and Neonatal Edition. 95 (6), 413-418 (2010).</li>
<li>Chacko, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+ghrelin+on+glucose+regulation+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%2C+Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Effect of ghrelin on glucose regulation in mice.</a> American Journal of Physiology, Endocrinology and Metabolism. 302 (9), 1055-1062 (2012).</li>
<li>Marini, J. C., Lee, B., Garlick, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-surgical+alternatives+to+invasive+procedures+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Animals%22%5BJournal%5D)">Non-surgical alternatives to invasive procedures in mice.</a> Laboratory Animals. 40 (3), 275-281 (2006).</li>
<li>Jacobs, J. D., Hopper-Borge, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carotid+artery+infusions+for+pharmacokinetic+and+pharmacodynamic+analysis+of+taxanes+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Carotid artery infusions for pharmacokinetic and pharmacodynamic analysis of taxanes in mice.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (92), e51917(2014).</li>
<li>Ayala, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperinsulinemic-euglycemic+clamps+in+conscious%2C+unrestrained+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Hyperinsulinemic-euglycemic clamps in conscious, unrestrained mice.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (57), e3188(2011).</li>
<li>Kmiotek, E. K., Baimel, C., Gill, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+Intravenous+Self+Administration+in+a+Mouse+Model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Methods for Intravenous Self Administration in a Mouse Model.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (70), e3739(2012).</li>
<li>Marini, J. C., Lee, B., Garlick, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+urea+kinetic+studies+in+conscious+mice%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Nutrition%22%5BJournal%5D)">In vivo urea kinetic studies in conscious mice.</a> The Journal of Nutrition. 136 (1), 202-206 (2006).</li>
<li>Choukem, S. -P., Gautier, J. -F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+measure+hepatic+insulin+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Metabolism%22%5BJournal%5D)">How to measure hepatic insulin resistance.</a> Diabetes Metabolism. 34 (6), Pt 2 664-673 (2008).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

L'iperglicemia e il metabolismo anormale del glucosio / omeostasi sono caratteristiche della PCOS. Il livello di glucosio nel sangue è mantenuto da una combinazione di glucosio dalla dieta e produzione di glucosio attraverso la glicogenolisi e la gluconeogenesi e la glicogenesi, sotto il controllo di ormoni ed enzimi. La produzione epatica di glucosio è soppressa dalla presenza di un aumento dei livelli di glucosio circolante. Nei disturbi del metabolismo anormale del glucosio, la regolazione della soppressione ...

La sindrome dell'ovaio policistico (PCOS) è una malattia comune che si verifica nel 12%-20% delle donne in età riproduttiva1,2. È una malattia complessa che provoca fenotipi variabili che coinvolgono ovaie policistiche, mestruazioni irregolari e prove cliniche o di laboratorio di iperandrogenemia, e viene tipicamente diagnosticata quando una donna soddisfa due dei tre criteri3. Un aspetto predominante della PCOS, e un fattore chiave nella sua patogenesi, sono gli squilibri metabolici che si trovano nelle donne che hanno la malattia. Le donne con PCOS hanno una maggiore incidenza di insulino-resistenza, intolleranza al glucosio, obesità e sindrome metabolica3,4,5,6. La resistenza all'insulina non è solo una manifestazione della malattia, ma si pensa che contribuisca alla sua patogenesi potenziando l'azione dell'ormone luteinizzante nell'ovaio portando così ad un aumento della produzione di androgeni7,8. Si ritiene che la resistenza all'insulina abbia diverse possibili origini, ma gli studi suggeriscono che potrebbe essere dovuta a modelli anormali di segnalazione del recettore dell'insulina9,10. Gli studi hanno valutato la resistenza all'insulina nei pazienti con PCOS utilizzando la tecnica gold standard del morsetto iperinsulinemico-euglicemico11,12,13,14,15. Le donne con PCOS, indipendentemente dal BMI, hanno livelli più elevati di insulino-resistenza rispetto ai controlli. Il controllo dell'insulina sulla produzione di glucosio è compromesso nei disturbi della resistenza all'insulina che portano alla produzione eccessiva di glucosio. Ad esempio, i pazienti diabetici hanno un aumento dei tassi di gluconeogenesi e una ridotta soppressione della glicogenolisi16. Inoltre, è stata osservata una ridotta soppressione della produzione di glucosio nei ratti diabetici17. Sebbene gli studi sui morsetti possano fornire una misurazione della resistenza all'insulina, pochi studi sulla PCOS si concentrano sulla misurazione diretta della produzione di glucosio negli stati di digiuno e alimentazione. Ciò richiede l'uso di un'infusione di traccianti di glucosio isotopico non radioattivo e la misurazione tramite spettrometria di massa.
I modelli animali sono stati ampiamente utilizzati nella ricerca sulla PCOS. Sia i modelli murini di PCOS magri che quelli obesi sono stati creati somministrando androgeni prenatale, prepubertale o post-puberale18. I modelli di PCOS dei roditori dimostrano anche differenze metaboliche rispetto ai rispettivi controlli. Dati precedenti del nostro laboratorio hanno dimostrato test di tolleranza al glucosio anormali (GTT) in modelli murini PCOS (magri e obesi), coerenti con la letteratura PCOS umana19. L'uso di un modello animale magro e obeso consente ulteriori indagini sulle differenze metaboliche. Nello specifico, questo modello consente di valutare il tasso di produzione di glucosio direttamente utilizzando traccianti isotopici del glucosio. Uno dei traccianti isotopici del glucosio stabile più comunemente usato è il glucosio [6,6-2H2]. L'arricchimento del glucosio [6,6-2H2] può essere misurato utilizzando un derivato del pentaacetato come descritto in precedenza20.
In questo studio, il nostro obiettivo era misurare il tasso di produzione di glucosio epatico a digiuno e allo stato ricco di glucosio nei topi PCOS utilizzando l'infusione isotopica di glucosio. Queste tecniche possono essere applicate a una vasta gamma di esperimenti che coinvolgono la cinetica del glucosio.

<table><tbody><tr><td>Soluzione di cloruro di sodio allo 0,9%</td><td>McKesson</td><td>275595</td><td></td></tr><tr><td>10 mL Siringa BD con punta Luer-Lok</td><td>VWR</td><td>75846-756</td><td>Due siringhe per animale (una per la soluzione isotopica di glucosio, una per la soluzione isotopica ricca di glucosio)</td></tr> <tr><td>Nastro traspore trasparente da 1 pollice</td><td>3M</td><td>70200400169</td><td></td></tr><tr><td>Nastro per etichettatura da 1 pollice</td><td>Fisher</td><td>GS07F161BA</td><td>Brand è un esempio</td></tr><tr><td>Siringa da 5 mL contenente soluzione salina eparanizzata</td><td>McKesson</td><td>191-MIH-2235</td><td>Si può anche preparare una soluzione di lavaggio con eparina (10 unità/mL di eparina in cloruro di sodio allo 0,9%)</td></tr><tr><td>5 mm Medipoint Goldenrod lancette per animali</td><td>Fisher</td><td>Scientific NC9891620</td><td>5 mm se l'animale ha un'età compresa tra 2 e 6 mesi</td></tr><tr><td>Acetone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>650501</td><td></td></tr><tr><td>Agitatore avanzato con piastra riscaldante</td><td>VWR</td><td>97042-602</td><td>Il marchio è l'esempio</td></tr><tr><td>Aghi BD calibro 27 da 0,5 pollici Health</td><td>Warehouse</td><td>A283952</td><td></td></tr><tr><td>Aghi da 0,5 pollici calibro BD 30</td><td>Bicchiere Medvet</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>BD Intramedic 0,28 mm ID x 0,61 mm</td><td>VWR</td><td>63019-004</td><td></td></tr><tr><td>BD Intramedic Tubo in polietilene (PE) 0,28 mm ID x 0,61 mm</td><td>VWR</td><td>63019-004</td><td></td></tr><tr><td>Becher, 1000 ml</td><td></td><td></td><td>Qualsiasi marca</td></tr><tr><td>Pellet per gabbia Fiale</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>in vetro VOA trasparente con tappo chiuso</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-719-120</td><td>Per la conservazione di campioni di acetone e prelievo di sangue</td></tr><tr><td>Morsetto a coccodrillo senza denti in rame per laccio emostatico</td><td>Amazon</td><td></td><td>Qualsiasi marca; clip a coccodrillo senza denti lisci in rame massiccio</td></tr><tr><td>D-(+)-glucosio >99,5%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>D-glucosio (6,6-D2, 99%)</td><td>Cambridge Isotope Laboratories, Inc.</td><td>DLM-349-PK</td><td></td></tr><tr><td>Dow Corning tubo silastico 0,3 mm ID x 0,64 mm OD</td><td>VWR</td><td>62999-042</td><td></td></tr><tr><td>Lente d'ingrandimento</td><td>Amazon</td><td></td><td>Qualsiasi marca; simile a LANCOSC Lente d'ingrandimento con luce e supporto</td></tr><tr><td>Microbalance</td><td>Ohaus Adventurer Pro</td><td>AV264C</td><td>È possibile utilizzare qualsiasi modello simile con precisione di 0,0001 g</td></tr><tr><td>Flacone Nalgene, 500 mL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0158-12EA</td><td>O qualsiasi marca simile; sega a metà (compreso il coperchio) e taglio della tacca delle dimensioni di una coda nella parte inferiore PHD</td></tr><tr><td>Ultra pompa multi-siringa</td><td>Harvard Apparatus</td><td>70-3024A</td><td></td></tr><tr><td>Foglio</td><td></td><td></td> di plexiglass <td>Qualsiasi marca; per stabilizzare il topo durante l'inserimento del catetere</td></tr><tr><td>Fogli di plexiglass e divisori Qualsiasi</td><td></td><td></td><td>marca; utilizzato per ingabbiare i topi durante l'infusione</td></tr></tbody></table>

valutazione della produzione epatica di glucosio in un modello murino di sindrome dell'ovaio policistico

Evaluation of Hepatic Glucose Production in a Polycystic Ovary Syndrome Mouse Model

La sindrome dell'ovaio policistico (PCOS) è una malattia comune che provoca disturbi del metabolismo del glucosio, come l'insulino-resistenza e l'intolleranza al glucosio. Il metabolismo disregolato del glucosio è una manifestazione importante della malattia ed è la chiave della sua patogenesi. Pertanto, gli studi che coinvolgono la valutazione del metabolismo del glucosio nella PCOS sono della massima importanza. Pochissimi studi hanno quantificato la produzione di glucosio epatico direttamente in modelli PCOS utilizzando traccianti di glucosio non radioattivi. In questo studio, discutiamo le istruzioni passo-passo per la quantificazione del tasso di produzione di glucosio epatico in un modello murino PCOS misurando l'arricchimento M + 2 di [6,6-2H2] glucosio, un tracciante isotopico stabile del glucosio, tramite gascromatografia - spettrometria di massa (GCMS). Questa procedura prevede la creazione di una soluzione stabile di tracciante isotopico del glucosio, l'uso del posizionamento del catetere della vena della coda e l'infusione del tracciante del glucosio sia a digiuno che ricchi di glucosio nello stesso topo in tandem. L'arricchimento del glucosio [6,6-2H2] viene misurato utilizzando il derivato del pentaacetato in GCMS. Questa tecnica può essere applicata a un'ampia varietà di studi che coinvolgono la misurazione diretta del tasso di produzione epatica di glucosio.

Utilizzando equazioni di diluizione isotopica precedentemente descritte, il tasso di glucosio plasmatico totale (glucoseRa) è stato calcolato dall'arricchimento M+2 di [6,6-2H2]glucosio in condizioni di digiuno e ricche di glucosio utilizzando il derivato pentaacetato21. In condizioni di stato stazionario, si presume che il tasso di comparsa del glucosio sia uguale al tasso di scomparsa del glucosio. Nel gruppo di controllo, il glugerba totale è stato di...

Questo studio descrive la misurazione diretta della produzione epatica di glucosio in un modello murino di sindrome dell'ovaio policistico utilizzando un tracciante di glucosio isotopico stabile attraverso la vena della coda sia a digiuno che in stati ricchi di glucosio in tandem.

Valutazione della produzione epatica di glucosio in un modello murino di sindrome dell'ovaio policistico

Polycystic ovary syndrome (PCOS) is a common disease that results in disorders of glucose metabolism, such as insulin resistance and glucose intolerance. ...

L'obiettivo di questa procedura è determinare la produzione epatica di glucosio in una sindrome dell'ovaio policistico o modello murino PCOS. Il metabolismo disregolato del glucosio è una manifestazione importante della PCOS ed è la chiave per la sua patogenesi. Pertanto, gli studi che coinvolgono la valutazione del metabolismo del glucosio nella PCOS sono della massima importanza.In questo studio, discutiamo le istruzioni passo-passo per la quantificazione del tasso di produzione di glucosio epatico in un modello murino PCOS misurando l'arricchimento M più due di sei sei glucosio deuterato, un tracciante di glucosio isotopico stabile, tramite gascromatografia, spettrometria di massa o GCMS. Questa procedura prevede la creazione di una soluzione stabile di tracciante isotopico del glucosio, l'uso del posizionamento del catetere della vena della coda e l'infusione del tracciante del glucosio sia a digiuno che ricchi di glucosio nello stesso topo in tandem. Un giorno prima della procedura, preparare il tracciante di glucosio isotopico stabile in soluzione salina normale.Per questo esperimento, la produzione di glucosio durante il digiuno in condizioni ricche di glucosio è stata misur

evaluation-hepatic-glucose-production-polycystic-ovary-syndrome-mouse

Research

Ricerca

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Il iperinsulinemico-euglicemico morsetto, o pinza insulina, è il gold standard per valutare l'azione...

Iperinsulinemico-euglicemico Morsetti in Cosciente, Mouse sfrenato

Questo video introduce come eseguire un test di tolleranza al glucosio orale su un topo da laboratorio.

Test di tolleranza al glucosio orale (OGTT): misurazione del metabolismo del glucosio nei topi

Questo articolo descrive un modo per preparare e inserire pellet di diidrotestosterone (DHT) per modellare la sindrome dell'ovaio policistico (PCOS) nei topi. Il protocollo di esempio dimostra la procedura nei topi utilizzati per gli studi riproduttivi e metabolici.

Trattamento sottocutaneo del diidrotestosterone (DHT): modello murino di sindrome dell'ovaio policistico (PCOS)

Qui, vengono descritti metodi ottimizzati per generare modelli in vivo e in vitro di steatosi epatica e per analizzare i fenotipi steatotici e i relativi parametri fisiologici.

Analisi ottimizzata delle<em&gt; In Vivo</em&gt; e<em&gt; In Vitro</em&gt; Epatica steatosi

L'articolo attuale descrive la generazione e la caratterizzazione metabolica di topi di dieta-federazione di grassi come modello di resistenza all'insulina indotta da dieta e obesità. È dotato di ulteriori protocolli dettagliati per eseguire il test di tolleranza al glucosio orale e la prova di tolleranza dell'insulina, monitoraggio corpo intero alterazioni del metabolismo del glucosio in vivo.

Studio In Vivo del metabolismo del glucosio nei topi di dieta-federazione di grassi utilizzando Test di tolleranza al glucosio orale (OGTT) e Test di tolleranza dell'insulina (ITT)

Descriviamo lo sviluppo di un modello murino di PCOS-come magro con pellet di diidrotestosterone per studiare la fisiopatologia della PCOS e la discendenza da queste dighe di PCOS-come.

Un modello di Mouse Hyperandrogenic per studiare la sindrome dell'ovaio policistico

Gli epatociti primari sono uno strumento prezioso per studiare la risposta epatica e il metabolismo in vitro. Utilizzando reagenti disponibili in commercio, è stato sviluppato un protocollo migliorato efficiente in termini di tempo e lavoro per l'isolamento degli epatociti primari del topo.

Un protocollo migliorato efficiente in termini di tempo e fatica per l'isolamento degli epatociti primari del topo

L'β-ossidazione degli acidi grassi è una via metabolica essenziale responsabile della generazione di energia in molti tipi di cellule diverse, compresi gli epatociti. Qui, descriviamo un metodo per misurare l'β-ossidazione degli acidi grassi in epatociti primari appena isolati utilizzando acido palmitico marcato con 14C.

Misurazione della β-ossidazione degli acidi grassi in una sospensione di epatociti di topo appena isolati

Qui, presentiamo un metodo robusto per la perfusione in situ del fegato di topo per studiare la regolazione acuta e diretta del metabolismo epatico senza disturbare l'architettura epatica ma in assenza di fattori extra-epatici.

Produzione di glucosio epatico, ureagenesia e lipolisi quantificate utilizzando il modello di fegato di topo perfuso

Questo protocollo introduce una tecnica per indurre modelli di sindrome dell'ovaio policistico (PCOS) nei topi attraverso il rilascio controllato di letrozolo utilizzando mini-pompe. In anestesia adeguata, la mini-pompa è stata impiantata per via sottocutanea e la PCOS è stata indotta con successo nei topi dopo un certo periodo di rilascio della mini-pompa.

Una tecnica modificata per indurre la sindrome dell'ovaio policistico nei topi

Scopri come misurare la produzione epatica di glucosio in un modello murino di sindrome dell'ovaio policistico utilizzando traccianti isotopici stabili e GCMS. Questo metodo permette di quantificare il metabolismo glucidico in condizioni di digiuno e carico.

Valutazione della produzione epatica di glucosio in un modello murino di sindrome dell'ovaio policistico

Esplora altri video