Name: Rilevamento del virus e delle proteine salivari di un vettore cicalina nellospite della pianta (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 23 s
Description: Scopri come rilevare le proteine salivari delle cicaline e i virus nelle piante ospiti utilizzando Western blot e SDS-PAGE. Questo metodo stabile e replicabile aiuta a studiare le interazioni tra insetti e piante.

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Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni della National Natural Science Foundation of China (31772124 e 31972239) e della Fujian Agriculture and Forestry University (Grant KSYLX014).

Le cicaline adulte non virulifere sono state propagate nel Vector-borne Virus Research Center della Fujian Agriculture and Forestry University, in Cina.
1. Allevamento di insetti non viruliferi
<ol><li>Allevare gli adulti su piantine di riso in una gabbia cubica di 40 cm x 35 cm x 20 cm (lunghezza x larghezza x altezza). Tenere un lato della gabbia coperto con una rete a prova di insetti per la ventilazione.<ol><li>Tenere le gabbie con cicaline in un'incubatrice che contenga un regolatore di umidità integrato a 26 °C con un'umidità relativa del 60-75% in un fotoperiodo di 16 ore di luce e 8 ore di buio.</li>
	</ol></li>
	<li>Usa un aspiratore per trasferire delicatamente tutti gli adulti dalla loro gabbia in una nuova gabbia che contiene piantine di riso fresco ogni settimana.<ol><li>Lascia che più di 200 adulti si accoppiano e depongano le uova nel riso.</li>
		<li>Conserva le vecchie piantine di riso affinché le ninfe emergano. Solleva queste nuove ninfe non virulifere allo stadio a 2 stelle.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Acquisizione del virus e raccolta di insetti viruliferi
<ol><li>Trasferire con cautela le ninfe non virulifere a 2 pollici in un tubo di coltura di vetro (2,5 cm di diametro per 15 cm di altezza) per 1-2 ore per fame usando l'aspiratore.<ol><li>Rilascia le ninfe in una gabbia che contiene una pianta di riso infetta da RDV coltivata in una pentola.</li>
		<li>Permettere alle ninfe di nutrirsi della pianta di riso infetta per 2 giorni. NOTA: Innaffiare con cura la pianta di riso ed evitare di lavare via le ninfe. Le ninfe a 2 stelle sono lunghe circa 1,6-2 mm.</li>
	</ol></li>
	<li>Trasferire con cura queste ninfe in una nuova gabbia che contenga piantine di riso fresco privo di virus con un'umidità relativa del 60-75% sotto un fotoperiodo di 16 ore di luce e 8 ore di buio. Consentire alle ninfe di nutrirsi della pianta di riso infetta per 12 giorni per completare il periodo di trasmissione circolativa di RDV.</li>
</ol>3. Raccolta di proteine salivari utilizzando una gabbia di alimentazione
<ol><li>Preparare cinque piccole gabbie di alimentazione simili a tubi (2,5 cm di diametro per 4 cm di altezza) in cui un'estremità è coperta con reti a prova di insetti.</li>
	<li>Confinare 15-20 cicaline in ogni gabbia di alimentazione, quindi coprire l'altra estremità della gabbia con un sottile tappetino di schiuma.<ol><li>Fissare una piantina di riso (alta 5-6 cm) tra l'estremità della gabbia e un tappetino di schiuma con dei nastri. Assicurarsi che le cicaline nella gabbia di alimentazione possano nutrirsi delle piantine di riso esposte all'interno della gabbia.</li>
	</ol></li>
	<li>Immergere le radici della piantina in acqua in modo che la pianta di riso rimanga viva. Lascia che le cicaline si nutrano di loro per 2 giorni.</li>
	<li>Rimuovere le cicaline dalle loro gabbie di alimentazione e raccogliere le piantine di riso su cui si sono nutriti. Tagliare le parti delle piantine al di fuori della gabbia e recuperare le regioni di alimentazione delle piantine. NOTA: Questo campione può essere conservato a -80 °C per un massimo di 3 mesi, se non viene immediatamente utilizzato per il rilevamento.</li>
</ol>4. Preparazione del reagente
<ol><li>Sciogliere 15,1 g di Tris-base, 94 g di glicina e 5 g di SDS in 1 L di acqua sterile per preparare 5xTris-glicina tampone. Diluire 200 mL di tampone 5xTris-glicina con 800 mL di acqua sterile per preparare 1xTris-glicina tampone (vedere Tabella 1 per la composizione tampone).</li>
	<li>Sciogliere 80 g di NaCl, 30 g di Tris-base e 2 g di KCl in 1 L di acqua sterile per preparare 10xTris-tamponed tamponed tamponed (TBS) tampone. Autoclavare la soluzione a 121 °C per 15 min.</li>
	<li>Sciogliere 8 g di SDS, 4 ml di ß-mercaptoetanolo, 0,02 g di blu di bromofenolo e 40 ml di glicerolo in 40 ml di 0,1 M Tris-HCl (pH 6,8) per preparare 4 tampone per campioni proteici.</li>
	<li>Mescolare 800 mL di tampone Tris-glicina con 200 mL di metanolo per preparare il tampone di trasferimento.</li>
	<li>Aggiungere 100 mL di soluzione 10xTBS e 3 mL di Tween 20 a 900 mL di acqua sterile per preparare il tampone TBS con soluzione Tween 20 (TBST).</li>
</ol>5. Western blotting per rilevare la saliva e le proteine virali
<ol><li>Macinare 0,1 g dei campioni di riso con azoto liquido fino a quando il tessuto diventa polvere. Aggiungere 200 μL di tampone proteico 4x al campione e farlo bollire per 10 minuti. Centrifugare i campioni a 12.000 x g per 10 minuti a temperatura ambiente.<ol><li>Rimuovere il surnatante e inserirlo in un nuovo flaconcino. Caricare 10 μL del campione in un gel SDS-PAGE ed eseguirlo in tampone Tris-glicina a 150 V per 45-60 minuti. NOTA: Il residuo dopo la centrifugazione può essere eliminato.</li>
	</ol></li>
	<li>Inserire una membrana nitrocellulosa da 0,45 μm e altre forniture sandwich nel tampone di trasferimento per 30 minuti. NOTA: Questo passaggio può essere eseguito prima che il gel abbia completato la sua esecuzione.</li>
	<li>Inserire il gel e trasferirlo per 90-120 minuti a 100 V nel tampone di trasferimento.</li>
	<li>Prendere la membrana e metterla in una soluzione di blocco del latte secco non grasso al 7% in soluzione TBST per 20 minuti. Aggiungere l'anticorpo specifico contro RDV P8 o Vg a una soluzione al 7% di latte in polvere non grasso in TBST. Incubare con l'anticorpo per colorare la membrana per 2 ore o durante la notte.</li>
	<li>Lavare la membrana con soluzione TBST tre volte, con 5 minuti di lavaggio ogni volta.</li>
	<li>Aggiungere le IgG anti-coniglio di capra come anticorpo secondario al 7% di latte secco non grasso con TBST. Incubare con l'anticorpo per 60-90 minuti a temperatura ambiente.</li>
	<li>Lavare la membrana con la soluzione TBST tre volte per 5 minuti ogni volta.</li>
	<li>Utilizzare il kit ECL Western per il metodo chemiluminescente. Miscelare i reagenti di rilevamento 1 e 2 nel kit con un rapporto di 1:1 in un tubo. Mettere il reagente miscelato sulla membrana e incubare il tampone per 5 minuti.</li>
	<li>Drenare il reagente in eccesso e scattare una foto colorimetrica dell'immagine chemiluminescente. Combinali per vedere la scala con bande proteiche.</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

La saliva direttamente secreta dalle ghiandole salivari degli insetti penetranti svolge un ruolo fondamentale perché predigerisce e disintossica i tessuti ospiti e i fattori biologici cross-kingdom dei vettori negli ospiti 1,3,4. I fattori biologici cross-kingdom, inclusi elicitori, effettori e piccolo RNA, sono critici per la comunicazione insetto-ospite14,15,16</s...

La modalità di trasmissione vettore-ospite degli arbovirus, un problema fondamentale, è alla frontiera della scienza biologica. Molti virus vegetali di importanza agricola sono trasmessi orizzontalmente da insetti vettori1. Più della metà dei virus vegetali sono veicolati da insetti emitteri, tra cui afidi, mosche bianche, cicaline, cicaline e tripidi. Questi insetti hanno caratteristiche distinte che consentono loro di trasmettere in modo efficiente i virus delle piante1. Possiedono apparato boccale penetrante-succhiante e si nutrono della linfa di floema e xilema e secernono la loro saliva 1,2,3,4. Con lo sviluppo e il miglioramento delle tecniche, l'identificazione e l'analisi funzionale delle componenti salivari stanno diventando un nuovo obiettivo di ricerca intensiva. Le proteine salivari conosciute nella saliva includono numerosi enzimi, come la pectinesterasi, la cellulasi, la perossidasi, la fosfatasi alcalina, la polifenolo ossidasi e la sucrasi, tra gli altri 5,6,7,8,9,10,11,12,13 . Le proteine della saliva includono anche elicitori che innescano la risposta di difesa dell'ospite, alterando così le prestazioni degli insetti, ed effettori che sopprimono la difesa dell'ospite, che migliora la forma fisica degli insetti e componenti che inducono risposte patologiche dell'ospite14,15,16,17. Pertanto, le proteine della saliva sono materiali vitali per la comunicazione tra insetti e ospiti. Durante la trasmissione dei virus, la saliva secreta dalle ghiandole salivari degli insetti viruliferi penetranti contiene anche proteine virali. I componenti virali utilizzano il flusso di saliva per rilasciarli dall'insetto all'ospite della pianta. Pertanto, la saliva dell'insetto collega l'interazione tritrofica virus-vettore-ospite. Studiare la funzione biologica delle proteine della saliva secrete dagli insetti viruliferi aiuta a comprendere la relazione virus-vettore-ospite.
Per i virus animali, è stato riferito che la saliva delle zanzare media la trasmissione e la patogenicità del virus del Nilo occidentale (WNV) e del virus Dengue (DENV). La proteina saliva AaSG34 promuove la replicazione e la trasmissione del virus dengue-2, mentre la proteina saliva AaVA-1 promuove la trasmissione dei virus DENV e Zika (ZIKV) attivando l'autofagia18,19. La proteina saliva D7 delle zanzare può inibire l'infezione da DENV in vitro e in vivo attraverso l'interazione diretta con i virioni DENV e la proteina ricombinante dell'involucro DENV20. Nei virus vegetali, il begomovirus tomato yellow leaf curl virus (TYLCV) induce la proteina salivare Bsp9 della mosca bianca, che sopprime l'immunità mediata da WRKY33 dell'ospite della pianta, per aumentare la preferenza e le prestazioni delle mosche bianche, aumentando infine la trasmissione dei virus21. Poiché gli studi sul ruolo che le proteine salivari degli insetti svolgono negli ospiti delle piante sono rimasti indietro rispetto a quelli degli ospiti animali, è urgentemente necessario un sistema stabile e affidabile per rilevare le proteine salivari negli ospiti delle piante.
Il virus vegetale noto come virus nano del riso (RDV) è trasmesso dalla cicalina Nephotettix cincticeps (Hemiptera: Cicadellidae) con elevata efficienza e in modo persistentemente propagante22,23. RDV è stato segnalato per la prima volta per essere trasmesso da un insetto vettore e causa una grave malattia del riso in Asia24,25. Il virione è icosaedrico e sferico a doppio strato, e lo strato esterno contiene la proteina22 del capside esterno P8. Il periodo di trasmissione circolativa di RDV in N. cincticeps è di 14 giorni 26,27,28,29,30. Quando l'RDV arriva alle ghiandole salivari, i virioni vengono rilasciati nelle cavità immagazzinate nella saliva nelle ghiandole salivari attraverso un meccanismo simile all'esocitosi23. La vitellogenina (Vg) è il precursore della proteina del tuorlo essenziale per lo sviluppo degli ovociti nelle femmine di insetti31,32,33. La maggior parte delle specie di insetti ha almeno un trascritto Vg di 6-7 kb, che codifica per una proteina precursore di circa 220 kDa. I precursori proteici di Vg possono solitamente essere scissi in frammenti grandi (da 140 a 190 kDa) e piccoli (<50 kDa) prima di entrare nell'ovaio18,19. Precedenti analisi proteomiche hanno rivelato la presenza dei peptidi derivati da Vg nella saliva secreta della cicalina Recilia dorsalis, sebbene la loro funzione sia sconosciuta (dati non pubblicati). È stato recentemente riportato che Vg, che è secreto per via orale dalle cavallette, funziona come effettore per danneggiare le difese delle piante34. Non è noto se il Vg di N. cincticeps possa anche essere rilasciato all'ospite della pianta con flusso salivare, e quindi potrebbe svolgere un ruolo nella pianta per interferire con le difese della pianta. Per capire se N. cincticeps sfrutta le proteine salivari, come Vg, per inibire o attivare le difese delle piante, il primo passo è identificare le proteine rilasciate alla pianta durante l'alimentazione. Comprendere il metodo per identificare le proteine salivari presenti nella pianta è potenzialmente essenziale per spiegare la funzione delle proteine della saliva e le interazioni tra Hemiptera e piante.
Nel protocollo qui presentato, N. cincticeps è usato come esempio per fornire un metodo per esaminare la presenza di proteine salivari nell'ospite della pianta introdotte attraverso l'alimentazione degli insetti. Il protocollo descrive principalmente la raccolta e la rilevazione delle proteine salivari ed è utile per ulteriori indagini sulla maggior parte degli emitteri.

<table><tbody><tr><td><forte>Reagenti</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Roche</td><td>D609K69032</td><td>Per 5&volte; Tampone tris-glicina e 10&times; Preparazione tampone TBS</td></tr><tr><td>glicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>WXBD0677V</td><td>Per 5&volte; Preparazione del tampone tris-glicina</td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SLCB4394</td><td>Per 5&volte; Preparazione del tampone tris-glicina</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>10019318</td><td>per 10&volte; Preparazione del tampone TBS</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>10016318</td><td>per 10&volte; Preparazione del tampone TBS</td></tr><tr><td>&szlig;-mercaptoetanolo</td><td>Reagente Xiya</td><td>B14492</td><td>Per 4&volte; preparazione del tampone del campione proteico</td></tr><tr><td>blu di bromofenolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SHBL3668</td><td>Per 4&volte; preparazione del tampone del campione proteico</td></tr><tr><td>glicerolo</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>10010618</td><td>Per la preparazione del tampone del campione proteico 4&volte;</td></tr><tr><td>metanolo</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>10014118</td><td>Per la preparazione del tampone di trasferimento</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Coolaber SCIENCE& TeCHNoLoGY</td><td>CT30111220</td><td>Per la preparazione TBST</td></tr><tr><td>latte secco scremato</td><td>Becton.Dickinso and company</td><td>252038</td><td>Per il blocco della membrana, la diluizione degli anticorpi</td></tr><tr><td>capra anti-coniglio IgG</td><td>Sangon Biotech</td><td>D110058-0001</td><td>Riconoscimento del</td></tr><tr><td>kit ECL Western</td> primario e tibody <td>ThermoFisher Scientific</td><td>32209</td><td>Substrato chemiluminescente</td></tr><tr><td>nitrocellulosa membrana</td><td>Pall Corporation</td><td>25312915</td><td>Per il trasferimento di proteine</td></tr><tr><td>Tamponi e soluzioni</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Buffer</td><td>Composizione</td><td></td><td>Comments/Description</td></tr><tr><td>&nbsp; 5&volte; Tampone tris-glicina</td><td>15,1 g Tris base 94 g glicina &nbsp; 5 g di SDS in 1 L di acqua</td><td></td> sterile<td>&nbsp; Soluzione stock</td></tr><tr><td>1&volte; Tampone tris-glicina</td><td>200 mL da 5&times; Tampone tris-glicina 800 mL di acqua</td><td></td> sterile <td>Soluzione di lavoro, per SDS-PAGE</td></tr><tr><td>10&volte; Soluzione salina tamponata Tris (TBS) tampone</td><td>80 g NaCl 30 g Tris base 2 g KCl in 1 L di acqua</td><td></td> sterile Soluzione <td>madre</td></tr><tr><td>TBS con soluzione Tween 20 (TBST)</td><td>100 mL 10&times; Soluzione TBS 3 mL Tween 20 900 mL di acqua</td><td></td> sterile <td>Soluzione di lavoro</td></tr><tr><td>4& tampone campione proteico</td><td>8 g SDS 4 mL &szlig;-mercaptoetanolo 0,02 g di blu di bromofenolo 40 mL di glicerolo in 40 mL 0,1 M Tris-HCl (pH 6,8)</td><td></td><td>Per l'estrazione di proteine</td></tr><tr><td>Tampone di trasferimento</td><td>800 mL di tampone tris-glicina 200 mL di metanolo</td><td></td><td>Per trasferimento di proteine</td></tr><tr><td>Instruments</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bromophenol blue</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SHBL3668</td><td>Per la preparazione di tamponi per campioni di proteine</td></tr><tr><td>4x Incubatore a temperatura costante</td><td>Ningbo Saifu Experimental Instrument Co., Ltd.</td><td>PRX-1200B</td><td>Per l'allevamento di cicaline</td></tr><tr><td>Elettroforesi</td><td>Tanon Science & Fornitore verificato - Technology Co., Ltd.</td><td>Tanon EP300</td><td>Per SDS-PAGE</td></tr><tr><td>Modulo centrale di trasferimento elettroforetico</td><td>BIO-RAD</td><td>1703935</td><td>Per SDS-PAGE</td></tr><tr><td>glicerolo</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>10010618</td><td>Per 4x preparazione di tamponi per campioni di proteine</td></tr><tr><td></td><td>glicina Sigma-Aldrich</td><td>WXBD0677V</td><td>Per 5x preparazione di tamponi tris-glicina</td></tr><tr><td>capra anti-coniglio IgG</td><td>Sangon Biotech</td><td>D110058-0001</td><td>Riconoscimento dello strumento primario e</td></tr><tr><td>passa-alto per la macinazione dei tessuti</td><td>Shanghai Jingxin Industrial Development Co., Ltd.</td><td>JXFSIPRP-24</td><td>Per la macinazione di tessuti vegetali</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>10016318</td><td>Per la preparazione di tamponi 10x TBS</td></tr><tr><td>metanolo</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>10014118</td><td>Per la preparazione del tampone di trasferimento</td></tr><tr><td>Mini canale di trasferimento di calore umido</td><td>BIO-RAD</td><td>1703930</td><td>Per SDS-PAGE</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>10019318</td><td>Per la preparazione del tampone 10x TBS</td></tr><tr><td>membrana nitrocellulosica</td><td>Pall Corporation</td><td>25312915</td><td>Per il trasferimento di proteine</td></tr><tr><td>latte secco scremato</td><td>Becton.Dickinso e società</td><td>252038</td><td>Per il blocco della membrana, la diluizione degli anticorpi</td></tr><tr><td>Pierce ECL Western kit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>32209</td><td>Substrato chemiluminescente</td></tr><tr><td>Strumento per il colore delle proteine</td><td>GE Sanità bio-scienze AB</td><td>Amersham lmager 600</td><td>Per la rilevazione</td></tr><tr><td>di proteine SDS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SLCB4394</td><td>Per 5x preparazione di tampone Tris-glicina</td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Roche</td><td>D609K69032</td><td>Per 5x tampone Tris-glicina e 10&times; Preparazione del tampone TBS</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Coolaber SCIENCE& TeCHNoLoGY</td><td>CT30111220</td><td>Per la preparazione TBST</td></tr><tr><td>Vasca per elettroforesi a piastra verticale</td><td>BIO-RAD</td><td>1658001</td> Per bagno d'acqua <td>SDS-PAGE</td></tr><tr><td></td><td>Shanghai Jinghong Experimental equipment Co., Ltd.</td><td>XMTD-8222</td><td>Per far bollire i campioni proteici</td></tr><tr><td>&beta;-mercaptoetanolo</td><td>Reagente Xiya</td><td>B14492</td><td>Per la preparazione di tamponi per campioni proteici 4x</td></tr></tbody></table>

rilevamento del virus e delle proteine salivari di un vettore cicalina nell'ospite della pianta

Detecting Virus and Salivary Proteins of a Leafhopper Vector in the Plant Host

Gli insetti vettori trasmettono orizzontalmente molti virus vegetali di importanza agricola. Più della metà dei virus vegetali sono trasmessi da insetti emitteri che hanno apparato boccale penetrante-succhiatore. Durante la trasmissione virale, la saliva dell'insetto collega il virus-vettore-ospite perché i virus vettori della saliva e le proteine degli insetti innescano o sopprimono la risposta immunitaria delle piante dagli insetti agli ospiti delle piante. L'identificazione e l'analisi funzionale delle proteine salivari stanno diventando una nuova area di interesse nel campo di ricerca delle interazioni arbovirus-ospite. Questo protocollo fornisce un sistema per rilevare le proteine nella saliva delle cicaline utilizzando l'ospite della pianta. Il vettore cicalina Nephotettix cincticeps infettato dal virus nano del riso (RDV) serve come esempio. La vitellogenina e la principale proteina del capside esterno P8 di RDV veicolata dalla saliva di N. cincticeps possono essere rilevate simultaneamente nella pianta di riso di cui si nutre N. cincticeps. Questo metodo è applicabile per testare le proteine salivari che vengono trattenute transitoriamente nell'ospite della pianta dopo l'alimentazione degli insetti. Si ritiene che questo sistema di rilevamento andrà a beneficio dello studio delle interazioni emittero-virus-pianta o emittero-pianta.

La figura 1 illustra tutte le fasi di questo protocollo: allevamento di insetti, acquisizione del virus, raccolta di proteine salivari attraverso l'alimentazione del riso e western blot. I risultati delle macchie occidentali hanno mostrato che bande specifiche e attese di circa 220 kDa sono state osservate nei campioni di riso e ghiandole salivari di insetti sulla membrana incubata con anticorpi contro Vg. Al contrario, nessuna banda è stata osservata nel campione di riso non alimen...

Questo protocollo dimostra come utilizzare l'ospite della pianta per rilevare le proteine salivari delle cicaline e le proteine virali vegetali rilasciate dai vettori delle cicaline.

Rilevamento del virus e delle proteine salivari di un vettore cicalina nell'ospite della pianta

Insect vectors horizontally transmit many plant viruses of agricultural importance. More than one-half of plant viruses are transmitted by hemipteran ...

Questo protocollo fornisce una tecnica per rilevare le proteine salivari delle cicaline e degli ospiti delle piante per indagare ulteriormente la funzione di queste proteine negli ospiti della pianta. Questa tecnica è facile da eseguire e il sistema è stabile e replicabile. Questo metodo potrebbe anche essere utile nella rilevazione di proteine salivari di altri emitteri e ospiti vegetali.Per iniziare, alleva le cicaline adulte su piantine di riso in una gabbia cubica di 40 per 35 per 20 centimetri. Tenere un lato della gabbia coperto con una rete a prova di insetti per la ventilazione. Posizionare le gabbie con le cicaline in un'incubatrice contenente un regolatore di umidità integrato a 26 gradi Celsius con un'umidità relativa compresa tra il 60 e il 75% in un periodo fotografico di 16 ore di luce e otto ore di buio.Una volta alla settimana, utilizzare un aspiratore per trasferire delicatamente tutti gli adulti dalla loro gabbia in una nuova gabbia contenente piantine di riso fresco. Consentire a più di 200 adulti di accoppiarsi e deporre le uova nel riso. Conserva le vecchie piantine di riso affinché le ninfe emergano e alleva queste nuove ninfe non virulifere al secondo stadio instar.Usando l'aspiratore, trasferire con attenzione le ninfe non virulifere del secondo stadio in un tubo di coltura di vetro per una o due ore per la fame. Quindi rilasciare le ninfe in una gabbia contenente una pianta di riso infetta da virus nano del riso coltivata in una pentola e consentire alle ninfe di nutrirsi della pianta di riso infetta per due giorni. Dopo due giorni, trasferire con cura queste ninfe in una nuova gabbia che contenga piantine di riso fresche prive di virus e consentire alle ninfe di nutrirsi delle piantine di riso prive di virus per 12 giorni per completare il periodo di trasmissione circolativa del virus nano del riso.Per raccogliere le proteine salivari, preparare cinque piccole gabbie di alimentazione simili a tubi coperte da reti a prova di insetti su un'estremità. Dopo aver confinato da 15 a 20 cicaline in ogni gabbia, coprire l'altra estremità della gabbia con un sottile tappetino di schiuma. Fissare una piantina di riso tra l'estremità della gabbia e un tappetino di schiuma con nastri, assicurandosi che le cicaline nella gabbia di alimentazione possano nutrirsi delle piantine di riso esposte all'interno della gabbia.Immergere le radici della piantina in acqua in modo che la pianta di riso rimanga viva e consentire alle cicaline di nutrirsi di esse per due giorni. Dopo due giorni, rimuovere le cicaline dalle loro gabbie di alimentazione e raccogliere le piantine di riso su cui si sono nutrite le cicaline. Tagliare le piantine fuori dalla gabbia e recuperare le regioni di alimentazione delle piantine.Preparare 1x tampone Tris-Glycine diluendo 200 millilitri del tampone 5x preparato con 800 millilitri di acqua sterile. Quindi preparare 10x tampone TBS e autoclavare la soluzione a 121 gradi Celsius per 15 minuti. Quindi, preparare il tampone del campione proteico 4x.Quindi preparare il tampone di trasferimento mescolando 800 millilitri del tampone Tris-Glycine con 200 millilitri di metanolo. Infine, preparare la soluzione TBST aggiungendo 100 millilitri di 10x TBS e tre millilitri di Tween da 20 a 900 millilitri di acqua sterile. Per rilevare le proteine salivari e virali, macinare 0,1 grammi dei campioni di riso con azoto liquido fino a quando il tessuto diventa una polvere.Quindi aggiungere 200 microlitri del tampone del campione proteico 4x al campione e far bollire per 10 minuti. Centrifugare i campioni e trasferire il surnatante in un nuovo flaconcino. Caricare 10 microlitri del campione su un gel SDS-PAGE ed eseguirlo in tampone Tris-Glycine a 150 volt per 45-60 minuti.Mentre il gel è in esecuzione, posizionare una membrana di nitrocellulosa da 0,45 micron e altre forniture sandwich nel tampone di trasferimento per 30 minuti. Dopo la corsa, inserire il gel e trasferirlo per 90-120 minuti a 100 volt nel tampone di trasferimento. Al termine dell'assatura, posizionare la membrana in una soluzione di blocco del latte secco senza grassi al 7% in TBST e incubare per 20 minuti.Successivamente, aggiungere un anticorpo contro il virus nano del riso P8 o la vitellogenina e incubare la membrana per due ore o durante la notte. Dopo l'incubazione, lavare la membrana con TBST tre volte con un'incubazione di cinque minuti tra ogni lavaggio. Quindi aggiungere IgG anti-coniglio di capra come anticorpo secondario e incubare la membrana per 60-90 minuti.Utilizzare il kit ECL Western per la rilevazione chemiluminescente nei reagenti di rivelazione misti uno e due nel kit con un rapporto di uno a uno. Mettere la membrana sul reagente miscelato e incubare la macchia per cinque minuti. Drenare il reagente in eccesso e scattare una foto chemiluminescente e colorimetrica della membrana.Combina le immagini per vedere quest'ultimo con bande proteiche. L'analisi Western blot per il rilevamento della vitellogenina ha mostrato bande specifiche e attese di circa 220 kilodalton nell'alimentazione delle piante di riso e delle ghiandole salivari degli insetti. Al contrario, nessuna banda è stata osservata nelle piante non nutritrici, indicando che la vitellogenina è stata rilasciata nell'ospite della pianta come proteina salivare.L'analisi Western blot per il rilevamento della proteina P8 del virus nano del riso ha mostrato una banda specifica e prevista di circa 46 kilodalton nelle piante nutritrici e nei corpi di insetti viruliferi. Al contrario, nessuna banda è stata osservata nelle piante non nutritrici e nei corpi di cicaline non virulifere, dimostrando che le proteine virali potrebbero essere rilevate anche nelle piante nutrienti. La carica virale nelle cicaline, i tempi di rilevamento e le repliche devono essere presi in considerazione durante l'esecuzione di questo protocollo.Questo metodo può essere applicato anche per studiare le zanzare che trasmettono arbovirus.

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JoVE Journal

Biology

Biologia

Gli afidi sono efficaci trasmettitori di virus delle piante. Microiniezione afide del virus, la procedura che vi mostrerò oggi, è una tecnica che permette ai ricercatori di iniettare virus direttamente nel hemocoel di afidi, bypassando l'intestino, uno dei 2 principali ostacoli per la trasmissione del virus in modo circulative. La stessa tecnica viene utilizzata anche per iniettare dsRNA per RNAi.

Test della barriere fisiologiche di trasmissione virale in Afidi Utilizzando Microiniezione

Source: Zhang, L., et al. Immunofluorescent Labeling of Plant Virus and Insect Vector Proteins in Hemipteran Guts. J. Vis. Exp. (2021)The video demonstrates the preparation of gut tissue from a plant virus–infected insect vector for fluorescence imaging. Fixed guts were washed, permeabilized, and incubated with two fluorescent antibodies in a blocking solution—one targeting a viral antigen in vesicles, the other a vesicle-associated membrane protein. The tissue was counterstained for actin...

Immunostaining to Visualize Viral Antigen and Host Protein Colocalization in the Insect Gut

Descriviamo qui un semplice ibridazione in situ fluorescente (FISH) metodo per la localizzazione di virus e batteri nei tessuti insetti e vegetali. Questo protocollo può essere esteso per la visualizzazione di mRNA in tutto il monte e le sezioni microscopiche.

Fluorescenza<em&gt; In situ</em&gt; Ibridazioni (FISH) per la localizzazione di virus e batteri endosimbiontica a Plant e Insetti tessuti

Connessioni intercellulari di pianta, la Plasmodesmi (Pd), giocano un ruolo centrale nella pianta interazioni pianta-virus e di fisiologia. Critica ai trasporti Pd sono smistamento segnali che indirizzano proteine al Pd. Tuttavia, la nostra conoscenza di queste sequenze è ancora nella sua infanzia. Descriviamo una strategia per identificare i segnali di localizzazione di Pd in proteine Pd-mirati.

Identificazione di sequenze di localizzazione Plasmodesmal in proteine In Planta

Qui, vi presentiamo un protocollo per indagare la distribuzione host-tessuto, modalità di trasmissione, e l'effetto sulla forma fisica host di un densovirus all'interno di una specie di lepidotteri, il bollworm cotone. Questo protocollo può essere utilizzato anche per studiare l'interazione tra altri virus per via orale-trasmissibili e loro ospiti dell'insetto.

Protocolli per Indagare la distribuzione Host-tessuti, trasmissione-mode, e Effetto sul Fitness ospite di un Densovirus in cotone bollworm

Qui vi presentiamo un nuovo approccio per identificare virus vegetali con genomi di DNA double-strand. Usiamo metodi standard per estrarre RNA e DNA da foglie infette e svolgere il sequenziamento di nuova generazione. Strumenti bioinformatici assemblare sequenze in contigs, identificano contigs che rappresenta il genoma del virus e assegnano genomi a gruppi tassonomici.

Combinando l'analisi di DNA in un'estrazione di greggio virione con l'analisi del RNA dalle foglie infette per scoprire nuovi Virus genomi

Qui, presentiamo i protocolli per identificare gli immunomodulatori 1) virus-messo che promuovono la replica da arbovirus e fattori ospite 2) eucariotica che limitano la replica da arbovirus. Questi metodi basati su fluorescenza e luminescenza permettono ai ricercatori di ottenere rapidamente letture quantitative della replica da arbovirus nelle analisi semplicistiche con bassi rapporti segnale-rumore.

Infezioni da arbovirus come strumenti di Screening per l'identificazione di fattori virali immunomodulatori e Host antivirale

Qui, presentiamo un metodo di screening modificato che può essere ampiamente utilizzato per vagliare rapidamente i soppressori del silenziamento dell'RNA negli agenti patogeni delle piante.

Screening e identificazione dei soppressori del silenziamento dell'RNA da parte degli effetti segreti dei patogeni vegetali

Questo protocollo per la marcatura immunofluorescente sia delle proteine del virus vegetale che delle proteine degli insetti vettori nelle viscere degli insetti asportati può essere utilizzato per studiare le interazioni tra virus e insetti vettori, le funzioni delle proteine degli insetti e i meccanismi molecolari alla base della trasmissione del virus.

Marcatura immunofluorescente di virus vegetali e proteine di insetti vettori nell'intestino degli emitteri

Il presente protocollo descrive un metodo per raccogliere una quantità sufficiente di saliva dagli insetti che succhiano il piercing usando un mezzo artificiale. Questo è un metodo conveniente per raccogliere la saliva degli insetti e studiare la funzione salivare sul comportamento di alimentazione degli insetti e sulla trasmissione del virus trasmesso da vettori.

Metodo sandwich a membrana a due strati per la raccolta della saliva di Laodelphax striatellus

Descriviamo un metodo per raccogliere in modo efficiente l'emolinfa quantificabile da piccoli artropodi per analisi successive.

Un metodo preciso e quantificabile per raccogliere emolinfa da piccoli artropodi

Scopri come rilevare le proteine salivari delle cicaline e i virus nelle piante ospiti utilizzando Western blot e SDS-PAGE. Questo metodo stabile e replicabile aiuta a studiare le interazioni tra insetti e piante.

Rilevamento del virus e delle proteine salivari di un vettore cicalina nell'ospite della pianta

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