Name: Imaging delladesione molecolare nel laminaggio cellulare mediante analisi dellimpronta di adesione (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 24 s
Description: Impara l'imaging dell'adesione molecolare nel laminaggio cellulare mediante analisi dell'impronta di adesione. Questo metodo consente di quantificare le forze di adesione molecolare rilevanti fisiologicamente.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Questo lavoro è stato sostenuto dalla Canada Foundation of Innovation (CFI 35492), dal Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada Discovery Grant (RGPIN-2017-04407), dal New Frontiers in Research Fund (NFRFE-2018-00969), dalla Michael Smith Foundation for Health Research (SCH-2020-0559) e dall'University of British Columbia Eminence Fund.

<ol><li>McEver, R. P., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rolling+cell+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Rolling cell adhesion.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 26 (1), 363-396 (2010).</li>
<li>Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Getting+to+the+site+of+inflammation%3A+The+leukocyte+adhesion+cascade+updated%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Getting to the site of inflammation: The leukocyte adhesion cascade updated.</a> Nature Reviews Immunology. 7 (9), 678-689 (2007).</li>
<li>Zarbock, A., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+adhesion+and+activation+under+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Neutrophil adhesion and activation under flow.</a> Microcirculation. 16 (1), 31-42 (2009).</li>
<li>Etzioni, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adhesion+molecules+-+Their+role+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+Research%22%5BJournal%5D)">Adhesion molecules - Their role in health and disease.</a> Pediatric Research. 39 (2), 191-198 (1996).</li>
<li>van de Vijver, E., vanden Berg, T. K., Kuijpers, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocyte+adhesion+deficiencies%5BTitle%5D)+AND+%22Hematology%2FOncology+Clinics+of+North+America%22%5BJournal%5D)">Leukocyte adhesion deficiencies.</a> Hematology/Oncology Clinics of North America. 27 (1), 101-116 (2013).</li>
<li>Hanna, S., Etzioni, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocyte+adhesion+deficiencies%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Leukocyte adhesion deficiencies.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1250 (1), 50-55 (2012).</li>
<li>Geng, Y., Marshall, J. R., King, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycomechanics+of+the+metastatic+cascade%3A+Tumor+cell-endothelial+cell+interactions+in+the+circulation%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Glycomechanics of the metastatic cascade: Tumor cell-endothelial cell interactions in the circulation.</a> Annals of Biomedical Engineering. 40 (4), 790-805 (2012).</li>
<li>Yasmin-Karim, S., King, M. R., Messing, E. M., Lee, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((E-selectin+ligand-1+controls+circulating+prostate+cancer+cell+rolling%2Fadhesion+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">E-selectin ligand-1 controls circulating prostate cancer cell rolling/adhesion and metastasis.</a> Oncotarget. 5 (23), 12097-12110 (2014).</li>
<li>Marshall, B. T., Long, M., Piper, J. W., Yago, T., McEver, R. P., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+observation+of+catch+bonds+involving+cell-adhesion+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Direct observation of catch bonds involving cell-adhesion molecules.</a> Nature. 423 (6936), 190-193 (2003).</li>
<li>Hammer, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adhesive+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomechanical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Adhesive dynamics.</a> Journal of Biomechanical Engineering. 136 (2), 021006(2014).</li>
<li>Yasunaga, A. B., Murad, Y., Kapras, V., Menard, F., Li, I. T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+interpretation+of+cell+rolling+velocity+distribution%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Quantitative interpretation of cell rolling velocity distribution.</a> Biophysical Journal. 120 (12), 2511-2520 (2021).</li>
<li>Li, I. T. S., Ha, T., Chemla, Y. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+cell+surface+adhesion+by+rotation+tracking+and+adhesion+footprinting%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Mapping cell surface adhesion by rotation tracking and adhesion footprinting.</a> Scientific Reports. 7 (1), 44502(2017).</li>
<li>Yasunaga, A. B., Li, I. T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+fast+molecular+adhesion+by+fluorescence+footprinting%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Quantification of fast molecular adhesion by fluorescence footprinting.</a> Science Advances. 7 (34), (2021).</li>
<li>Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+fluorophores+for+optimal+performance+in+localization-based+super-resolution+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging.</a> Nature Methods. 8 (12), 1027-1040 (2011).</li>
<li>Zhu, M., Lerum, M. Z., Chen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+prepare+reproducible%2C+homogeneous%2C+and+hydrolytically+stable+aminosilane-derived+layers+on+silica%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">How to prepare reproducible, homogeneous, and hydrolytically stable aminosilane-derived layers on silica.</a> Langmuir. 28 (1), 416-423 (2012).</li>
<li>Chandradoss, S. D., Haagsma, A. C., Lee, Y. K., Hwang, J. H., Nam, J. M., Joo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+passivation+for+single-molecule+protein+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Surface passivation for single-molecule protein studies.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (86), e50549(2014).</li>
<li>Schnitzbauer, J., Strauss, M. T., Schlichthaerle, T., Schueder, F., Jungmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+microscopy+with+DNA-PAINT%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Super-resolution microscopy with DNA-PAINT.</a> Nature Protocols. 12 (6), 1198-1228 (2017).</li>
<li>Chalfoun, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MIST%3A+Accurate+and+scalable+microscopy+image+stitching+tool+with+stage+modeling+and+error+minimization%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">MIST: Accurate and scalable microscopy image stitching tool with stage modeling and error minimization.</a> Scientific Reports. 7 (1), 4988(2017).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constructing+modular+and+universal+single+molecule+tension+sensor+using+protein+G+to+study+mechano-sensitive+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Constructing modular and universal single molecule tension sensor using protein G to study mechano-sensitive receptors.</a> Scientific Reports. 6, 1-10 (2016).</li>
<li>Crockett-Torabi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selectins+and+mechanisms+of+signal+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Leukocyte+Biology%22%5BJournal%5D)">Selectins and mechanisms of signal transduction.</a> Journal of Leukocyte Biology. 63 (1), 1-14 (1998).</li>
<li>Ye, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+P-selectin+and+PSGL-1+axis+accelerates+atherosclerosis+via+activation+of+dendritic+cells+by+the+TLR4+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Disease%22%5BJournal%5D)">The P-selectin and PSGL-1 axis accelerates atherosclerosis via activation of dendritic cells by the TLR4 signaling pathway.</a> Cell Death and Disease. 10 (7), 507(2019).</li>
<li>Saha, K., Bender, F., Gizeli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+study+of+IgG+binding+to+proteins+G+and+A%3A+Nonequilibrium+kinetic+and+binding+constant+determination+with+the+acoustic+waveguide+device%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Comparative study of IgG binding to proteins G and A: Nonequilibrium kinetic and binding constant determination with the acoustic waveguide device.</a> Analytical Chemistry. 75 (4), 835-842 (2003).</li>
<li>Murad, Y., Li, I. T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+molecular+forces+with+serially+connected+force+sensors%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Quantifying molecular forces with serially connected force sensors.</a> Biophysical Journal. 116 (7), 1282-1291 (2019).</li>
<li>Yasunaga, A. B., Murad, Y., Li, I. T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+molecular+tension-classifications%2C+interpretations+and+limitations+of+force+sensors%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Biology%22%5BJournal%5D)">Quantifying molecular tension-classifications, interpretations and limitations of force sensors.</a> Physical Biology. 17 (1), 011001(2020).</li>
</ol>

Gli autori non dichiarano alcun conflitto di interessi.

Il test dell'impronta di adesione consente la visualizzazione degli eventi di adesione molecolare tra PSGL-1 e P-selectina durante l'adesione al rotolamento cellulare. Questo processo viene avviato mediante cattura mediata da P-selectina seguita da rotolamento sotto sforzo di taglio fluidico. I potenziali problemi durante l'esperimento di solito riguardano un cattivo rotolamento delle cellule o tracce fluorescenti mancanti anche quando le cellule rotolano bene. Questi problemi sono spesso il risultato di controlli di qua...

La cascata di adesione a rotolamento descrive come le cellule circolanti si legano e rotolano lungo la parete dei vasi sanguigni1. Il rotolamento passivo è mediato principalmente dalle selectine, una delle principali classi di molecole di adesione cellulare (CAM)1. Sotto il flusso di taglio del sangue, i leucociti che esprimono il ligando-1 della glicoproteina P-selectina (PSGL-1) formano legami altamente transitori con la P-selectina, che possono essere espressi sulla superficie delle cellule endoteliali infiammate. Questo processo è fondamentale affinché i leucociti migrino verso un sito di infiammazione2. Inoltre, PSGL-1 è anche un recettore meccanosensibile in grado di innescare la successiva fase di adesione ferma della cascata di adesione rotolante al momento del suo impegno con P-selectina3.
Le mutazioni genetiche che influenzano la funzione CAM possono influenzare gravemente il sistema immunitario, come nella malattia rara del deficit di adesione leucocitaria (LAD), dove il malfunzionamento delle molecole di adesione che mediano il rolling porta a individui gravemente immunocompromessi4,5,6. Inoltre, è stato dimostrato che le cellule tumorali circolanti migrano seguendo un processo di rotolamento simile, portando a metastasi7,8. Tuttavia, poiché il rotolamento cellulare è veloce e dinamico, i metodi convenzionali di meccanobiologia sperimentale non sono adatti per studiare le interazioni molecolari durante il rotolamento cellulare. Mentre i metodi di manipolazione a singola cellula e singola molecola come la microscopia a forza atomica e la pinzetta ottica sono stati in grado di studiare le interazioni molecolari come l'interazione forza-dipendente di P-selectina con PSGL-1 a livello di singola molecola9, non sono adatti per studiare eventi di adesione dal vivo durante il rotolamento cellulare. Inoltre, l'interazione caratterizzata in vitro non può rispondere direttamente alla domanda sull'adesione molecolare in vivo. Ad esempio, quale intervallo di tensione molecolare è biologicamente rilevante quando le cellule funzionano nel loro ambiente nativo? Metodi computazionali come la simulazione della dinamica adesiva10 o il semplice modello a stato stazionario11 hanno catturato alcuni dettagli molecolari e il modo in cui influenzano il comportamento di rotolamento, ma dipendono fortemente dall'accuratezza dei parametri e delle ipotesi di modellazione. Altre tecniche come la microscopia a forza di trazione possono rilevare le forze durante la migrazione cellulare, ma non forniscono una risoluzione spaziale sufficiente o informazioni quantitative sulla tensione molecolare. Nessuna di queste tecniche può fornire osservazioni sperimentali dirette delle dinamiche temporali, della distribuzione spaziale e dell'eterogeneità di grandezza delle forze molecolari, che si riferiscono direttamente alla funzione e al comportamento delle cellule nel loro ambiente nativo.
Pertanto, l'implementazione di un sensore di forza molecolare in grado di misurare con precisione le interazioni selectin-mediate è fondamentale per migliorare la nostra comprensione dell'adesione al rotolamento. Qui descriviamo il protocollo per il test dell'impronta di adesione12 in cui le perle rivestite di PSGL-1 vengono laminate su una superficie che presenta cavi di tensometro funzionalizzati p-selectin (TGT)13. Questi TGT sono sensori di forza irreversibili basati sul DNA che si traducono in una storia permanente di eventi di rottura sotto forma di lettura della fluorescenza. Ciò si ottiene attraverso la rottura del TGT (dsDNA) e quindi la successiva etichettatura del TGT rotto (ssDNA) con un filamento complementare marcato fluorescentemente. Uno dei principali vantaggi di questo sistema è la sua compatibilità sia con l'imaging a diffrazione limitata che con quella a super-risoluzione. Il filamento complementare marcato fluorescentemente può essere legato in modo permanente (>12 bp) per l'imaging limitato alla diffrazione o legato transitoriamente (7-9 bp) per l'imaging a super-risoluzione attraverso DNA PAINT. Questo è un sistema ideale per studiare l'adesione al rotolamento poiché i TGT si rompono durante la laminazione attiva, ma la lettura della fluorescenza viene analizzata dopo la laminazione. I due metodi di imaging offrono inoltre all'utente una maggiore libertà di indagare sull'adesione a rotolamento. In genere, l'imaging a diffrazione limitata è utile per estrarre la forza di rottura molecolare attraverso l'intensità di fluorescenza13, mentre l'imaging a super-risoluzione consente l'analisi quantitativa della densità del recettore. Con la capacità di studiare queste proprietà dell'adesione a rotolamento, questo approccio fornisce una piattaforma promettente per comprendere il meccanismo di regolazione della forza sull'adesione molecolare delle cellule di rotolamento sotto flusso di taglio.

<table><tbody><tr><td>Guida di foratura a 4 canali</td><td>Stampato in</td> 3D su <td></td> misura <td>con filamento ABS</td></tr><tr><td>Slitta a 4 fori</td> Drill clean su <td>misura</td><td></td><td>che utilizza un Dremel con punte diamantate su una guida di perforazione a 4 canali che ha un layout che corrisponde ai centri degli 8-32 fori filettati sul morsetto in alluminio.</td></tr><tr><td>Acetone</td><td>VWR</td><td>BDH1101-4LP</td><td></td></tr><tr><td>Distanziatore acrilico</td><td>Tagliato</td><td></td><td>due blocchi di lastre acriliche con le dimensioni di 40 mm x 30 mm x 2,5 mm. Su ogni blocco, praticare due fori da 3 mm che sono allineati con precisione con i fori 4-40 sul supporto in alluminio.</td></tr><tr><td>Portatrucioli in alluminio</td><td>Costruito</td><td></td> su misura <td>Blocco in alluminio anodizzato a macchina in un supporto a forma di C con la dimensione esterna di 640 mm x 500 mm x 65 mm e la dimensione di apertura di 400 mm x 380 mm x 65 mm. Gli ingressi e le uscite sono filettati con filettatura 8-32.</td></tr><tr><td>Aminosilano</td><td>AlfaAesar</td><td>L14043</td><td>CAS 1760-24-3</td></tr><tr><td>Soluzione antibiotica/antimicotica</td><td>Cytiva HyClone</td><td></td><td>SV3007901 Pen/Strepto/Fungiezone</td></tr><tr><td>Perline, polistirene rivestito ProtG</td><td>Spherotech</td><td>PGP-60-5</td><td></td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina</td><td>VWR</td><td>332</td><td></td></tr><tr><td>Tampone, DNA PAINT</td><td></td><td></td><td>0,05% Tween-20, 5 mM Tris, 75 mM MgCl2, 1 mM EDTA</td></tr><tr><td>Buffer, T50M5</td><td></td><td></td><td>10mM Tris, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl2</td></tr><tr><td>Buffer, Rolling</td><td></td><td></td><td>HBSS con 2mM CaCl2, 2 mM MgCl2, 10 mM Hepes, 0,1% BSA</td></tr><tr><td>Buffer, Wash</td><td></td><td></td><td>10 mM Tris, 50 mM di NaCl, 5 mM di MgCl2 e 2 mM di CaCl2, 0,05% Tween 20</td></tr><tr><td>Cloruro di calcio</td><td>VWR</td><td>BDH9224</td><td></td></tr><tr><td>Flaconi per colture cellulari</td><td>VWR</td><td>10062-868</td><td></td></tr><tr><td>Acido solforico concentrato</td><td>VWR</td><td>BDH3072-2.5LG</td><td>95-98%</td></tr><tr><td>Pinzette portavetrini</td><td>Techni-Tool</td><td>758TW150</td><td></td></tr><tr><td>Trapano diamantato Punte</td><td>Tecnologia abrasiva</td><td>C5250510</td><td>0,75 mm Punta diamantata</td></tr><tr><td>DNA, ammina-ssDNA (filamento superiore)</td><td>IDT DNA</td><td>Oligo personalizzato</td><td>CCGGGCGACGCAGGAGGG /3AmMO/</td></tr><tr><td>DNA, biotina-ssDNA (filamento inferiore)</td><td>IDT DNA</td><td>Oligo personalizzato</td><td>/5BiotinTEG/ TTTTT CCCTCCTGCGTCGCCCGG</td></tr><tr><td>DNA, filamento imager per DNA-PAINT</td><td>IDT DNA</td><td>Oligo personalizzato</td><td>GAGGGAAA TT/3Cy3Sp/</td></tr><tr><td>DNA, filamento imager per l'etichettatura permanente</td><td>IDT DNA</td><td>Oligo personalizzato</td><td>CCGGGCGACGCAGG /3Cy3Sp/</td></tr><tr><td>Nastro biadesivo</td><td>Scotch</td><td>237</td><td>3/4 pollici di larghezza, nastro biadesivo permanente</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Thermofisher</td><td>15575020</td><td>0,5 M EDTA, pH 8,0</td></tr><tr><td>Epoxy</td><td>Gorilla</td><td>42001</td><td>Tempo di polimerizzazione di 5 minuti</td></tr><tr><td>Siero fetale bovino (FBS)</td><td>Avantor</td><td>97068-085</td><td></td></tr><tr><td>GelGreen</td><td>Biotium</td><td>41005</td><td></td></tr><tr><td>Acido acetico glaciale</td><td>VWR</td><td>BDH3094-2.5LG</td><td></td></tr><tr><td>Vetro, Vetrini coprioggetti</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-548-5P</td><td></td></tr><tr><td>Vetro, Vetrino per microscopio</td><td>VWR</td><td>48300-026</td><td>75 mm x 25 mm x 1 mm</td></tr><tr><td>Vetro, Barattolo</td><td>VWR</td><td>74830-150</td><td>Barattolo per colorare Wheaton (900620)</td></tr><tr><td>Soluzione salina bilanciata di Hanks (HBSS)</td><td>Emocitometro Lonza</td><td>04-315Q</td><td></td></tr><tr><td>Celle</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z359629-1EA</td><td></td></tr><tr><td>HL-60</td><td>ATCC</td><td>CCL-240</td><td></td></tr><tr><td>Supporto per vetrini della camera di umidità</td> Stampato in 3D <td>su</td><td></td> misura <td>con filamento ABS</td></tr><tr><td>Perossido di idrogeno</td><td>VWR</td><td>BDH7690-1</td><td>30%</td></tr><tr><td>Imidazolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I2399</td><td></td></tr><tr><td>Ingressi/uscite Su</td><td>misura</td><td></td><td>Forare attraverso otto viti di fermo 8-32 utilizzando punte da trapano in cobalto. Inserto 1,5 cm&nbsp; tubo in polietilene (Tygon, I.D. 1/32" O.D. 3/32") in ogni vite di fissaggio cava</td></tr><tr><td>Iscove Modified Dulbecco Media (IMDM)</td><td>Lonza</td><td>12-722F</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di magnesio</td><td>VWR</td><td>BDH9244</td><td></td></tr><tr><td>Perline magnetiche Ni-NTA</td><td>Invitrogen</td><td>10103D</td><td></td></tr><tr><td>Tubi postali</td><td>EMS</td><td>EMS71406-10</td><td></td></tr><tr><td>Metanolo</td><td>VWR</td><td>BDH1135-4LP</td><td></td></tr><tr><td>Micro Bio-Spin P-6 Gel Colonne</td><td>Biorad</td><td>7326200</td><td>In SSC Tampone</td></tr><tr><td>PEG</td><td>Laysan Bio</td><td>MPEG-SVA-5000</td><td></td></tr><tr><td>PEG-biotina</td><td>Laysan Bio</td><td>Biotin-PEG-SVA-5000</td><td></td></tr><tr><td>Idrossido di potassio</td><td>VWR</td><td>470302-132</td><td></td></tr><tr><td>Proteina, Proteina G</td><td>Abcam</td><td>ab155724</td><td>N-terminale His-Tag e C-terminale proteina della cisteina</td></tr><tr><td>, P-selectina-Fc</td><td>R& Sistema D</td><td>137-PS</td><td>Proteina Chimera umana ricombinante P-Selectina / CD62P Fc,</td></tr> proteina CF<tr><td>, streptavidina</td><td>Cedarlano</td><td>CL1005-01-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Siringa a pompa</td><td>Apparato Harvard</td><td>704801</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato di sodio</td><td>Ward' s Science</td><td>470302-444</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>VWR</td><td>97061-274</td><td></td></tr><tr><td>Sulfo-SMCC</td><td>Thermofisher</td><td>22322</td><td></td></tr><tr><td>Siringa</td><td>Hamilton</td><td>81520</td><td>Siringhe con blocco luer in PTFE,</td></tr><tr><td>aghi per siringa</td> da 5 mL <td>BD</td><td>305115</td><td>Precision Glide 26 G, lunghezza 5/8 di pollice</td></tr><tr><td>TCEP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4706-2G</td><td></td></tr><tr><td>Tubi Tris</td><td>VWR</td><td>BDH4502-500GP</td><td></td></tr>, <tr><td>adattatore</td><td>Tygon</td><td>ABW00001</td><td>formulazione 3350, diametro interno 1/32"; diametro esterno 3/32"</td></tr><tr><td>Tubo, Polietilene</td><td>BD Intramedic</td><td>427406</td><td>Intramedic (PE20) D.I. 0,38 mm; D.E. 1,09 mm</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93773</td><td></td></tr></tbody></table>

imaging dell'adesione molecolare nel laminaggio cellulare mediante analisi dell'impronta di adesione

Imaging Molecular Adhesion in Cell Rolling by Adhesion Footprint Assay

L'adesione a rotolamento, facilitata da interazioni mediate dalla selectina, è una motilità passiva altamente dinamica nel reclutamento di leucociti nel sito di infiammazione. Questo fenomeno si verifica nelle venule postcapillari, dove il flusso sanguigno spinge i leucociti in un movimento rotolante sulle cellule endoteliali. La laminazione stabile richiede un delicato equilibrio tra la formazione del legame di adesione e la loro dissociazione guidata meccanicamente, consentendo alla cella di rimanere attaccata alla superficie mentre rotola nella direzione del flusso. A differenza di altri processi di adesione che si verificano in ambienti relativamente statici, l'adesione di rotolamento è altamente dinamica poiché le celle di laminazione viaggiano su migliaia di micron a decine di micron al secondo. Di conseguenza, i metodi convenzionali di meccanobiologia come la microscopia della forza di trazione non sono adatti per misurare i singoli eventi di adesione e le forze molecolari associate a causa del breve lasso di tempo e dell'elevata sensibilità richiesta. Qui, descriviamo la nostra ultima implementazione del test dell'impronta di adesione per visualizzare le interazioni P-selectin: PSGL-1 nell'adesione rolling a livello molecolare. Questo metodo utilizza legami irreversibili di tensometro basati sul DNA per produrre una storia permanente di eventi di adesione molecolare sotto forma di tracce di fluorescenza. Queste tracce possono essere fotografate in due modi: (1) cucire insieme migliaia di immagini limitate alla diffrazione per produrre un ampio campo visivo, consentendo l'estrazione dell'impronta di adesione di ogni cellula di rotolamento su migliaia di micron di lunghezza, (2) eseguire DNA-PAINT per ricostruire immagini a super-risoluzione delle tracce di fluorescenza all'interno di un piccolo campo visivo. In questo studio, il test dell'impronta di adesione è stato utilizzato per studiare le cellule HL-60 che rotolano a diverse sollecitazioni di taglio. In tal modo, siamo stati in grado di visualizzare la distribuzione spaziale dell'interazione P-selectina: PSGL-1 e ottenere informazioni sulle loro forze molecolari attraverso l'intensità della fluorescenza. Pertanto, questo metodo fornisce le basi per l'indagine quantitativa delle varie interazioni cellula-superficie coinvolte nell'adesione a rotolamento a livello molecolare.

Il protocollo di cui sopra descrive la procedura sperimentale del test dell'impronta di adesione. Il flusso di lavoro generale dell'esperimento è illustrato nella Figura 1, dall'assemblaggio della camera di flusso (Figura 1A) alla funzionalizzazione della superficie (Figura 1B) e alle fasi di esperimento e imaging (Figura 1C).
La Figura 2 è un ri...

Questo protocollo presenta le procedure sperimentali per eseguire il test dell'impronta di adesione per visualizzare gli eventi di adesione durante l'adesione a laminazione rapida delle cellule.

Imaging dell'adesione molecolare nel laminaggio cellulare mediante analisi dell'impronta di adesione

Rolling adhesion, facilitated by selectin-mediated interactions, is a highly dynamic, passive motility in recruiting leukocytes to the site of ...

Questo protocollo aiuta a stabilire la connessione tra forza molecolare e comportamento di rotolamento cellulare oltre a consentire di mappare e quantificare spazialmente l'adesione al rotolamento a livello molecolare. Questa tecnica permette di studiare i singoli eventi di adesione durante il rotolamento cellulare effettivo permettendoci di misurare direttamente la forza di adesione molecolare fisiologicamente rilevante. La preparazione della superficie utilizzando la concentrazione e il tempo di incubazione appropriati in ogni fase è fondamentale per ottenere una funzionalizzazione superficiale di alta qualità.Anche la qualità delle bioconiugazioni e le condizioni adeguate sono cruciali. La dimostrazione visiva è fondamentale per aiutare i ricercatori a replicare questo protocollo. In particolare, le fasi come l'assemblaggio della camera di flusso e la post-elaborazione delle immagini trarranno grande beneficio da una dimostrazione visiva.Inizia stendendo sottilmente una piccola quantità di resina epossidica su entrambi i lati del nastro biadesivo con una lama di rasoio. Utilizzando un laser, tagliare il nastro rivestito con resina epossidica per creare quattro canali. Create il chip di flusso inserendo il nastro epossidico tra una slitta a quattro fori e una slitta di copertura PEG.Utilizzando una punta della pipetta, applicare una leggera pressione lungo la lunghezza dei canali per creare una buona tenuta, quindi polimerizzare la resina epossidica per un minimo di un'ora. Allineare il chip in modo che l'apertura di ciascun canale sia posizionata al centro dell'adattatore. Quindi posizionare due distanziali acrilici trasparenti sulla parte superiore del chip.Applicare una pressione decisa al centro del blocco e avvitare alle estremità di ciascun distanziatore. Avvitare gli ingressi nei fori filettati sull'altro lato della staffa e monitorare le condizioni di tenuta attraverso il blocco acrilico trasparente. Flusso 200 microlitri di tampone di lavaggio nella camera per verificare la presenza di perdite.Se si formano bolle nel canale, spingere aggressivamente altri 200 microlitri di tampone di lavaggio per rimuovere le bolle. Aggiungere 40 microlitri di BSA alla camera di flusso per evitare legami non specifici e incubare per 10 minuti nella camera di umidità. Dopo l'incubazione, aggiungere 40 microlitri a Tween 20 alla camera di flusso e di nuovo incubare per 10 minuti per ridurre ulteriormente il legame non specifico.Quindi lavare il canale con 200 microlitri di tampone di lavaggio per rimuovere tutti gli agenti di passivazione. Per la funzionalizzazione della superficie della camera, aggiungere 40 microlitri di Streptavidin alla camera di flusso e incubare per 20 minuti, quindi lavare la camera con 200 microlitri di tampone di lavaggio. Ora, aggiungi 40 microlitri di proteina ibridata G-TGT alla camera di flusso e incuba per 20 minuti.Dopo il lavaggio con tampone di lavaggio, aggiungere 40 microlitri di proteina G-TGT top strand e incubare per 20 minuti per completare qualsiasi filamento inferiore TGT non ibridato sulla superficie e quindi lavare con tampone di lavaggio. Infine, aggiungere 40 microlitri di P-selectin-Fc alla camera di flusso e incubare per 60 minuti prima del lavaggio con tampone di lavaggio. Riempire una siringa di vetro da cinque millilitri con il tampone di rotolamento e picchiettare i lati della siringa per rimuovere e spingere fuori le bolle mentre galleggiano verso la punta.Dopo aver inserito un ago sterile in un pezzo di tubo di polietilene da 200 millimetri, collegare l'ago alla siringa di vetro. Fissare la siringa sulla pompa della siringa e inclinare la pompa della siringa in modo che il lato dello stantuffo sia sollevato per evitare che le bolle d'aria entrino nel canale. Inserire l'estremità del tubo nell'ingresso della camera di flusso.Inserire un'estremità di un altro pezzo da 200 millimetri del tubo di polietilene nell'uscita e immergere l'altra estremità in un becher di scarto. Prelevare da uno a due millilitri del campione di sospensione cellulare e centrifugare per pellettare le celle. Rimuovere il mezzo e risospese delicatamente le celle in 500 microlitri del tampone di rotolamento.Scollegare con cura il tubo dalle prese e l'uscita e la pipetta 40 microlitri della sospensione cellulare nella camera di flusso. Ricollegare il tubo come descritto in precedenza assicurandosi che le bolle non vengano introdotte nel canale di flusso. Iniziare l'esperimento di laminazione cellulare avviando la pompa della siringa alle portate desiderate.Osserva il rotolamento cellulare usando un microscopio a campo oscuro con un obiettivo 10X. Una volta completato l'esperimento, rimuovere le celle dal canale infondendo il tampone di rotolamento a 100 millilitri all'ora fino a quando la superficie non è libera da celle. Per l'imaging delle tracce locali tramite DNA-PAINT, aggiungere al canale 40 microlitri di filamento imager DNA-PAINT preparato nel buffer DNA-PAINT.Eseguire la microscopia a fluorescenza a riflessione interna totale utilizzando le condizioni menzionate nel manoscritto di testo. Localizza ed esegui il rendering delle immagini a super risoluzione. Per l'imaging delle tracce lunghe mediante etichettatura permanente, aggiungere il filamento imager permanente e incubare per 120 secondi nel buffer T50M5.Quindi lavare il canale infondendo 200 microlitri di tampone di lavaggio. Registrare un'immagine con il laser di eccitazione spento per ottenere il rumore di fondo della telecamera. Immagine di una vasta area in un modello a griglia mediante microscopia TIRF.Programmare il microscopio per scansionare l'area di 400 per 50 immagini e dividere i dati grezzi in singoli file TIP contenenti ciascuno un massimo di 10.000 immagini utilizzando il programma ImageJ. Appiattisci tutte le immagini utilizzando il profilo di illuminazione e utilizza il plugin MIST per cucire le immagini. Il risultato per la caratterizzazione della bioconiugazione della proteina G ssDNA ha mostrato un rapporto quasi uno a uno tra proteina G e ssDNA in cui la proteina G Maleimide ssDNA e gli spettri tampone di eluizione imidazolica dalla base ortogonale per adattarsi allo spettro di prodotti di bioconiugazione.La PAGE nativa è stata utilizzata per confermare la bioconiugazione che mostra le bande verde brillante che coincidono con la banda G della proteina monomerica che indica un successo della coniugazione e una buona resa. Il profilo di illuminazione TIRF introdotto da una fibra monomodale è generalmente più luminoso al centro del campo visivo e dimmer attorno ai bordi. Per compensare l'illuminazione irregolare e appiattire le immagini per l'analisi quantitativa, il profilo di illuminazione è stato determinato facendo una media di migliaia di singoli fotogrammi.Le immagini appiattite sono state prodotte sottraendo il rumore della fotocamera sia dai profili raw che da quelli di illuminazione e quindi normalizzandosi dal profilo di illuminazione. Le cuciture grezze mostravano chiari modelli periodici corrispondenti alle immagini non corrette, mentre lo stesso campo visivo cucito da immagini appiattite produceva uno sfondo piatto. È stato utilizzato un profilo di flusso ramp up per determinare l'intervallo di sforzo di taglio con conseguente rotolamento delle celle e tracce di fluorescenza di resa sotto le quali è stato possibile vedere una tipica impronta di adesione a cella singola.Vengono mostrati risultati non ottimali e ottimali di tracce fluorescenti con contrasto insufficiente, densità di traccia eccessiva, densità e contrasto di traccia ottimali e diffrazione limitata e imaging DNA-PAINT. Il tempo di incubazione superiore a 60 minuti garantisce la funzionalizzazione della superficie e la corretta costruzione della camera impedisce il passaggio di bolle che danneggiano la superficie funzionalizzata. Questa procedura è applicabile per l'analisi quantitativa della forza molecolare coinvolta nell'adesione al rotolamento e consente ai ricercatori di comprendere il comportamento di rotolamento dei diversi tipi di cellule.Questa tecnica consente ai ricercatori di esplorare nuove domande riguardanti gli eventi di adesione rapida che portano a un ulteriore progresso della ricerca sulla singola molecola e sulla meccanobiologia.

imaging-molecular-adhesion-in-cell-rolling-by-adhesion-footprint-assay

Research

Ricerca

JoVE Journal

Biology

Biologia

Abbiamo descritto un protocollo per osservare e analizzare le traiettorie delle cellule che rotola su asimmetrici recettore fantasia substrati. I dati risultanti sono utili per l'ingegneria del recettore-fantasia substrati per etichette senza separazione delle cellule e l'analisi.

Studiare Traiettorie cellulare Rolling Patterns Receptor asimmetrica

Un test per la misurazione della frequenza adesione recettore-ligando cinetiche di interazione quando entrambe le molecole sono ancorate sulla superficie delle cellule interagiscono è descritto. Questo test meccanico-based è esemplificato con una micropipetta pressurizzato globulo rosso umano come sensore di adesione e integrina αLβ2 e molecola di adesione intercellulare-1 come interagire recettori e ligandi.

Adesione saggio di frequenza per In Situ Analisi cinetica delle interazioni molecolari incrociati giunzionale alla cellula-cellula di interfaccia

Un metodo per l'assemblaggio di gradienti adesivi e solubile in una camera per gli studi di microscopia vivi migrazione cellulare è descritto. L'ambiente di ingegneria combina superfici antivegetative e le tracce adesive con pendenze soluzione e permette quindi di determinare l'importanza relativa di spunti di orientamento.

Creazione di sfumature adesivi e solubile per la migrazione di imaging cellulare con microscopia a fluorescenza

Questo studio ha utilizzato un sistema di microfluidica piastra multi-pozzetto, aumentando notevolmente la velocità di rotolamento studi cella in flusso di taglio fisiologicamente rilevanti. Data l'importanza della laminazione di cellule nella cella multi-step homing a cascata e l'importanza di homing delle cellule dopo la consegna sistematica delle popolazioni esogeni di cellule nei pazienti, questo sistema offre un potenziale come piattaforma di screening per migliorare la terapia cellulare.

Analisi sistematica delle In Vitro Cella rotolamento Utilizzando un piatto multi-ben Sistema Microfluidic

Saggi di adesione statica è un potente strumento che può essere utilizzato per modellare le interazioni tra linfociti T e altri tipi di cellule. Interazioni sono generati iniettando cellule T etichettati in pozzetti rivestiti con molecole di adesione, mentre un lettore di piastra viene utilizzato per quantificare il numero di cellule aderenti seguente lavaggi seriali.

Static Adesione saggio per lo Studio della integrina attivazione nei linfociti T

Rigidità meccanica nel microambiente tumorale gioca un ruolo cruciale nel guidare il comportamento maligno aumentando l'attività Invadopodi e actomiosina contrattilità. Utilizzando gel di poliacrilammide (PaaS), Invadopodi e forza di trazione test possono essere utilizzati per studiare le proprietà invasive e contrattili delle cellule tumorali in risposta alla matrice rigidità.

Gel di poliacrilammide per Invadopodi e trazione Forza saggi sulle cellule tumorali

Questo test di adesione flusso fornisce un semplice, modello alto impatto di cellule epiteliali interazioni delle cellule T. Una pompa siringa viene usato per generare forze di taglio, e la microscopia confocale cattura immagini per la quantificazione. L'obiettivo di questi studi è quello di quantificare in modo efficace l'adesione delle cellule T con condizioni di flusso.

Saggio di adesione Sotto Shear stress per lo studio di linfociti T-Adhesion Molecule Interazioni

aderenze superficie cellulare sono centrali in meccanotrasduzione, in quanto trasmettono tensione meccanica e avviare le vie di segnalazione coinvolte nella omeostasi dei tessuti e lo sviluppo. Qui, vi presentiamo un protocollo per sezionare i percorsi biochimici che si attivano in risposta a tensione, utilizzando microsfere magnetiche rivestite ligando e di applicazione della forza di recettori di adesione.

Analizzando cellulare superficie di adesione ritocca in risposta alla tensione meccanica utilizzando biglie magnetiche

Dinamica adesione delle cellule immuni alla parete del vaso è un prerequisito per homing gut. Qui, presentiamo un protocollo per un'analisi funzionale in vitro per l'analisi dell'impatto degli anticorpi anti-integrina, chemochine o altri fattori sull'adesione di dinamica delle cellule delle cellule umane utilizzando capillari α4β7 rivestite.

Analisi di adesione dinamico per l'analisi funzionale delle terapie di anti-adesione nelle malattie intestinali infiammatorie

Imaging di entrambi, l'isolato della membrana plasmatica e il volume intracellulare circostante, sarà presentato un microscopio avanzato che consentono veloce e ad alta risoluzione. L'integrazione di filatura disco e totale microscopia di fluorescenza di riflessione interna in un'unica configurazione permette esperimenti dal vivo imaging al prezzo di acquisizione alta fino a 3,5 s per serie di immagini.

Visualizzazione di formazione di aderenze in cellule per mezzo di avanzati filatura microscopia di fluorescenza di riflessione interna totale disco

L'articolo descrive la quantificazione di 1) le dimensioni e il numero di adereni focali e 2) l'indice di forma cellulare e la sua distribuzione da immagini confocali dei monostrati confluenti delle cellule MCF7.

Quantificazione dell'area di adesione del substrato cellulare e della distribuzione delle forme cellulari nei monostrati cellulari MCF7

Impara l'imaging dell'adesione molecolare nel laminaggio cellulare mediante analisi dell'impronta di adesione. Questo metodo consente di quantificare le forze di adesione molecolare rilevanti fisiologicamente.

Imaging dell'adesione molecolare nel laminaggio cellulare mediante analisi dell'impronta di adesione

Esplora altri video