Produzione di nanoparticelle lipidiche caricate con siRNA utilizzando un dispositivo microfluidico
22 marzo 2022
I metodi di produzione di nanoparticelle lipidiche (LNP) a base microfluidica hanno attirato l'attenzione nei sistemi di somministrazione dei farmaci (DDS), compresa la somministrazione di RNA. Questo protocollo descrive la fabbricazione, la produzione di LNP (LNP caricato con siRNA) e i processi di valutazione LNP utilizzando il nostro dispositivo microfluidico originale denominato iLiNP.
La dimensione delle nanoparticelle lipidiche influisce sulla biodistribuzione, sull'effetto antitumorale e sulle prestazioni di silenziamento genico. Pertanto, il metodo di controllo delle dimensioni LNP è una tecnica efficace per la produzione di nano farmaci, compresi i sistemi di rilascio dell'RNA. Questo dispositivo microfluidico originale, chiamato dispositivo iLiNP, era in grado di controllare le dimensioni LNP che vanno da 20 a 100 nanometri a intervalli di 10 nanometri.
Il dispositivo iLiNP può produrre non solo LNP caricati con siRNA, ma anche LNPS caricati con mRNA e LNP caricati con ribonucleoproteine. Per iniziare, prendere le soluzioni lipidiche di etanolo e produrre gli LNP caricati con siRNA mescolando DOTAP, DSPC, colesterolo e soluzioni DMG-PEG2k in un rapporto molare da 50 a 10 a 38,5 a 1,5. Regolare la concentrazione lipidica totale a otto millimolari.
Quindi prendere le soluzioni acquose di 154 millimolari soluzione salina e 25 millimolari tampone di acetato a pH 4 e filtrarle attraverso filtri a membrana da 0,2 micrometri o filtri a siringa. Preparare la soluzione tampone di siRNA sciogliendo 70 microgrammi di siGL4 in un millilitro di tampone di acetato da 25 millimolari. Riempire una siringa di vetro da un millilitro con soluzioni lipidiche e acquose, rispettivamente.
Collegare le siringhe di vetro ai capillari di picco utilizzando connettori a siringa, quindi impostare la portata delle soluzioni lipidiche e acquose e introdurre le soluzioni lipidiche e acquose separatamente nel dispositivo iLiNP utilizzando pompe a siringa. Raccogliere le sospensioni LNP in un microtubo dall'uscita del dispositivo iLiNP. Dializzare la sospensione di LNP utilizzando una membrana di dialisi da 12 a 14 kiloDalton di peso molecolare a quattro gradi Celsius durante la notte contro soluzione salina o DPBS per POPC LNP e LNP caricati con siRNA, rispettivamente.
Raccogliere le sospensioni LNP dializzate in microtubi e quindi pipettare da 20 a 30 microlitri della sospensione LNP in una micro cella al quarzo. Infine, misurare la dimensione LNP, la distribuzione delle dimensioni LNP e l'indice di polidisperibilità mediante diffusione dinamica della luce. La distribuzione dimensionale POPC LNP prodotta in diverse condizioni di flusso, come la portata totale e i rapporti di portata sono mostrati qui.
Le dimensioni LNP precise che vanno da 20 a 100 nanometri possono essere controllate utilizzando questo dispositivo iLiNP. Gli LNP di piccole dimensioni si formano in condizioni di portata totale elevata. Inoltre, le dimensioni LNP che si formano al FRR 5 sono più piccole di quelle del FRR 3, indipendentemente dalla portata totale.
La distribuzione dimensionale degli LNP caricati con siRNA è mostrata qui. I siRNA sono incapsulati negli LNP dall'interazione elettrostatica tra il lipide cationico DOTAP e i siRNA caricati negativamente. Il dispositivo iLiNP ha prodotto LNP cationici caricati con siRNA a 90 nanometri con una distribuzione ristretta.
L'efficienza di incapsulamento del siRNA è stata del 95% a causa dell'interazione elettrostatica tra il lipide cationico e i siRNA caricati negativamente. Sono state valutate la citotossicità e l'attività di silenziamento genico dei LNP caricati con siRNA a 19 nanometri. Gli LNP caricati con siRNA hanno mostrato citotossicità alla dose di 10-100 siRNA nanomolari.
Il livello di espressione della luciferasi è diminuito a seconda della concentrazione di siRNA. Gli LNP caricati con siRNA hanno soppresso l'espressione dell'80% di luciferasi alla dose di 100 siRNA nanomolari. Le ottimizzazioni delle condizioni di flusso sono i passaggi più importanti nel protocollo per ottenere le dimensioni desiderate LNP.
Il metodo di produzione LNP basato su microfluidico, incluso il dispositivo iLiNP, non richiede alcuna procedura complicata e dovrebbe essere utilizzato come metodo di produzione LNP standard.
Panoramica
Questo articolo presenta un protocollo per la produzione di nanoparticelle lipidiche (LNPs) caricate con siRNA, utilizzando un dispositivo microfluidico chiamato iLiNP. Il metodo consente un controllo preciso delle dimensioni delle LNPs, fondamentale per sistemi di somministrazione di farmaci efficaci.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Sistemi di somministrazione dei farmaci
- Nanoparticelle lipidiche
- Microidraulica
Sfondo
- La dimensione dei nanoparticelle lipidiche influisce sulla biodistribuzione e sull'efficacia terapeutica.
- Il controllo della dimensione delle nanoparticelle lipidiche è essenziale per ottimizzare il rilascio di RNA.
- Il dispositivo iLiNP consente un controllo della dimensione compresa tra 20 e 100 nanometri.
- Le interazioni elettrostatiche favoriscono l'incapsulamento di siRNA nelle nanoparticelle lipidiche.
Scopo dello studio
- Sviluppare un metodo affidabile per la produzione di LNPs caricate con siRNA.
- Valutare l'impatto della dimensione degli LNPs sull'efficienza di silenziamento genico.
- Ottimizzare le condizioni di flusso per ottenere le caratteristiche desiderate degli LNPs.
Metodi Utilizzati
- Preparazione di soluzioni lipidiche e acquose per la produzione di LNP.
- Utilizzo del dispositivo iLiNP per il mescolamento e la formazione di LNP.
- Dialisi delle sospensioni di LNP per rimuovere i materiali in eccesso.
- Diffusione dinamica della luce per misurare dimensioni e distribuzione dei LNP.
Risultati principali
- Il dispositivo iLiNP ha prodotto LNPs caricati con siRNA con una dimensione di 90 nanometri e un'efficienza di incapsulamento del 95%.
- LNPs di piccole dimensioni si sono formati in condizioni di elevata portata totale.
- I LNPs caricati con siRNA hanno dimostrato citotossicità e un efficace silenziamento genico.
- Le condizioni di flusso ottimizzate sono state fondamentali per ottenere dimensioni desiderate dei LNP.
Conclusioni
- Il metodo microfluidico che utilizza il dispositivo iLiNP semplifica la produzione di LNP.
- Si prevede che questo approccio standardizzi la produzione di LNP nella ricerca.
- Ulteriori studi possono esplorare l'applicazione di questo metodo in vari sistemi di somministrazione di RNA.
Domande Frequenti
Rilevanza Industriale del Metodo
Il controllo preciso della dimensione delle nanoparticelle lipidiche (LNP) è fondamentale per ottimizzare la distribuzione biologica, l'efficacia terapeutica e le prestazioni di silenziamento genico nei sistemi di somministrazione di farmaci a base di RNA. Il dispositivo microfluidico iLiNP consente la produzione riproducibile di LNP con dimensioni regolabili comprese tra 20 e 100 nanometri, supportando le fasi iniziali di validazione degli obiettivi e i flussi di lavoro di identificazione dei composti promettenti. Questa capacità aumenta l'affidabilità predittiva nei modelli preclinici riducendo la variabilità delle prestazioni delle nanoparticelle, un fattore chiave per ridurre i rischi nell'avanzamento traslazionale.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi dell'attività biologica dipendente dalle dimensioni per LNPs caricate con siRNA in saggi di convalida del bersaglio.
- Valore operativo: Fornisce formulazioni standardizzate di LNPs per ridurre il rumore nei saggi fenotipici e negli studi meccanicistici di riduzione del rischio.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Genera siRNA-LNPs monodispersi con dimensioni definite ed efficienza di incapsulamento del 95% per una valutazione affidabile del composto.
- Valore operativo: Favorisce la standardizzazione dei saggi attraverso il controllo riproducibile delle dimensioni degli LNP mediante regolazione della portata nel dispositivo iLiNP.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Facilita la correlazione tra la dimensione dei LNP e l'efficienza di silenziamento genico e la citotossicità in sistemi pertinenti per le malattie.
- Valore operativo: Permette la produzione su scala ingrandibile di LNP caricati con mRNA, siRNA e ribonucleoproteine per garantire continuità preclinica.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo microfluidico iLiNP si inserisce nel percorso di scoperta che va dalla validazione iniziale del bersaglio all'identificazione del composto leader fino allo sviluppo preclinico, in particolare per terapie a base di RNA in cui il rilascio dipendente dalle dimensioni influisce sull'efficacia.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi consentendo la variazione sistematica delle dimensioni dei LNP per valutarne l'impatto sull'assorbimento cellulare e sul legame al bersaglio.
- Screening: Fornisce formulazioni di LNP pronte per il saggio, con distribuzione delle dimensioni costante e alto incapsulamento di siRNA, per uno screening riproducibile dei composti.
- Analisi: Fornisce dati quantitativi su dimensioni, polidispersione e potenziale zeta mediante diffusione dinamica della luce, utili per prendere decisioni di avanzamento o interruzione.
- Ricerca traslazionale: Collega l'ottimizzazione dei LNP nella fase di scoperta alla valutazione preclinica attraverso nanomedicinali standardizzati con dimensioni controllate.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma riutilizzabile per la produzione di diversi tipi di LNP caricati con RNA (siRNA, mRNA, RNP) in progetti multipli.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Migliora la fiducia sul bersaglio collegando le proprietà fisico-chimiche delle nanoparticelle lipidiche (LNP) a risultati funzionali come il silenziamento genico.
- Valore operativo: Aumenta la riproducibilità e la scalabilità della produzione di LNP grazie alla precisione della microfluidica.
- Valore strategico: Riduce il rischio biologico in fasi avanzate consentendo una valutazione precoce dei rischi legati alle prestazioni del veicolo di somministrazione.
- Impatto sul portafoglio: Guida la priorizzazione dei candidati terapeutici a RNA in base all'efficienza di somministrazione, adeguandola al rischio.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella formulazione lipidica, nella manipolazione microfluidica e nel caricamento di acidi nucleici.
- È dipendente da pompe a siringa, siringhe in vetro e infrastrutture per la dialisi necessarie alla purificazione dei LNP.
- Necessita di standardizzazione dei rapporti tra le portate e delle condizioni di portata totale tra diversi gruppi di lavoro.
- Richiede considerazioni di adattamento qualora si modifichino le composizioni lipidiche o i tipi di carico di RNA.
- È limitato dalla necessità di dialisi post-produzione e di scattering della luce dinamico per il controllo qualità.
Domande frequenti sulla biofarmaceutica
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:54
Preparation of Lipid Solutions and the siRNA/ Buffer Solution
1:58
Set-Up of the iLiNP Device and Production of LNPs
2:35
Dialysis of the LNP Suspension and LNP Size Measurement
3:24
Results: POPC LNP Size Distributions Produced by the iLiNP Device at Different Flow Rate Ratios and Characterization and Cytotoxicity of siRNA-Loaded LNPs
5:22
Conclusion
