Name: Valutazione del consumo di aminoacidi in cellule ossee in coltura e alberi ossei isolati (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 32 s
Description: Impara a valutare il consumo di aminoacidi in cellule ossee e alberi ossei isolati con questo metodo rapido e sensibile. Utilizza aminoacidi radiomarcati per quantificare l'assorbimento in vitro e in vivo.

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Il laboratorio Karner è supportato dalle sovvenzioni R01 del National Institute of Health (AR076325 e AR071967) a C.M.K.

Tutte le procedure sui topi descritte nel presente documento sono state approvate dai comitati di studi sugli animali presso l'Università del Texas Southwestern Medical Center di Dallas. Il protocollo sulle radiazioni è stato approvato dal Comitato consultivo per la sicurezza delle radiazioni presso l'Università del Texas Southwestern Medical Center di Dallas.
1. Assorbimento di aminoacidi nelle cellule (Protocollo I)
<ol><li>Piastra 5 x 104 cellule ST2 in ciascun pozzetto di una piastra di coltura tissutale a 12 pozzetti. Cellule di piastra in α-MEM contenenti 10% FBS, 100 U/mL di penicillina e 0,1 μg/mL di streptomicina (Pen/Strep). Piastra extra pozzetti di cellule per quantificare il numero di celle per condizione per le normalizzazioni nel passaggio 1.12. Incubare le cellule in un incubatore di coltura cellulare umidificata a 37 °C con il 5% di CO2.</li>
	<li>Coltiva le cellule per 2-3 giorni fino a quando non sono confluenti.</li>
	<li>Il giorno dell'esperimento, preparare le seguenti soluzioni: 1x soluzione salina tamponata fosfato (PBS), pH 7,4 e tampone Krebs Ringers HEPES (KRH), pH 8,0: (120 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl 2, 1 mM MgCl2, NaHCO3, 5 mM HEPES, 1 mM D-glucosio). Preriscaldare a 37 °C.</li>
	<li>Aspirare il mezzo e lavare le cellule due volte con 1 mL di 1x PBS, pH 7,4. NOTA: questo protocollo è appropriato anche per dividere rapidamente le celle non confluenti. In questo caso, è importante normalizzare la radioattività al numero assoluto di cellule o al contenuto di DNA. Inoltre, considerare di aumentare le dimensioni della piastra o del pallone di coltura per aumentare il numero complessivo di cellule e i valori di cpm. Questo è importante per determinare empiricamente su base individuale.</li>
	<li>Aspirare 1x PBS e lavare le cellule una volta con 1 mL di KRH.</li>
	<li>Produrre 4 μCi/mL di L-[3,4-3 H]-glutammina diluendo 4 μL di [1 μCi μL-1] L-[3,4-3 H]-glutammina per 1 mL di KRH. NOTA: Prima di utilizzare materiali radioattivi, contattare l'Ufficio per la sicurezza delle radiazioni dell'istituto di origine per ottenere le approvazioni. Tutte le procedure relative alle radiazioni devono essere eseguite dietro lo schermo in plexiglass.</li>
	<li>Incubare cellule con 0,5 mL di KRH contenenti 4 μCi/mL L-[3,4-3 H]-glutammina terreno di lavoro per 5 min.</li>
	<li>Raccogliere il mezzo radioattivo e distribuirlo nel contenitore dei rifiuti liquidi. Lavare brevemente le cellule tre volte con KRH ghiacciato per terminare la reazione. Raccogliere e gettare tutti i lavaggi nel contenitore dei rifiuti liquidi radioattivi.</li>
	<li>Aggiungere 1 mL di SDS all'1% a ciascun pozzetto e triturare 10x per lisare e omogeneizzare le cellule. Trasferire i lisati cellulari in provette da 1,5 ml. Eliminare le piastre di coltura cellulare, le pipette sierologiche e le punte delle pipette nel contenitore dei rifiuti radioattivi solidi.</li>
	<li>Centrifugare a >10.000 x g per 10 min. Trasferire i surnatanti in flaconcini di scintillazione contenenti 8 mL della soluzione di scintillazione. Mescolare agitando energicamente i flaconcini a scintillazione. Eliminare i tubi e le punte delle pipette nel contenitore dei rifiuti radioattivi solidi.</li>
	<li>Leggere la radioattività in conteggi al minuto (cpm) utilizzando un contatore di scintillazione. Gettare i flaconcini di scintillazione nel contenitore per rifiuti del flaconcino di scintillazione.</li>
	<li>Tripsinizzare, risospendere e contare le cellule dalle rimanenti piastre non radioattive di cellule (vedere il punto 1.1) per stimare il numero di cellule nelle colture radioattive lisate. Utilizzando un emocitometro, contare il numero di cellule per pozzo non radioattivo per ogni condizione sperimentale. Normalizzare il cpm dal punto 1.11 al numero stimato di cellule dalle piastre non radioattive.</li>
	<li>Dopo il completamento dell'esperimento, decontaminare la cappa di coltura cellulare, il banco e tutti gli strumenti con uno spray decontaminante alla radioattività. Infine, eseguire test di pulizia per garantire che l'area di lavoro sia priva di radiazioni.</li>
</ol>2. Assorbimento di aminoacidi nei tessuti ossei appena isolati (Protocollo II)
<ol><li>Preriscaldare KRH a 37 °C.</li>
	<li>Eutanasia un topo di 3 giorni e rimuovere la pelle sulle braccia. Disarticolare l'omeri dalla spalla usando le forbici e sezionare entrambi gli omeri. Rimuovere tutti i tessuti estemporanei usando un bisturi e una pinza. Rimuovere le epifisi dall'osso. NOTA: Oltre agli humerii, questo protocollo può essere adattato a femori, tibie e calvarie neonatali, nonché a umeri, femori e tibie isolati da topi di 2 e 4 mesi (dati non pubblicati).</li>
	<li>Eliminare il midollo dall'osso e pesare gli alberi ossei per normalizzarli nel passaggio 2.14.</li>
	<li>Far bollire un omero in 1x PBS a 100 °C per 10 minuti per decellularizzare l'osso. L'osso bollito decellularizzato viene utilizzato come controllo negativo. NOTA: Come controllo di qualità, la paraffina incorpora le ossa bollite e non bollite per le macchie istologiche per confermare visivamente che l'ebollizione era efficace nella decellularizzazione dell'osso.</li>
	<li>Equilibrare entrambi gli omeri in 1 mL di KRH per 30 minuti nell'incubatore per colture cellulari a 37 °C.</li>
	<li>Preparare una soluzione di lavoro di 4 μCi/mL L-[2,3,4-3 H]-arginina in KRH diluendo 4 μL di 1μCi/μL L-[2,3,4-3 H]- Arginina per 1 mL KRH. NOTA: Questo protocollo è appropriato per valutare l'assorbimento di qualsiasi nutriente radiomarcato sia scelto. L-[2,3,4-3 H]-glutammina, L-[14CU]-alanina e L-[2,3-3 H]-prolina sono stati testati con risultati simili. I dati di arginina sono mostrati per evidenziare l'utilità di questo protocollo. ATTENZIONE: Tutte le procedure che utilizzano radiazioni devono essere eseguite dietro lo schermo in plexiglass utilizzando appositi dispositivi di protezione individuale (DPI).</li>
	<li>Incubare separatamente sia l'osso di controllo sperimentale che quello bollito in KRH contenente 4 μCi/mL di L-[2,3,4-3 H]-arginina per un massimo di 90 minuti a 37 °C. NOTA: È importante determinare empiricamente i tempi di incubazione per diverse condizioni tra cui l'età dei topi, i diversi elementi scheletrici e i tipi di aminoacidi radiomarcati eseguendo un corso temporale. La saturazione si verifica per lo più dopo circa 3-4 ore. L'assorbimento dovrebbe essere valutato in un punto temporale nella rabbia lineare dell'assorbimento.</li>
	<li>Rimuovere il mezzo radioattivo e gettarlo nel contenitore dei rifiuti radioattivi liquidi. Lavare l'humeri tre volte usando 1 mL ghiacciato di KRH per terminare la reazione. Eliminare tutti i lavaggi nel contenitore dei rifiuti radioattivi liquidi.</li>
	<li>Trasferire ogni osso in un tubo da 1,5 ml. Aggiungere 500 μL di tampone RIPA [150 mM NaCl; 5 mM EDTA; 50 mM Tris (pH 8,0); 0,5% NP40 (v/v); 0,5% DOX (p/v); 0,1% SDS (p/v)]. Gettare le piastre di coltura, le pipette sierologiche e le punte delle pipette in un contenitore di rifiuti solidi radioattivi.</li>
	<li>Omogeneizzare gli omeri tagliando 100 volte con le forbici in un tampone RIPA.</li>
	<li>Sonicare (ampiezza: 35%, impulso 1 s) l'osso omogeneizzato risultante per 10 s. NOTA: La sonicazione è anche nota per produrre aerosol. Le fasi di sonicazione possono essere eseguite in un armadio di sicurezza biologica. Per ridurre la formazione di aerosol, è importante non riempire eccessivamente i tubi. La sonicazione di piccoli volumi di campioni può comportare una sonicazione incompleta o la perdita di campioni a causa della formazione di schiuma. In caso di formazione di schiuma, centrifugare il campione per 5 minuti per depositare.</li>
	<li>Chiarire il lisato mediante centrifugazione per 10 minuti a >10.000 x g a temperatura ambiente. Trasferire 200 μL del surnatante in flaconcini di scintillazione contenenti 8 mL della soluzione di scintillazione. Mescolare agitando energicamente i flaconcini a scintillazione. Gettare tutti i rifiuti radioattivi solidi (ad esempio, tubi usati, punte di pipette, piastre, ecc.) nel contenitore dei rifiuti radioattivi solidi.</li>
	<li>Leggere la radioattività (cpm) utilizzando il contatore di scintillazione. Gettare i flaconcini a scintillazione usati nel contenitore dei rifiuti radioattivi designato per i flaconcini di scintillazione.</li>
	<li>Sottrarre il cpm dell'osso bollito (valore basale) dal cpm dell'osso sperimentale. Normalizzare la radioattività con il peso osseo dal punto 2.3.</li>
	<li>Spruzzare la cappa di coltura cellulare, gli strumenti e il banco con decontaminante radioattivo. Eseguire test di pulizia per verificare che l'area di lavoro sia priva di radiazioni.</li>
</ol>

<ol><li>Xiao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+%CE%B1-KG-dependent+histone+and+DNA+demethylases+by+fumarate+and+succinate+that+are+accumulated+in+mutations+of+FH+and+SDH+tumor+suppressors%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Inhibition of α-KG-dependent histone and DNA demethylases by fumarate and succinate that are accumulated in mutations of FH and SDH tumor suppressors.</a> Genes & Development. 26 (12), 1326-1338 (2012).</li>
<li>Altman, B. J., Stine, Z. E., Dang, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+Krebs+to+clinic%3A+glutamine+metabolism+to+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">From Krebs to clinic: glutamine metabolism to cancer therapy.</a> Nature Reviews Cancer. 16 (10), 619-634 (2016).</li>
<li>Karner, C. M., Long, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt+signaling+and+cellular+metabolism+in+osteoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Wnt signaling and cellular metabolism in osteoblasts.</a> Cell and Molecular Life Sciences. 74 (9), 1649-1657 (2017).</li>
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<li>Green, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Branched-chain+amino+acid+catabolism+fuels+adipocyte+differentiation+and+lipogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Branched-chain amino acid catabolism fuels adipocyte differentiation and lipogenesis.</a> Nature Chemical Biology. 12 (1), 15-21 (2016).</li>
<li>Shiraki, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methionine+metabolism+regulates+maintenance+and+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Methionine metabolism regulates maintenance and differentiation of human pluripotent stem cells.</a> Cell Metabolism. 19 (5), 780-794 (2014).</li>
<li>Yu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamine+metabolism+regulates+proliferation+and+lineage+allocation+in+skeletal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Glutamine metabolism regulates proliferation and lineage allocation in skeletal stem cells.</a> Cell Metabolism. 29 (4), 966-978 (2019).</li>
<li>Shen, L., Sharma, D., Yu, Y., Long, F., Karner, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biphasic+regulation+of+glutamine+consumption+by+WNT+during+osteoblast+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Biphasic regulation of glutamine consumption by WNT during osteoblast differentiation.</a> Journal of Cell Science. 134 (1), (2021).</li>
<li>Karner, C. M., Esen, E., Okunade, A. L., Patterson, B. W., Long, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+glutamine+catabolism+mediates+bone+anabolism+in+response+to+WNT+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Increased glutamine catabolism mediates bone anabolism in response to WNT signaling.</a> Journal of Clinical Investigation. 125 (2), 551-562 (2015).</li>
<li>Hu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+amino+acid+sensor+Eif2ak4%2FGCN2+is+required+for+proliferation+of+osteoblast+progenitors+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bone+and+Mineral+Research%22%5BJournal%5D)">The amino acid sensor Eif2ak4/GCN2 is required for proliferation of osteoblast progenitors in mice.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 35 (10), 2004-2014 (2020).</li>
<li>Rached, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FoxO1+is+a+positive+regulator+of+bone+formation+by+favoring+protein+synthesis+and+resistance+to+oxidative+stress+in+osteoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">FoxO1 is a positive regulator of bone formation by favoring protein synthesis and resistance to oxidative stress in osteoblasts.</a> Cell Metabolism. 11 (2), 147-160 (2010).</li>
<li>Elefteriou, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATF4+mediation+of+NF1+functions+in+osteoblast+reveals+a+nutritional+basis+for+congenital+skeletal+dysplasiae%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">ATF4 mediation of NF1 functions in osteoblast reveals a nutritional basis for congenital skeletal dysplasiae.</a> Cell Metabolism. 4 (6), 441-451 (2006).</li>
<li>Maleknia, S. D., Johnson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry+of+amino+acids+and+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Amino+Acids%2C+Peptides+and+Proteins+in+Organic+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry of amino acids and proteins.</a> Amino Acids, Peptides and Proteins in Organic Chemistry. , 1-50 (2011).</li>
<li>Rennie, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+introduction+to+the+use+of+tracers+in+nutrition+and+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22The+Proceedings+of+the+Nutrition+Society%22%5BJournal%5D)">An introduction to the use of tracers in nutrition and metabolism.</a> The Proceedings of the Nutrition Society. 58 (4), 935-944 (1999).</li>
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<li>Rosenbusch, J. P., Flanagan, B., Nichols, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+transport+of+amino+acids+into+bone+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Active transport of amino acids into bone cells.</a> Biochimica Biophysica Acta. 135 (4), 732-740 (1967).</li>
<li>Kandasamy, P., Gyimesi, G., Kanai, Y., Hediger, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amino+acid+transporters+revisited%3A+New+views+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Amino acid transporters revisited: New views in health and disease.</a> Trends in Biochemical Sciences. 43 (10), 752-789 (2018).</li>
</ol>

Gli autori non hanno rivelazioni.

Il protocollo qui descritto fornisce un approccio rapido e sensibile per valutare l'assorbimento di aminoacidi in risposta a varie permutazioni sperimentali sia in vitro che ex vivo. Rispetto ai kit disponibili in commercio (ad esempio, Glutamine and Glutamate Determination Kit), questo metodo è molto più sensibile, più veloce e meno laborioso16,17,25. Nel nostro protocollo, valutiamo l'assorbimento nel buffer ...

Gli amminoacidi sono composti organici che contengono un gruppo funzionale amminico (-NH2) e carbossilico (-COOH) con una catena laterale variabile specifica per ciascun amminoacido. In generale, gli amminoacidi sono ben noti come costituenti di base delle proteine. Più recentemente, sono stati chiariti nuovi usi e funzioni degli amminoacidi. Ad esempio, i singoli amminoacidi possono essere metabolizzati per generare metaboliti intermedi che contribuiscono alla bioenergetica, funzionano come cofattori enzimatici, regolano le specie reattive dell'ossigeno o sono usati per sintetizzare altri amminoacidi 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 . Molti studi dimostrano che il metabolismo degli aminoacidi è fondamentale per la pluripotenza, la proliferazione e la differenziazione cellulare in vari contesti 3,6,11,12,13,14,15,16,17.
Gli osteoblasti sono cellule secretorie che producono e secernono la matrice ossea extracellulare ricca di collagene di tipo 1. Per sostenere alti tassi di sintesi proteica durante la formazione ossea, gli osteoblasti richiedono un apporto costante di aminoacidi. Per soddisfare questa domanda, gli osteoblasti devono acquisire attivamente aminoacidi. Coerentemente con questo, studi recenti rivelano l'importanza dell'assorbimento e del metabolismo degli aminoacidi nell'attività degli osteoblasti e nella formazione ossea 15,16,17,18,19,20.
Gli osteoblasti acquisiscono aminoacidi cellulari da tre fonti principali: ambiente extracellulare, degradazione intracellulare delle proteine e biosintesi de novo degli aminoacidi. Questo protocollo si concentrerà sulla valutazione dell'assorbimento di aminoacidi dall'ambiente extracellulare. I metodi più comuni per misurare l'assorbimento di aminoacidi si basano su amminoacidi radiomarcati (ad esempio, 3H o 14C) o marcati con isotopi pesanti (ad esempio, 13C). I saggi di isotopomeri pesanti possono analizzare l'assorbimento degli amminoacidi e il metabolismo in modo più approfondito e sicuro, ma richiedono più tempo e richiedono più giorni per essere completati poiché ci vuole un giorno per preparare e derivatizzare i campioni e più giorni per analizzare sullo spettrometro di massa a seconda del numero di campioni21,22. In confronto, i saggi di assorbimento degli aminoacidi radiomarcati non sono informativi sul metabolismo a valle, ma sono economici e relativamente veloci, potendo essere completati entro 2-3 ore dall'inizio dell'esperimento23,24. Qui, descriviamo un protocollo di base facilmente modificabile progettato per valutare l'assorbimento di aminoacidi radiomarcati in cellule primarie in coltura o linee cellulari in vitro o singoli alberi ossei ex vivo. L'applicazione di questi due protocolli può essere estesa ad altri aminoacidi radiomarcati e ad altri tipi cellulari e tessuti associati all'osso.

<table><tbody><tr><td>0,25% tripsina</td><td>Gibco</td><td>25200</td><td></td></tr><tr><td>Piastra a 12 pozzetti</td><td>Corning</td><td>3513</td><td></td></tr><tr><td>Siringa da 1 mL</td><td>309628</td><td></td><td>di precisione BD</td></tr><tr><td>30G Ago</td><td>di precisione BD</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>Arginina Monocloridrato L-[2,3,4-3H]-, 1mCi</td><td>PerkinElmer</td><td>NET1123001MC</td><td></td></tr><tr><td>Contatore a scintillazione Beckman LS6500</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di calcio</td><td>Sigma</td><td>C1016</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di colina</td><td>Sigma</td><td>C7077</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione D-(+)-glucosio</td><td>Sigma</td><td>G8769</td><td></td></tr><tr><td>Strumento</td><td></td><td></td> di dissezione <td>Pinze, forbici, scapel</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>Acido etilendiamminotetraacetico</td><td>Sigma</td><td>E9884</td><td></td></tr><tr><td>HEPES(1M)</td><td>Gibco</td><td>15630</td><td></td></tr><tr><td>L-[3,4-3H(N)]-Glutammina</td><td>PerkinElmer</td><td>NET551250UC</td><td></td></tr><tr><td>Fiale di scintilazione liquida</td><td>Sigma</td><td>Z190535</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di cloruro di litio, 8M</td><td>Sigma</td><td>L7026</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di magnesio</td><td>Sigma</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>MEM&alfa;</td><td>Gibco</td><td>12561</td><td></td></tr><tr><td>Provetta per microcentrifuga, 15mL</td><td>Biotix</td><td>89511-256</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Sigma</td><td>492016</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di potassio</td><td>Sigma</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato di sodio</td><td>Sigma</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>Sigma</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>Desossicolato di sodio</td><td>Sigma</td><td>D6750</td><td></td></tr><tr><td>Sodio dodecil solfato</td><td>Sigma</td><td>436143</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Sonic& Materiali</td><td>VCX130</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Sigma</td><td>648311</td><td></td></tr><tr><td>Ultima Gold (Soluzione di scintillazione)</td><td>PerkinElmer</td><td>Acido 6013329</td><td></td></tr><tr><td>&alfa;-(Metilammino)isobutirrico</td><td>Sigma</td><td>M2383</td><td></td></tr></tbody></table>

valutazione del consumo di aminoacidi in cellule ossee in coltura e alberi ossei isolati

Evaluation of Amino Acid Consumption in Cultured Bone Cells and Isolated Bone Shafts

Lo sviluppo osseo e l'omeostasi dipendono dalla differenziazione e dall'attività degli osteoblasti che formano l'osso. La differenziazione degli osteoblasti è caratterizzata sequenzialmente dalla proliferazione seguita dalla sintesi proteica e, infine, dalla secrezione della matrice ossea. La proliferazione e la sintesi proteica richiedono un costante apporto di aminoacidi. Nonostante questo, si sa molto poco sul consumo di aminoacidi negli osteoblasti. Qui descriviamo un protocollo molto sensibile progettato per misurare il consumo di aminoacidi utilizzando aminoacidi radiomarcati. Questo metodo è ottimizzato per quantificare i cambiamenti nell'assorbimento degli aminoacidi associati alla proliferazione o alla differenziazione degli osteoblasti, ai trattamenti farmacologici o dei fattori di crescita o a varie manipolazioni genetiche. È importante sottolineare che questo metodo può essere utilizzato in modo intercambiabile per quantificare il consumo di aminoacidi in linee cellulari in coltura o cellule primarie in vitro o in alberi ossei isolati ex vivo. Infine, il nostro metodo può essere facilmente adattato per misurare il trasporto di uno qualsiasi degli amminoacidi, nonché del glucosio e di altri nutrienti radiomarcati.

Il trasporto di aminoacidi è regolato da molti trasportatori di aminoacidi legati alla membrana che sono stati classificati in sistemi di trasporto distinti basati su numerose caratteristiche, tra cui la specificità del substrato, la cinetica e la dipendenza da ioni e pH25. Ad esempio, l'assorbimento di glutammina può essere mediato dai sistemi di trasporto Na+-dipendenti A, ASC, γ+L e N o dal sistema Na+-indipendente L. I sistemi Na+-dipendenti si distinguono per la capacità...

Questo protocollo presenta un saggio di assorbimento di aminoacidi radiomarcato, utile per valutare il consumo di aminoacidi sia nelle cellule primarie che nelle ossa isolate.

Valutazione del consumo di aminoacidi in cellule ossee in coltura e alberi ossei isolati

Bone development and homeostasis is dependent upon the differentiation and activity of bone forming osteoblasts. Osteoblast differentiation is ...

L'assorbimento e il metabolismo degli aminoacidi sono essenziali per la specificazione, la differenziazione e la formazione ossea degli osteoblasti. Questo protocollo fornisce un metodo rapido e sensibile per valutare l'assorbimento di aminoacidi. Il nostro protocollo utilizza aminoacidi radiomarcati per quantificare l'assorbimento di aminoacidi.È un metodo economico, sensibile e veloce che può essere facilmente modificato per diverse condizioni. Questo protocollo può essere facilmente modificato per valutare l'assorbimento di altri nutrienti radiomarcati come glucosio e acidi grassi in una varietà di tessuti e cellule primarie o trasformate. Per iniziare la piastra di saggio di assorbimento degli aminoacidi cinque volte 10 alle quarte cellule ST2 in ciascun pozzetto di una piastra di coltura tissutale a 12 pozzetti in mezzo alfa MEM integrato con FBS, penicillina e streptomicina.Piastra extra pozzetti di cellule per quantificare il numero di celle per condizione per le normalizzazioni. Successivamente, incubare le cellule in un incubatore di coltura cellulare umidificata a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica per due o tre giorni fino al confluente. Dopo l'incubazione

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Una libreria di phage display è stato utilizzato per identificare sequenze peptidiche che l'osso di destinazione. L'obiettivo era quello di indagare l'effetto di questi peptidi sulla differenziazione delle cellule mesenchimali e di determinare il loro effetto sulla rigenerazione ossea.

Peptidi dalla libreria phage display modulare l&#39;espressione genica nelle cellule mesenchimali e potenziare Osteogenesi in difetti ossei Unicortical

In questo video, descriviamo un metodo per la rilevazione dei depositi di calcio secreti dagli osteoblasti utilizzando un colorante anionico, Alizarin Red S. Gli osteoblasti in coltura vengono prima colorati e quindi il colorante viene recuperato per la quantificazione colorimetrica dei depositi di calcio o del grado di mineralizzazione degli osteoblasti.

Saggio di mineralizzazione in vitro: un metodo colorimetrico per quantificare i depositi di calcio degli osteoblasti sul sostituto dell'innesto osseo mediante colorazione ed estrazione del rosso di alizarina

Questo video dimostra una tecnica in vitro per stimare l'assorbimento di aminoacidi da parte delle cellule stromali derivate dal midollo osseo. I trasportatori di amminoacidi Na+-dipendenti mediano l'assorbimento degli amminoacidi radiomarcati all'interno delle cellule e l'assorbimento cellulare viene stimato misurando la radioattività.

Saggio radiomarcato di captazione degli amminoacidi per quantificare l'assorbimento cellulare degli amminoacidi

Descriviamo qui come preparare a medio-bone condizionata (BCM) e testare la sua attività in vitro.

Bone mezzo condizionato: Preparazione e Bioassay

L'uranio è conosciuto per interessare il metabolismo dell'osso. Qui, presentiamo un protocollo volto a indagare l'effetto dell'esposizione all'uranio naturale sulla vitalità, la differenziazione e la funzione degli osteoclasti, le cellule responsabili di riassorbimento dell'osso.

Metodi per analizzare gli impatti di uranio naturale il Osteoclastogenesis In Vitro

Vi presentiamo un protocollo per confrontare lo stato di minerali in vescicole rilasciate da due linee di cellule di osso umano: hFOB 1,19 e Saos-2. I profili di mineralizzazione sono stati analizzati da Alizarin Red-S (AR-S) colorazione, ultravioletto (UV) luce visualizzazione, formazione immagine di microscopia elettronica (TEM) di trasmissione e microanalisi a raggi x dispersiva di energia (EDX).

Analisi di minerali prodotto da hFOB 1.19 e Saos-2 cellule mediante microscopia elettronica a trasmissione con microanalisi a raggi x dispersiva di energia

Qui, presentiamo un metodo per la coltura ex vivo di ossa lunghe murine sia a stadi fetali che neonati, adatto per l'analisi dello sviluppo osseo e della cartilagine e dell'omeostasi in condizioni controllate, ricapitolando il processo in vivo.

Coltura e misurazione ossa lunghe e fetali di murina neonatale

Il saggio del flusso metabolico cellulare in tempo reale misura il tasso di consumo di ossigeno e il tasso di acidificazione extracellulare, che corrisponde alla produzione di adenosina trifosfato mitocondriale e glicolitica, utilizzando sensori di pH e ossigeno. Il manoscritto spiega un metodo per comprendere lo stato energetico degli osteoblasti e la caratterizzazione e l'interpretazione dello stato bioenergetico cellulare.

Utilizzo dell'analizzatore di flusso metabolico cellulare in tempo reale per monitorare la bioenergetica degli osteoblasti

Qui, presentiamo una procedura di analisi semplice ed efficace per i saggi di riassorbimento della fossa utilizzando piastre di coltura cellulare rivestite di fosfato di calcio.

Un semplice protocollo di analisi dei pozzi per visualizzare e quantificare il riassorbimento osteoclastico in vitro

Questo protocollo descrive la fabbricazione di costrutti ossei 3D utilizzando osteociti umani incorporati in idrogel di gelatina metacrilata (GelMA) integrati con matrice extracellulare decellularizzata. Il metodo è a basso costo, scalabile e compatibile con le apparecchiature di laboratorio di base, offrendo una piattaforma traslazionale per lo studio dei processi delle malattie muscoloscheletriche.

Una piattaforma di coltura ossea 3D che utilizza osteociti umani e matrice extracellulare decellularizzata per la modellazione delle malattie muscoloscheletriche

Impara a valutare il consumo di aminoacidi in cellule ossee e alberi ossei isolati con questo metodo rapido e sensibile. Utilizza aminoacidi radiomarcati per quantificare l'assorbimento in vitro e in vivo.

Valutazione del consumo di aminoacidi in cellule ossee in coltura e alberi ossei isolati

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