Valutazione del consumo di aminoacidi in cellule ossee in coltura e alberi ossei isolati
13 aprile 2022
Questo protocollo presenta un saggio di assorbimento di aminoacidi radiomarcato, utile per valutare il consumo di aminoacidi sia nelle cellule primarie che nelle ossa isolate.
L'assorbimento e il metabolismo degli aminoacidi sono essenziali per la specificazione, la differenziazione e la formazione ossea degli osteoblasti. Questo protocollo fornisce un metodo rapido e sensibile per valutare l'assorbimento di aminoacidi. Il nostro protocollo utilizza aminoacidi radiomarcati per quantificare l'assorbimento di aminoacidi.
È un metodo economico, sensibile e veloce che può essere facilmente modificato per diverse condizioni. Questo protocollo può essere facilmente modificato per valutare l'assorbimento di altri nutrienti radiomarcati come glucosio e acidi grassi in una varietà di tessuti e cellule primarie o trasformate. Per iniziare la piastra di saggio di assorbimento degli aminoacidi cinque volte 10 alle quarte cellule ST2 in ciascun pozzetto di una piastra di coltura tissutale a 12 pozzetti in mezzo alfa MEM integrato con FBS, penicillina e streptomicina.
Piastra extra pozzetti di cellule per quantificare il numero di celle per condizione per le normalizzazioni. Successivamente, incubare le cellule in un incubatore di coltura cellulare umidificata a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica per due o tre giorni fino al confluente. Dopo l'incubazione aspirare il mezzo e lavare le cellule due volte con un millilitro di PBS a pH 7,4.
Quindi aspirare il PBS prima di lavare le cellule una volta con un millilitro di Krebs-Ringer HEPES o KRH. Incubare le cellule con 0,5 millilitri di KRH appena preparato contenente quattro microcurie per millilitro di glutammina triziata L34 per cinque minuti. Dopo l'incubazione, raccogliere il mezzo radioattivo da erogare nel contenitore dei rifiuti liquidi.
Quindi lavare le cellule tre volte con KRH ghiacciato per terminare la reazione. Quindi, aggiungere un millilitro di 1% di sodio dodecilsolfato a ciascun pozzetto e triturare la miscela 10 volte per lisare e omogeneizzare le cellule. Quindi trasferire i lisati cellulari in un tubo da 1,5 millilitri e chiarire il lisato centrifugando ad una velocità minima di 10.000 G per 10 minuti.
Trasferire il surnatante in un flaconcino di scintillazione contenente otto millilitri della soluzione di scintillazione e leggere l'attività radio e i conteggi al minuto utilizzando il contatore di scintillazione. Dalle restanti piastre non radioattive di cellule, tripsinizzare, risospendere e contare le cellule per stimare il numero di cellule nelle colture radioattive lisate. Utilizzando un ematocitometro, contare il numero di cellule per pozzo non radioattivo per ogni condizione sperimentale.
Per determinare l'assorbimento di aminoacidi, scovare il midollo dall'osso prima di pesare l'albero osseo. Per decellularizzare l'osso, far bollire un omero in PBS a 100 gradi Celsius per 10 minuti. Equilibrare sia l'humeri vivo che quello bollito in un millilitro di KRH per 30 minuti nell'incubatore di coltura cellulare a 37 gradi Celsius.
Successivamente, incubare separatamente le ossa di controllo sperimentali e bollite in KRH appena preparato contenente quattro microcurry per millilitro di arginina tricizzata L234 per un massimo di 90 minuti a 37 gradi Celsius. Dopo aver rimosso il mezzo radioattivo, terminare la reazione lavando l'omero tre volte con un millilitro di KRH ghiacciato. Trasferire ogni osso in un tubo da 1,5 millilitri con 500 microlitri di tampone RIPA.
Quindi omogeneizzare l'omero e il tampone RIPA tagliando 100 volte con le forbici, seguito da sonicazione al 35% di ampiezza e un secondo impulso per 10 secondi. Chiarificato il lisato mediante centrifugazione per 10 minuti a 10.000 volte G a temperatura ambiente. Dopo la centrifugazione, trasferire 200 microlitri di surnatante in flaconcini di scintillazione contenenti otto millilitri della soluzione di scintillazione.
Leggere l'attività radio utilizzando il contatore di scintillazione. Le proprietà cinetiche dell'assorbimento triziato di glutammina L34 in vitro e delle cellule ST2 confluenti sono state valutate in presenza o assenza di acido isobutirrico metilamminico di sodio o litio. La rimozione del sodio ha portato ad una riduzione del 90% dell'assorbimento di glutammina.
La presenza di litio ha aumentato l'assorbimento di glutammina del 2% rispetto alla condizione priva di sodio. Mentre l'acido metil amminoisobuttrico non ha influenzato l'assorbimento di glutammina. I contributi percentuali stimati del sistema A, N, L o ASC e gamma più L hanno indicato che la maggior parte dell'assorbimento di glutammina è mediato dai sistemi ASC e gamma più L.Il sistema N è responsabile di circa il 2% di assorbimento di glutammina dipendente dal sodio.
E il sistema A ha mostrato lo 0% di contributo e assorbimento. L'assorbimento tritiato di arginina X-VIVO L34 nell'omeri neonatale bollito e vivo è stato analizzato nel corso di due ore. L'assorbimento di arginina è aumentato linearmente durante l'esperimento e gli omeri vivi.
L'humeri bollito non ha mostrato un aumento dinamico dell'assorbimento di arginina nell'esperimento. L'analisi rappresentativa mostra l'assorbimento normalizzato e corretto di arginina. È importante far bollire l'osso controlaterale come controllo attivo.
Questo passaggio è essenziale in quanto la matrice ossea può assorbire amminoacidi radioattivi, con risultati imprecisi. Il protocollo ha permesso di confermare la cinetica di assorbimento degli aminoacidi sia in vitro che in vivo.
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Panoramica
Questo protocollo presenta un saggio di assorbimento di aminoacidi radiomarcati, utile per valutare il consumo di aminoacidi sia in cellule primarie che in ossa isolate. Fornisce un metodo rapido e sensibile per quantificare l'assorbimento degli aminoacidi.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Biologia cellulare
- Metabolismo osseo
Sfondo
- L'assunzione di aminoacidi è fondamentale per la specificazione e la differenziazione degli osteoblasti.
- Il metodo utilizza aminoacidi marcati radioattivamente per la quantificazione.
- Può essere adattato a diverse condizioni e ad altri nutrienti.
- Questo saggio è applicabile a cellule primarie e trasformate.
Scopo dello studio
- Valutare il consumo di aminoacidi in diversi tipi cellulari.
- Fornire un saggio economico e sensibile ai ricercatori.
- Facilitare modifiche per la valutazione di altri nutrienti.
Metodi Utilizzati
- Piastrella le cellule ST2 in una piastra da coltura cellulare a 12 pozzetti.
- Utilizza mezzo alpha MEM integrato con FBS, penicillina e streptomicina.
- Impiega amminoacidi radioattivi per la misurazione dell'assorbimento.
- Adatta il protocollo per glucosio e acidi grassi secondo necessità.
Risultati principali
- Ha dimostrato un metodo rapido e sensibile per l'assorbimento degli aminoacidi.
- Ha mostrato l'adattabilità del saggio a diverse condizioni.
- Ha convalidato l'uso di nutrienti marcati con isotopi radioattivi in diversi tessuti.
- Ha confermato l'efficacia sia nelle cellule primarie che in quelle trasformate.
Conclusioni
- Il saggio di incorporazione degli aminoacidi radiomarcati è efficace per la ricerca.
- Può essere modificato per diverse condizioni sperimentali.
- Questo metodo migliora la comprensione dell'assorbimento dei nutrienti nella biologia ossea.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La quantificazione dell'assorbimento di aminoacidi nelle cellule ossee e nelle diafisi ossee isolate fornisce un indicatore sensibile dell'attività metabolica degli osteoblasti, direttamente collegata a proliferazione, differenziazione e secrezione della matrice. Questo saggio consente una valutazione meccanicistica e una riduzione del rischio per i target anabolici ossei, collegando il trasporto dei nutrienti agli stati funzionali degli osteoblasti. Supporta la validazione dei target nei programmi per l'osteoporosi e la guarigione delle fratture, offrendo un biomarcatore quantitativo e traslabile della risposta precoce degli osteoblasti.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Verifica ipotesi terapeutiche misurando il flusso di aminoacidi come parametro funzionale dell'attivazione degli osteoblasti.
- Valore operativo: Consente lo screening rapido di modulatori genetici o farmacologici del trasporto dei nutrienti in modelli di osteoblasti primari e trasformati.
- Valore predittivo: Supporta la selezione di portafogli correlando la cinetica dell'assorbimento con fenotipi differenziati e di secrezione della matrice.
Sviluppo di screening e saggi
- Prontezza del saggio: Genera dati quantitativi standardizzati sull'assorbimento mediante l'uso di traccianti radiomarcati per la conferma dei risultati positivi in sistemi primari di cellule e di diafisi ossee es vivo.
- Scalabilità: Adattabile a formati multi-pozzetto per lo screening dose-risposta di composti che influenzano i trasportatori di aminoacidi.
- Riproducibilità: Include una normalizzazione interna tramite il conteggio cellulare e controlli su ossa controlaterali per ridurre al minimo la variabilità tra le diverse condizioni.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Rilevanza per le malattie: Misura direttamente l'utilizzo dei nutrienti negli osteoblasti, un tipo cellulare chiave nei disturbi della formazione ossea.
- Continuità traslazionale: Collega i risultati ottenuti in vitro con saggi su diafisi ossee ex vivo, supportando la validazione preclinica dell'interazione con il bersaglio.
- Decisioni basate sulla valutazione del rischio: Fornisce biomarcatori metabolici precoci per orientare decisioni di avanzamento o interruzione nello sviluppo di terapie ossee.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il saggio si inserisce nel percorso di scoperta che va dalla validazione del bersaglio all'ottimizzazione del composto leader, fornendo un'analisi funzionale del metabolismo che integra i saggi fenotipici e trascrizionali in biologia ossea.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi collegando l'attività dei trasportatori di aminoacidi agli stati di proliferazione e differenziazione degli osteoblasti.
- Screening: Fornisce risultati quantitativi basati su traccianti, adatti alla standardizzazione dei saggi e alla riproducibilità tra laboratori.
- Analisi: Genera dati cinetici (ad esempio, velocità di uptake, profili di inibizione) che permettono di confrontare gli effetti dei composti sui sistemi di trasporto dei nutrienti.
- Ricerca traslazionale: Collega i meccanismi di uptake cellulare alle risposte a livello tissutale nell'osso isolato, aumentando l'affidabilità predittiva.
- Riutilizzo aziendale: La progettazione indipendente dalla piattaforma consente l'applicazione su diverse classi di nutrienti (ad esempio, glucosio, acidi grassi) e su diversi sistemi modello, incrementando l'utilità a lungo termine.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Riduce l'ambiguità meccanicistica fornendo evidenze dirette del flusso di nutrienti durante la progressione della linea cellulare degli osteoblasti.
- Valore operativo: Un flusso di lavoro standardizzato con controlli integrati garantisce la riproducibilità tra diversi tipi cellulari e preparazioni tissutali.
- Valore strategico: Migliora l'efficienza del capitale consentendo l'eliminazione precoce dei rischi associati ai bersagli sulla base dell'impegno metabolico funzionale.
- Impatto sul portafoglio: Facilita la priorizzazione corretta per rischio dei candidati anabolici per l'osso attraverso biomarcatori quantificabili nella fase iniziale.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella manipolazione di isotopi radioattivi, nel conteggio con scintillazione e nelle tecniche di coltura cellulare/tissutale.
- È dipendente dall'accesso a contatori a scintillazione, centrifughe e tamponi standardizzati (KRH, RIPA) per ottenere risultati costanti.
- Necessita di un allineamento tra i diversi gruppi di lavoro sulle strategie di normalizzazione (numero di cellule, peso dell'osso) per garantire la comparabilità dei dati.
- L'adattamento a diversi nutrienti o tessuti richiede una nuova ottimizzazione dei tempi di incubazione e delle concentrazioni dei traccianti.
- I limiti pratici includono le norme di sicurezza relative alla radioattività e la necessità di campioni di controllo abbinati (ad esempio, osso bollito) per correggere il legame non specifico.
