Automatizzare la quantificazione aggregata in Caenorhabditis elegans
14 ottobre 2021
Il seguente protocollo descrive lo sviluppo e l'ottimizzazione di un flusso di lavoro ad alto rendimento per la coltivazione di vermi, l'imaging a fluorescenza e l'elaborazione automatizzata delle immagini per quantificare gli aggregati di poliglutammina come valutazione dei cambiamenti nella proteostasi.
È stato adottato un approccio semplice per monitorare i cambiamenti nella proteostasi valutando l'aggregazione di poliglutammine e fornendo un framework che può essere utilizzato per applicazioni ad alto rendimento. Segnare un fenotipo come il numero di aggregati per I può diventare soggettivo. L'automazione del conteggio degli aggregati ci consente di eliminare tali distorsioni, aumentare il throughput e la riproducibilità.
Questo metodo aiuta a identificare i geni batterici che contribuiscono all'interruzione della proteostasi dell'ospite. Comprendere il contributo dei singoli geni batterici ci aiuterà a capire la sua implicazione nella patogenesi di malattie come l'Alzheimer, il Parkinson e l'Huntington. Inizia rimuovendo le piastre contenenti vermi dal congelatore e lasciandole scongelare a temperatura ambiente.
Quindi rimuovere la condensa in eccesso e rimuovere il coperchio prima dell'imaging. Utilizzare le impostazioni del microscopio con tempo di esposizione di 500 millisecondi, ingrandimento di 40 X con adattatore per fotocamera 0,63 X e intensità GFP impostata su 100% durante l'acquisizione dell'immagine. Ora regola i controlli della luce trasmessa fino a quando i vermi appaiono illuminati rispetto allo sfondo scuro, evitando la sovraesposizione.
Modificare le posizioni dei vermi all'interno del pozzo per evitare eccessivi grumi utilizzando una punta della pipetta da 10 microlitri per spingere delicatamente i vermi nella posizione desiderata. Impostate il canale sul filtro GFP per stabilire un piano focale per entrambe le immagini. Cattura un'immagine in campo luminoso.
Scatta un'immagine di fluorescenza corrispondente senza disturbare la piastra o cambiare la messa a fuoco del microscopio. Ora per valutare le immagini, prima scarica CellProfiler. Apri il software e trascina e rilascia le immagini di interesse nella casella delle immagini.
Fare clic sulle immagini nell'elenco dei file per aprirle. Selezionare la lente di ingrandimento per evidenziare un'area di interesse e l'icona della freccia per misurare la lunghezza sia dei worm che degli aggregati. Passa il mouse sopra l'oggetto desiderato per determinarne il valore di intensità, che può essere visualizzato nella parte inferiore dello schermo.
Per utilizzare la pipeline di analisi delle immagini di CellProfiler, denominare correttamente le coppie di immagini come descritto nel manoscritto di testo dopo aver scaricato CellProfiler dal sito Web ufficiale. Scaricare la pipeline e caricarla in CellProfiler selezionando file, importa e pipeline da file. Selezionare il modulo worm districati per aprirne le impostazioni e caricare un set di addestramento utilizzato per identificare i worm nel modulo worm districati.
Quindi identificare il nome del file del set di allenamento. Seleziona l'icona di caricamento del file e carica anche il file supplementare. Carica le immagini selezionando il modulo immagini nell'angolo in alto a sinistra.
E poi trascina e rilascia immagini con nome corretto. Prima di analizzare le immagini, selezionare la cartella di output desiderata che verrà utilizzata per memorizzare i risultati facendo clic sul pulsante delle impostazioni di output situato vicino all'angolo in basso a sinistra del programma. Quindi selezionare l'icona della cartella a destra dell'output predefinito per scegliere la posizione di output desiderata.
Selezionare l'icona Analizza immagini per iniziare l'analisi delle immagini. Se il completamento dell'analisi richiede troppo tempo ed è bloccata durante l'elaborazione di una singola immagine, interrompere l'esecuzione e identificare l'immagine non elaborata ordinando la cartella di output e notando quale nome immagine non viene trovato. Dopo un'analisi completa, il software organizzerà i risultati in un foglio di calcolo Excel contenente singoli worm nella colonna N e il rispettivo numero di aggregati nella colonna K.Scarica l'organizzatore di metadati per organizzare comodamente i dati dal file CSV di output di CellProfiler.
Per il sistema operativo Windows, individuare il file scaricato ed estrarlo nella posizione desiderata. Individuare e aprire la cartella estratta denominata gui_Windowsos_64x. E avvia l'applicazione facendo clic sull'icona dell'applicazione GUI.
Potrebbe aprirsi un prompt che richiede l'autorizzazione per l'esecuzione. Seleziona ulteriori informazioni e quindi fai clic su Esegui comunque. L'organizzatore di metadati è ora pronto per trascinare e rilasciare i file CSV di output di CellProfiler.
Per Mac OS, individuate il file scaricato ed estraete il file dell'applicazione dell'organizzatore dei metadati del file. Apri la cartella estratta trovata nei download. Fare clic con il pulsante destro del mouse sull'applicazione GUI e selezionare Apri.
Apparirà un prompt che chiede il permesso di aprire a causa della mancanza di una licenza ufficiale. Seleziona Apri. Una volta che l'applicazione di metadata organizer è aperta nel rispettivo sistema operativo, fare clic su carica i file qui o trascinare e rilasciare i file CSV CellProfiler desiderati.
Fare clic sul pulsante Organizza, che porterà l'utente a una nuova schermata con un pulsante di download dei file. Fare clic sul pulsante e selezionare la posizione desiderata per salvare il file di output. Il file di output verrà visualizzato come nome del file originale con _organized estensione aggiunta al nome del file.
In presenza di FUDR, i vermi che sono stati alimentati con vari batteri avevano una dimensione corporea più consistente che consentiva un rilevamento dei vermi più uniforme e accurato, risolvendo così il problema del sovraffollamento. Il congelamento dei worm ha migliorato il rilevamento degli aggregati polyQ eliminando la fluorescenza di fondo e l'accuratezza del conteggio automatizzato paragonabile al conteggio manuale. L'illuminazione a campo luminoso invertito è stata utilizzata per rilevare l'intero canale C.elegans e GFP per l'immagine di aggregati polyQ YFP.
Il rilevamento, il distringolo e la quantificazione aggregata dei worm per ogni worm sono stati eseguiti applicando una pipeline di elaborazione delle immagini CellProfiler ottimizzata, che consente di ottenere il numero di aggregati per singolo worm. La differenza tra l'efficacia della quantificazione automatizzata degli aggregati e l'utilizzo della pipeline CellProfiler era minima, indicando che il metodo automatizzato può essere applicato a schermi su larga scala. Su 90 ceppi batterici testati, la colonizzazione dell'intestino di C.elegans con un candidato ha mostrato una significativa diminuzione del numero di aggregati.
Gli esperimenti di conferma mediante conteggio manuale hanno rivelato che nessuno dei mutanti, incluso quello che ha ridotto significativamente il numero di aggregati, ha influenzato l'aggregazione polyQ. I ricercatori che decidono di utilizzare questo framework dovrebbero capire che i passaggi delineati non sono assoluti. La modifica e una comprensione fondamentale di come manipolare CellProfiler sono essenziali per il successo.
Ulteriori approcci biochimici come il western blotting possono essere utilizzati per confermare l'aggregazione polyQ.
Panoramica
Questo studio sviluppa un flusso di lavoro ad alto rendimento per la coltura di vermi, l'acquisizione di immagini a fluorescenza e l'elaborazione automatica delle immagini, al fine di quantificare gli aggregati di poliglutamina come indicatore delle variazioni nella proteostasi. Il metodo migliora la valutazione di questi aggregati, in particolare nell'ambito dell'indagine sul loro ruolo nelle malattie neurodegenerative.
Componenti Chiave dello Studio
Area di Ricerca
- Proteostasi
- Malattie neurodegenerative
- Screening ad alto rendimento
Sfondo
- L'aggregazione delle poliglutamine è associata a malattie come l'Alzheimer, il Parkinson e l'Huntington.
- Comprendere il contributo dei geni batterici alla rottura dell'omeostasi proteica è essenziale.
- I metodi tradizionali di valutazione degli aggregati possono essere soggettivi.
Metodi Utilizzati
- Acquisizione e analisi ad alto rendimento mediante CellProfiler
- C. elegans come modello biologico
- Quantificazione automatica degli aggregati di poliglutamina
Risultati principali
- Il processamento automatico delle immagini consente l'eliminazione dei bias e un aumento della riproducibilità nel conteggio degli aggregati.
- Identificazione di geni batterici che influenzano l'omeostasi proteica dell'ospite, con risultati significativi nel numero di aggregati nel verme.
- I risultati validati indicano che l'automazione è paragonabile al conteggio manuale, sostenendo schermate su larga scala.
Conclusioni
- Questo studio fornisce un quadro affidabile per lo studio della proteostasi attraverso l'aggregazione di poliglutamina.
- Le informazioni ottenute con questo metodo sono rilevanti per comprendere i meccanismi delle malattie neurodegenerative.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
L'automazione della quantificazione degli aggregati in C. elegans risponde alla necessità di valutazioni ad alto rendimento e prive di bias della proteostasi nei modelli di malattie neurodegenerative. Standardizzando l'acquisizione delle immagini e l'analisi basata su CellProfiler, il metodo consente lo screening riproducibile di ampie librerie di composti o genetiche. Ciò supporta la validazione precoce dei bersagli e la riduzione dei rischi meccanicistici nei percorsi di scoperta delle malattie da alterazione conformazionale delle proteine.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi di ipotesi terapeutiche quantificando l'aggregazione di poliglutamina come indicatore della perturbazione dell'omeostasi proteica.
- Valore operativo: Riduce la soggettività nella valutazione fenotipica, migliorando l'affidabilità dei dati per le campagne di convalida degli obiettivi.
- Valore predittivo: Supporta la selezione del portafoglio fornendo letture quantitative e riproducibili per la priorizzazione di composti basata sul meccanismo d'azione.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Genera conteggi quantitativi standardizzati di aggregati per singolo verme, consentendo letture di saggio affidabili per campagne di screening.
- Valore operativo: Aumenta la produttività e la riproducibilità grazie all'automazione, riducendo il lavoro manuale e la variabilità tra operatori.
- Prontezza del saggio: Produce un output strutturato (foglio di calcolo Excel con conteggi di vermi e aggregati) compatibile con flussi di lavoro di analisi dati successivi.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Continuità traslazionale: Collega i modelli di proteostasi di C. elegans ai meccanismi delle malattie neurodegenerative umane attraverso vie conservate di aggregazione polyQ.
- Riduzione del rischio meccanicistico: Facilita l'identificazione di modificatori batterici o genetici dell'aggregazione, supportando la validazione degli obiettivi in sistemi rilevanti per la malattia.
- Convalida predittiva: Permette a team multidisciplinari di confrontare condizioni utilizzando una quantificazione normalizzata e automatizzata degli aggregati.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nel percorso di scoperta che va dalla validazione del bersaglio all'identificazione del capostazione, fornendo letture quantitative della proteostasi che orientano le decisioni di prosecuzione o interruzione del progetto.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica di ipotesi sui meccanismi di proteostasi consentendo un fenotipaggio oggettivo e ad alto contenuto di aggregazione.
- Screening: Fornisce immagini e analisi standardizzate di vermi pronte per saggi, compatibili con schermate in formato 96 pozzetti o superiore.
- Analisi: Produce misurazioni quantificabili di variabili dipendenti (aggregati per verme) che permettono confronti statistici tra diverse condizioni sperimentali.
- Ricerca traslazionale: Collega i risultati ottenuti nei modelli di invertebrati ai percorsi della malattia umana attraverso la biologia conservata dell'aggregazione.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una pipeline di imaging e analisi riutilizzabile, adattabile a diversi bersagli di proteostasi e campagne di screening.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nella validazione degli obiettivi eliminando i bias derivanti dal conteggio manuale degli aggregati.
- Valore operativo: Migliora la riproducibilità e la scalabilità grazie a un processamento standardizzato delle immagini e a un output dati automatizzato.
- Valore strategico: Migliora l'efficienza del capitale consentendo schermate su larga scala con minor tempo di manipolazione diretta e una qualità superiore dei dati.
- Impatto sul portafoglio: Supporta decisioni di avanzamento corrette per il rischio mediante biomarcatori quantitativi affidabili della proteostasi.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede familiarità con la microscopia a fluorescenza e i parametri di acquisizione di GFP/YFP per il rilevamento di polyQ.
- Si basa sul software CellProfiler e sulla relativa configurazione della pipeline per la segmentazione automatica dei vermi e degli aggregati.
- Necessita di una nomenclatura standardizzata delle immagini e di un'organizzazione gerarchica delle cartelle per un'elaborazione batch efficace.
- Traggo beneficio dal trattamento con FUDR per ridurre la variabilità delle dimensioni dei vermi e migliorare l'accuratezza del rilevamento in pozzetti ad alta densità.
- Richiede una formazione dell'utente per adattare la pipeline a diverse ceppi di vermi, pattern di espressione o configurazioni di imaging.
