Cristallizzazione su chip e diffrazione seriale su larga scala a temperatura ambiente
11 marzo 2022
Questo contributo descrive come impostare la cristallizzazione delle proteine su dispositivi cristallo su cristallo e come eseguire la raccolta automatica di dati seriali a temperatura ambiente utilizzando la piattaforma di cristallizzazione su chip.
Questo protocollo dimostra la cristallizzazione delle proteine su un dispositivo simile a un chip nella raccolta dei dati di diffrazione a raggi X. Questo dispositivo è chiamato cristallo su cristallo perché i cristalli proteici crescono su un singolo cristallo di quarzo. Dopo aver raggiunto con successo la crescita dei cristalli proteici su tali dispositivi, migliaia di immagini di diffrazione vengono raccolte da ciascun dispositivo a temperatura ambiente senza nemmeno toccare i cristalli proteici.
La diffrazione dei raggi X a temperatura ambiente è molto essenziale per studiare la funzione delle proteine che coinvolgono molti stati conformazionali. Questi cambiamenti informativi della proteina o le azioni proteiche possono essere congelati, quindi non rilevabili nella criocristallografia. Questi dispositivi possono essere utilizzati per studiare i processi di segnalazione indotti dalla luce e i cambiamenti redox.
Solo una manciata di dispositivi fornisce set di dati completi e ridondanti. Per iniziare il preassemblaggio del dispositivo, etichettare l'anello esterno per l'identificazione del campione. Includi il nome del progetto, il numero del dispositivo, la condizione di cristallizzazione e la data come desiderato.
Quindi posizionare l'anello etichettato capovolto su una superficie pulita e posizionare un wafer di quarzo all'interno dell'anello esterno. Quindi, versare una piccola quantità di olio di immersione al microscopio in una piastra di Petri e immergere uno spessore nell'olio assicurandosi che entrambi i lati dello spessore siano ben rivestiti. Rimuovere l'olio in eccesso tamponando lo spessore su una superficie pulita.
Quindi posizionare lo spessore oliato sopra il primo wafer di quarzo. Mescolare la soluzione proteica e il tampone di cristallizzazione sul primo wafer di quarzo usando una pipetta. Cerca di evitare bolle d'aria durante la miscelazione.
Il volume totale della soluzione di cristallizzazione non deve superare la capacità massima della camera di cristallizzazione determinata dalla dimensione e dallo spessore dello spessore. Posizionare il secondo wafer di quarzo sulla soluzione miscelata. La soluzione si diffonderà spontaneamente.
Quindi picchiettare leggermente il secondo wafer di quarzo sul bordo per aiutare a diffondere l'olio mentre si spinge l'aria fuori. Fissare il dispositivo avvitando un anello di fissaggio nell'anello esterno. Se necessario, utilizzare uno strumento di serraggio.
Evitare un serraggio eccessivo in quanto potrebbe causare la deformazione o la rottura di delicati wafer di quarzo. Conservare i dispositivi assemblati in una scatola a temperatura ambiente o all'interno di un'incubatrice a temperatura controllata. Dopo alcune ore o giorni, posizionare il dispositivo di cristallizzazione al microscopio e monitorare la crescita dei cristalli.
Se necessario, ottimizzare le condizioni di cristallizzazione come descritto nel manoscritto. Per la calibrazione, installare un cristallo YAG sottile sul supporto del chip, quindi installare il beam stop. Quindi, aprire il software Insitux ed eseguire il programma indicato per acquisire immagini a fluorescenza a raggi X del fascio diretto in cui il dispositivo è un nome selezionato dall'utente per il dispositivo di cristallizzazione e il dispositivo.
param è il nome del file che contiene i parametri di controllo specifici del dispositivo. Quindi trova la posizione precisa del fascio di raggi X diretto eseguendo il programma di adattamento del profilo del fascio in cui l'immagine bruciata è il nome file dell'immagine a fluorescenza a raggi X. Per la scansione ottica, posizionare un dispositivo di cristallizzazione nel supporto del chip e fissare utilizzando una vite a testa zigrinata.
Quindi montare il supporto del chip sullo stadio di traslazione del diffrattometro attraverso un meccanismo cinematico. A seconda della sensibilità alla luce del campione proteico e dello scopo dell'esperimento, installare una sorgente luminosa bianca o infrarossa per acquisire micrografie dalla finestra ottica del dispositivo. Una volta che la configurazione è pronta, eseguire il programma di scansione inserendo il comando indicato per la scansione in movimento sulla linea del fascio.
Quindi eseguire il programma di affiancamento su un computer utente dove x è il valore iniziale per la colonna e y è il valore iniziale per gli spostamenti non autorizzati di micrografie. Il programma cuce tutte le micrografie in un montaggio da uno a tre micrometri di risoluzione pixel. Dopo aver cucito le micrografie, immettere il comando indicato per eseguire il programma di ricerca dei cristalli.
Questo programma esegue il riconoscimento dei cristalli e la pianificazione dello scatto e i parametri chiave in questo programma consentono la selezione specifica dei cristalli e la pianificazione del target. Rimuovere la sorgente luminosa e posizionare l'arresto del fascio. Quindi eseguire il programma di raccolta dati per la diffrazione seriale.
Il comando suggerito innesca la raccolta dei dati visitando gli scatti pianificati in una sequenza pre-programmata. Ogni cristallo mirato viene traslocato nella posizione del fascio. Ad ogni fermata, l'esposizione ai raggi X viene effettuata con o senza illuminazione laser con un ritardo programmato.
Nello studio, sono state confrontate le condizioni di cristallizzazione tra la diffusione del vapore e un lotto su chip. Qui vengono illustrati quattro casi di studio di cristallizzazione su chip e set di dati rappresentativi raccolti direttamente dai dispositivi al quarzo. Gli esperimenti di cristallografia dinamica hanno rivelato cambiamenti indotti dalla luce nella proteina dei fotorecettori rosso lontano confrontando i dati di 4.352 cristalli al buio e 8.287 cristalli dopo l'illuminazione della luce.
Il set di dati scuro dalla diffrazione seriale di Laue in situ ha portato a densità di elettroni meglio risolte, consentendo la costruzione di modelli sicuri di un cromoforo bilin in una conformazione di segno Z. Le mappe delle differenze indotte dalla luce hanno rivelato movimenti concertati nel foglio beta centrale che suggeriscono l'importanza dell'impilamento pi-pi tra gli anelli pirrolici del cromoforo e diversi residui aromatici. Questa piattaforma si chiama Insitux.
Il vantaggio unico di questa piattaforma è che non è necessario eseguire alcuna manipolazione dei cristalli una volta eseguita la cristallizzazione. È necessario raccogliere molti set di dati in condizioni mutevoli per catturare i movimenti delle proteine. E questo diventa possibile con Insitux perché consente la raccolta di dati su larga scala da migliaia di cristalli proteici a temperatura ambiente.
Con questa nuova capacità, compresa la cristallografia, i sistemi sensibili alla luce possono essere attivati all'interno del dispositivo e il sistema inerte alla luce può essere studiato se il dispositivo cristallo su cristallo viene convertito in flussi.
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Panoramica
Questo protocollo dimostra la cristallizzazione delle proteine su un dispositivo simile a un chip per la raccolta di dati di diffrazione a raggi X. Il dispositivo cristallo-su-cristallo permette la crescita di cristalli proteici su un singolo cristallo di quarzo, consentendo la raccolta automatizzata dei dati a temperatura ambiente.
Componenti principali dello studio
Area di scienza
- Cristallizzazione delle proteine
- Diffrazione a raggi X
- Raccolta automatizzata dei dati
Sfondo
- I cristalli proteici possono essere coltivati su dispositivi cristallo-su-cristallo.
- La diffrazione a raggi X a temperatura ambiente è cruciale per studiare le funzioni proteiche.
- Gli stati conformazionali delle proteine possono essere catturati senza la crio-cristallografia.
- Questo metodo può essere applicato per studiare i processi di segnalazione indotti dalla luce.
Scopo dello studio
- Configurare la cristallizzazione delle proteine su dispositivi simili a chip.
- Effettuare una raccolta seriale automatizzata dei dati a temperatura ambiente.
- Facilitare lo studio delle dinamiche e delle funzioni proteiche.
Metodi utilizzati
- Utilizzo di dispositivi cristallo-su-cristallo per la cristallizzazione.
- Raccolta automatizzata di migliaia di immagini di diffrazione.
- Tecniche di diffrazione a raggi X a temperatura ambiente.
- Analisi degli stati conformazionali delle proteine.
Risultati principali
- Crescita con successo di cristalli proteici sui dispositivi.
- Raccolta di estesi dati di diffrazione senza contatto fisico.
- Dimostrazione dell'efficacia degli studi a temperatura ambiente.
- Approfondimenti sulle azioni delle proteine e sui cambiamenti durante i processi di segnalazione.
Conclusioni
- Il dispositivo cristallo-su-cristallo è efficace per la cristallizzazione delle proteine.
- La diffrazione a raggi X a temperatura ambiente fornisce preziose informazioni.
- Questo metodo può migliorare la comprensione delle dinamiche proteiche.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Studying protein dynamics at physiological temperatures is critical for understanding functional mechanisms in drug discovery. This platform enables room-temperature X-ray diffraction without crystal manipulation, supporting the capture of conformational states relevant to target validation. It provides a scalable approach to generate high-quality structural data for mechanistic de-risking in early discovery.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of protein functional states under near-physiological conditions to support target hypothesis testing.
- Operational Value: Reduces need for cryogenic workflows, simplifying structural analysis of dynamic targets.
- Predictive Value: Facilitates observation of light-induced or redox-driven conformational changes relevant to signaling pathways.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces diffraction-quality crystals directly on chip, eliminating transfer steps that can compromise sample integrity.
- Operational Value: Allows hundreds to thousands of crystals to be screened in an automated, label-free manner.
- Assay Readiness: Generates standardized, diffraction-ready samples for high-throughput structural interrogation.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Supports structural follow-up of hits from phenotypic screens by providing atomic-level insights into mechanism of action.
- Mechanistic De-risking: Enables correlation of structural states with functional outputs in disease-relevant systems.
- Predictive Confidence: Improves target validation by revealing conformational ensembles that inform drug binding modes.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead optimization by providing structural data that informs mechanistic understanding without perturbing native-state dynamics.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven structural biology by enabling time-resolved or condition-specific data collection.
- Screening: Delivers diffraction data from native-state crystals grown in situ, enhancing reliability of structural readouts.
- Analytics: Provides electron density maps and difference maps that quantify structural changes upon perturbation.
- Translational Research: Connects structural observations to functional assays through correlated light- or redox-induced changes.
- Enterprise Reuse: Devices can be replicated across projects and conditions, serving as a structural screening platform.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Captures protein dynamics at room temperature, reducing risk of cryo-induced artifacts in structural interpretation.
- Operational Value: Eliminates crystal harvesting and mounting, increasing throughput and reducing sample loss.
- Strategic Value: Enables rapid iteration between functional and structural assays for iterative design cycles.
- Portfolio Impact: Improves confidence in target mechanism, supporting go/no-go decisions in lead optimization.
Implementation Considerations
- Requires expertise in protein crystallization, X-ray diffraction, and optical microscopy.
- Depends on access to synchrotron beamlines capable of serial Laue diffraction and fast detectors.
- Necessitates standardized crystallization conditions and device handling protocols across teams.
- Adaptation to different protein systems may require optimization of chamber dimensions and surface properties.
- Practical limitation: Data quality depends on crystal size and diffraction limit, which varies by target.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:59
Device Pre‐Assembly, Sample Loading, and Device Assembly
2:36
Device Storage, Crystallization Optimization, and Calibration
3:42
Optical Scanning
4:59
X‐Ray Diffraction
5:34
Results: On‐Chip Protein Crystallization Platform for Automated Serial Diffraction Collection
6:45
Conclusion
