Preparazione del campione utilizzando un metodo monostrato lipidico per studi cristallografici elettronici

Nel corso degli anni, i monostrati lipidici sono stati utilizzati come strato di supporto per favorire la cristallizzazione 2D delle proteine di membrana periferica e delle proteine solubili. Questo metodo può essere applicato anche alla cristallizzazione 2D, come alcune proteine di membrana integrali. Ma richiede un'indagine empirica più ampia per determinare le condizioni di detergente e dialisi per promuovere il partizionamento al monostrato lipidico.

Un monostrato lipidico si forma all'interfaccia aria-acqua, in modo tale che i gruppi di testa polare del lipide rimangano idratati nella fase acquosa. E le code acilici non polari della partizione lipidica all'interfaccia aria-acqua, che rompe la tensione superficiale e appiattisce la superficie dell'acqua. La natura di carica, le parti chimiche distintive dei gruppi di testa lipidica forniscono l'affinità per le proteine in soluzione.

Promuovere il binding e, in linea di principio, la formazione di array 2D. Qualsiasi cristallo 2D formato su un monostrato lipidico può essere facilmente trasferito al microscopio elettronico su una griglia EM rivestita di carbonio che viene utilizzata per sollevare e supportare l'array cristallino sullo strato lipidico. Abbiamo descritto in questo manoscritto, una metodologia lipidica monostrato per l'imaging criogenico al microscopio elettronico.

Preparazione monostrato lipidico. Preparazione del brodo lipidico, preparare una miscela lipidica da 0,01 mg per ml in 9: 1 volume a volume cloroformio, metanolo. Utilizzando 8,91 ml di cloroformio e 0,99 ml di metanolo e 0,1 ml di una soluzione lipidica da 10 mg per ml.

Preparazione piastra in teflon. Sonicare una piastra di teflon in un bagno di metanolo per cinque minuti. Lavare con acqua calda per 15 minuti e poi risciacquare con acqua distillata.

Asciugare la piastra di Teflon in un essiccato per 30 minuti e tenerla sotto vuoto fino all'uso. Formazione di monostrato lipidico sul serbatoio tampone. Il tempo di funzionamento stimato sarà di un'ora e mezza.

Posizionare una carta da filtro di tipo uno in una capsula di Petri e disporre il blocco di teflon sopra la carta da filtro. Riempire i pozzi della piastra in Teflon con 60 microlitri di tampone. Aggiungere con attenzione la miscela liquida sulla superficie del tampone goccia a goccia.

Idealmente un microlitro per goccia usando una siringa Hamilton. Bagnare la carta da filtro con acqua distillata e mantenere l'umidità nella capsula di Petri. Incubare a temperatura ambiente per 60 minuti, il cloroformio dovrebbe evaporare e si dovrebbe formare un monostrato di lipidi sulla superficie dei tamponi.

Applicazione di una griglia EM su un monostrato lipidico. Tempo di funzionamento stimato di un'ora e mezza. Posizionare delicatamente una griglia EM rivestita in carbonio senza che il bagliore scarici il carbonio si disenni verso il basso sulla superficie di ciascun serbatoio tampone.

Iniettare con cura le proteine nell'iniezione laterale bene, utilizzare le concentrazioni proteiche finali nel pozzo intorno a un micromolare. Incubare 60 minuti a temperatura ambiente. Iniettare delicatamente circa 20-30 microlitri di tampone nella porta di iniezione del sito per sollevare la griglia sopra la superficie del blocco di Teflon.

Ciò consente di raccogliere la griglia con un paio di pinzette e sollevarla verticalmente dalla goccia. Risultati rappresentativi. Un monostrato lipidico depositato su una griglia EM può essere visualizzato al microscopio elettronico a trasmissione senza colorazione a contrasto.

La presenza del monostrato può essere riconosciuta, dalla differenza di contrasto dall'area senza alcun campione in quel percorso del fascio. Le aree che hanno una copertura lipidica monostrato hanno un contrasto inferiore rispetto a quelle senza copertura. Poiché il fascio di elettroni attraverso i fori vuoti non ha dispersione, mostra un'illuminazione più luminosa.

In conclusione, il metodo del monostrato lipidico offre l'opportunità di studiare le strutture proteiche grazie alla sua semplicità. Può fornire un approccio alternativo per facilitare il processo di cristallizzazione 2D.