Name: Cristallizzazione su chip e diffrazione seriale su larga scala a temperatura ambiente (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-11T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 42 s
Description: Impara la cristallizzazione su chip per la diffrazione seriale a temperatura ambiente. Questo metodo consente la raccolta automatica di migliaia di immagini di diffrazione da cristalli proteici senza manipolazione fisica, facilitando lo studio delle dinamiche e degli stati conformazionali delle proteine.

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L'uso di Advanced Photon Source, una struttura dell'Office of Science User gestita per il Dipartimento dell'Energia degli Stati Uniti dall'Argonne National Laboratory, è stato supportato dal contratto DE-AC02-06CH11357. L'uso di BioCARS è stato sostenuto dal National Institute of General Medical Sciences del National Institutes of Health con il numero di sovvenzione R24GM111072. Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresenta necessariamente il punto di vista ufficiale del National Institutes of Health. L'uso del settore LS-CAT 21 è stato sostenuto dalla Michigan Economic Development Corporation e dalla sovvenzione Michigan Technology Tri-Corridor 085P1000817. Questo lavoro è supportato da sovvenzioni dell'Università dell'Illinois a Chicago, National Institutes of Health (R01EY024363) e National Science Foundation (MCB 2017274) a XY.

1. Pre-assemblaggio del dispositivo
<ol><li>Etichettare l'anello esterno (diametro 30 mm) per l'identificazione del campione. Se necessario, includere il nome del progetto, il numero del dispositivo, la condizione di cristallizzazione e la data (Figura 1A). Posizionare l'anello esterno capovolto su una superficie pulita (Figura 1B) e posizionare con attenzione un wafer di quarzo all'interno dell'anello (Figura 1C). Questo primo wafer di quarzo funge da finestra d'ingresso per i raggi X incidenti.</li>
	<li>Versare una piccola quantità di olio da immersione al microscopio (viscosità di 150 cSt) in una capsula di Petri. Immergere uno spessore nell'olio e assicurarsi che entrambi i lati dello spessore siano adeguatamente oliati (Figura 1D). Rimuovere l'olio in eccesso tamponando lo spessore su una superficie pulita.</li>
	<li>Posizionare lo spessore oliato sopra il primo wafer di quarzo (Figura 1E). NOTA: L'olio ad immersione è un eccellente sigillante che protegge la camera di cristallizzazione da potenziali perdite di vapore. I trucioli correttamente assemblati di solito durano per settimane senza asciugatura visibile. Questa fase di pre-assemblaggio viene eseguita sotto la luce della stanza. Per i campioni sensibili alla luce, tutte le fasi successive, compreso il caricamento del campione, la conservazione del dispositivo e l'osservazione, devono essere eseguite sotto luce di sicurezza.</li>
</ol>2. Caricamento del campione e assemblaggio del dispositivo
<ol><li>Utilizzare una pipetta per miscelare accuratamente la soluzione proteica e il tampone di cristallizzazione sul primo wafer di quarzo. Il rapporto di volume tra il campione proteico e il tampone varia tipicamente da 2:1 a 1:2 (Figura 1F). Assicurarsi che il volume totale della soluzione di cristallizzazione non superi la capacità massima della camera di cristallizzazione determinata dalla dimensione e dallo spessore dello spessore. Evitare bolle d'aria durante la miscelazione. NOTA: la composizione di un buffer di cristallizzazione varia da un esperimento all'altro. Fare riferimento alla Tabella 1 per le condizioni di cristallizzazione.</li>
	<li>Posizionare il secondo wafer di quarzo sulla soluzione miscelata quando la soluzione inizia a diffondersi (Figura 1G). Questo secondo wafer di quarzo funge da finestra di uscita dei raggi X diffratti.</li>
	<li>Picchiettare leggermente il secondo wafer di quarzo sul bordo per aiutare a diffondere l'olio mentre si spinge fuori l'aria. Fissare il dispositivo avvitando un anello di fissaggio nell'anello esterno (Figura 1H). Se necessario, utilizzare uno strumento di serraggio (Figura 1I). Tieni presente che un serraggio eccessivo può causare la deformazione o addirittura la rottura di delicati wafer di quarzo.</li>
</ol>3. Ottimizzazione della conservazione e della cristallizzazione del dispositivo
<ol><li>Conservare i dispositivi assemblati (Figura 1J) in una scatola a temperatura ambiente o all'interno di un'incubatrice con controllo della temperatura. NOTA: I cristalli proteici possono comparire in poche ore o giorni dopo l'assemblaggio di un dispositivo di cristallizzazione. I risultati tipici della cristallizzazione su chip sono mostrati per diversi campioni proteici rappresentativi (Figura 2).</li>
	<li>Monitorare la crescita dei cristalli osservando il dispositivo di cristallizzazione al microscopio. Se necessario, ottimizzare le condizioni di cristallizzazione mediante iterazioni delle sezioni 1-3.</li>
</ol>4. Calibrazione
NOTA: i programmi e i comandi menzionati nelle sezioni seguenti vengono eseguiti nel software inSituX.
<ol><li>Installare un sottile cristallo di granato di ittrio alluminio drogato sul supporto del chip (Figura 3). Installare l'arresto del raggio. Acquisire immagini a fluorescenza a raggi X del fascio diretto eseguendo il programma: burnmark.py <device>.param dove <dispositivo> è un nome selezionato dall'utente per il dispositivo di cristallizzazione. <device>.param è un nome di file che contiene parametri di controllo specifici del dispositivo. I valori predefiniti verranno gradualmente sostituiti da valori specifici lungo il protocollo. Un file <device>.param di esempio è riportato nel file supplementare 1.</li>
	<li>Trova la posizione precisa del fascio radiogeno diretto eseguendo il programma di adattamento del profilo del fascio: beam.py <masterizza immagine> -d <dispositivo> dove <burn image> è il nome file dell'immagine a fluorescenza a raggi X (Figura 4). NOTA: Questo programma calcola le posizioni precise del fascio diretto e la dimensione del fascio. La posizione del fascio segna la destinazione di traslocazione per tutti i cristalli dallo stesso dispositivo. La dimensione del fascio viene utilizzata anche per la pianificazione del target.</li>
</ol>5. Scansione ottica
<ol><li>Posizionare un dispositivo di cristallizzazione nel supporto del chip e fissare il dispositivo utilizzando una vite a testa zigrinata (Figura 3A).</li>
	<li>Montare il supporto del chip sullo stadio di traslazione del diffrattometro attraverso un meccanismo cinematico (Figura 3B).</li>
	<li>Installare una fonte di luce adeguata per prendere micrografie dalla finestra ottica del dispositivo. La luce bianca, la luce IR o altra luce di scelta possono essere utilizzate a seconda della sensibilità alla luce del campione proteico e dello scopo dell'esperimento.</li>
	<li>Eseguire il programma di scansione: scan.py <device>.param Questo programma acquisisce una serie di micrografie che vengono automaticamente trasferite ai computer degli utenti specificati.</li>
	<li>Eseguire il programma di affiancamento su un computer utente: tile.py <device> -x <x> -y <y> dove < x > e <y> sono i valori iniziali per gli spostamenti di colonne e righe delle micrografie, rispettivamente. Questo programma unisce tutte le micrografie in un montaggio con risoluzione di 1-3 μm/pixel (Figura 5). NOTA: i passaggi 5.4 e 5.5 richiedono in genere alcuni minuti. Il numero totale di micrografie varia da diverse decine a centinaia a seconda dell'area di scansione e dell'ingrandimento.</li>
	<li>Eseguire il programma di ricerca dei cristalli: findX.py <montaggio> -c <lunghezza> <larghezza> -w <cuneo> -x <dimensione del fascio> dove <montaggio> è l'immagine affiancata. Questo programma esegue il riconoscimento dei cristalli e la pianificazione dello scatto. <lunghezza> e <larghezza> indicano la dimensione del cristallo da trovare. Se l'utente desidera evitare cristalli più piccoli, <width> può essere utilizzato come limite impostando un numero maggiore delle dimensioni dei cristalli piccoli indesiderati. <cuneo> è un valore angolare che imposta la tolleranza per i cristalli di forma irregolare. <dimensione del fascio> si riferisce alla dimensione della trave diretta ottenuta dal raccordo del profilo di cui sopra (fase 4.2; Figura 4). Inoltre, un valore nominale può essere impostato dagli utenti per distanziare ulteriormente i colpi mirati. Questi parametri chiave consentono la selezione specifica dei cristalli e la pianificazione del target (Figura 6).</li>
</ol>6. Diffrazione dei raggi X
<ol><li>Rimuovere la sorgente luminosa e installare l'arresto del fascio. Impostare una distanza del rilevatore appropriata. Seguire il protocollo di sicurezza della beamline per cercare la gabbia dei raggi X. Aprire l'otturatore a raggi X e l'otturatore laser, se applicabile.</li>
	<li>Eseguire il programma di raccolta dati per la diffrazione seriale: collect.py <device>.param -l <durata della luce> Questo comando attiva la raccolta dei dati in cui tutti gli scatti pianificati vengono visitati uno dopo l'altro secondo una sequenza preprogrammata. Ogni cristallo mirato viene traslocato nella posizione del fascio (fase 4.2). Ad ogni fermata, l'esposizione ai raggi X viene effettuata con o senza illuminazione laser con un ritardo programmato. Il filmato 1 mostra una sequenza di raccolta dati automatizzata operata a una frequenza di 1 Hz. Di routine decine o centinaia di immagini di diffrazione vengono raccolte da un singolo dispositivo di cristallizzazione (Filmato 2). NOTA: la calibrazione della sezione 4 e la scansione ottica della sezione 5 sono autonome nella piattaforma inSituX, quindi completamente trasferibili su un'altra linea di luce. Sezione 6 La diffrazione dei raggi X deve comportare alcuni dettagli nel funzionamento della beamline.</li>
</ol>

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</ol>

ZR è l'inventore dei chip cristallo su cristallo sul brevetto statunitense 9632042 concesso a Renz Research, Inc.

La cristallografia delle proteine nei primi anni condotta a temperatura ambiente ha incontrato enormi difficoltà nel combattere i danni da radiazioni a raggi X. Pertanto, è stato sostituito dal metodo criocristallografico più robusto poiché le sorgenti di raggi X di sincrotrone sono diventate prontamente disponibili20. Con l'avvento dei laser a elettroni liberi a raggi X, la cristallografia proteica a temperatura ambiente è stata rianimata negli ultimi anni, con molti nuovi sviluppi guidati dal de...

A causa degli effetti ionizzanti delle radiazioni a raggi X, la cristallografia delle proteine, in larga misura, è stata limitata alle condizioni criogeniche negli ultimi tre decenni. Pertanto, l'attuale conoscenza dei movimenti delle proteine durante la sua funzione deriva in gran parte da confronti tra strutture statiche osservate in diversi stati in condizioni criogeniche. Tuttavia, le temperature criogeniche ostacolano inevitabilmente la progressione di una reazione biochimica o l'interconversione tra diversi stati conformazionali mentre le molecole proteiche sono al lavoro. Per osservare direttamente la dinamica strutturale delle proteine a risoluzione atomica mediante cristallografia, sono necessari metodi robusti e di routine per condurre esperimenti di diffrazione a temperatura ambiente, il che richiede innovazioni tecniche nella consegna del campione, nella raccolta dei dati e nell'analisi dei dati posteriori. A tal fine, i recenti progressi nella cristallografia seriale hanno offerto nuove strade per catturare le immagini molecolari di specie strutturali intermedie e di breve durata a temperatura ambiente 1,2,3. In contrasto con la strategia "one-crystal-one-dataset" ampiamente utilizzata nella criocristallografia convenzionale, la cristallografia seriale adotta una strategia di raccolta dati simile a quella della crio-microscopia elettronica a singola particella. In particolare, i dati sperimentali in cristallografia seriale vengono raccolti in piccole frazioni da un gran numero di singoli campioni, seguiti da un'elaborazione intensiva dei dati in cui le frazioni di dati vengono valutate e combinate in un set di dati completo per la determinazione della struttura 3D4. Questa strategia "one-crystal-one-shot" allevia efficacemente il danno da radiazioni a raggi X ai cristalli proteici a temperatura ambiente attraverso una strategia di diffrazione prima della distruzione5.
Poiché la cristallografia seriale richiede un gran numero di cristalli proteici per completare un set di dati, pone importanti sfide tecniche per molti sistemi biologici in cui i campioni proteici sono limitati e / o è coinvolta una delicata manipolazione dei cristalli. Un'altra considerazione importante è come preservare al meglio l'integrità dei cristalli negli esperimenti di diffrazione seriale. I metodi di diffrazione in situ affrontano queste preoccupazioni consentendo ai cristalli proteici di diffrattarsi direttamente da dove crescono senza rompere il sigillo della camera di cristallizzazione 6,7,8,9. Questi metodi senza manipolazione sono naturalmente compatibili con la diffrazione seriale su larga scala. Abbiamo recentemente riportato la progettazione e l'implementazione di un dispositivo di cristallizzazione per la diffrazione in situ basato su un concetto di cristallo su cristallo - cristalli proteici cresciuti direttamente su quarzo monocristallino11. Questo dispositivo "cristallo su cristallo" offre diversi vantaggi. In primo luogo, è dotato di una finestra trasparente a raggi X e luce fatta di un substrato di quarzo monocristallino, che produce poca dispersione dello sfondo, risultando quindi in eccellenti rapporti segnale-rumore nelle immagini di diffrazione da cristalli proteici. In secondo luogo, il quarzo monocristallino è un'eccellente barriera al vapore equivalente al vetro, fornendo così un ambiente stabile per la cristallizzazione delle proteine. Al contrario, altri dispositivi di cristallizzazione che utilizzano substrati a base di polimeri sono soggetti ad essiccazione a causa della permeabilità al vapore, a meno che il materiale polimerico non abbia uno spessore sostanziale, che di conseguenza contribuisce a un'elevata dispersione di fondo10. In terzo luogo, questo dispositivo consente la consegna di un gran numero di cristalli proteici al fascio di raggi X senza alcuna forma di manipolazione o raccolta dei cristalli, che è fondamentale per preservare l'integrità dei cristalli11.
Per semplificare gli esperimenti seriali di diffrazione dei raggi X utilizzando i dispositivi cristallo su cristallo, abbiamo sviluppato un prototipo di diffrattometro per facilitare il passaggio tra la scansione ottica e le modalità di diffrazione dei raggi X12. Questo diffrattometro ha un ingombro ridotto ed è stato utilizzato per la raccolta di dati seriali su due linee di luce dell'Advanced Photon Source (APS) presso l'Argonne National Laboratory. In particolare, abbiamo utilizzato BioCARS 14-ID-B per la diffrazione di Laue e LS-CAT 21-ID-D per l'oscillazione monocromatica. Questo hardware diffrattometrico non è necessario se una linea di fascio laser a raggi X o a raggi X a elettroni liberi è dotata di due funzionalità chiave: (1) posizionamento motorizzato del campione con un raggio di corsa di ±12 mm attorno al fascio di raggi X in tutte le direzioni; e (2) una fotocamera digitale in asse per la visualizzazione dei cristalli sotto l'illuminazione della luce che è sicura per i cristalli proteici in studio. Il dispositivo al quarzo monocristallino insieme a un diffrattometro portatile e al software di controllo per la scansione ottica, il riconoscimento dei cristalli e la raccolta automatica dei dati in situ costituiscono collettivamente la piattaforma inSituX per la cristallografia seriale. Sebbene questo sviluppo sia principalmente motivato dalle sue applicazioni di cristallografia dinamica che utilizzano una sorgente di raggi X policromatica, abbiamo dimostrato il potenziale di questa tecnologia per supportare i metodi di oscillazione monocromatica10,12. Con l'automazione, questa piattaforma offre un metodo di raccolta dati seriale ad alta produttività a temperatura ambiente con un consumo di proteine accessibile.
In questo contributo, descriviamo in dettaglio come impostare la cristallizzazione su chip in un laboratorio umido e come eseguire la raccolta seriale di dati a raggi X su una linea di fascio di sincrotrone utilizzando la piattaforma inSituX.
Il metodo batch viene utilizzato per impostare la cristallizzazione su chip in una condizione simile a quella del metodo di diffusione del vapore ottenuto per lo stesso campione proteico (Tabella 1). Come punto di partenza, si consiglia di utilizzare il precipitante a una concentrazione di 1,2-1,5x di quello per il metodo di diffusione del vapore. Se necessario, la condizione di cristallizzazione del lotto può essere ulteriormente ottimizzata tramite uno screening a griglia fine. I wafer di quarzo non sono necessari per le prove di ottimizzazione; Al suo posto possono essere utilizzati vetrini di copertura (vedi sotto). Si consiglia di eseguire dispositivi di cristallizzazione parzialmente caricati per mantenere le prove di ottimizzazione su scala ridotta. Un certo numero di campioni di proteine sono stati cristallizzati con successo su tali dispositivi utilizzando il metodo batch10 (Tabella 1).
Il dispositivo stesso è costituito dalle seguenti parti: 1) un anello esterno; 2) due wafer di quarzo; 3) uno spessore simile a una rondella di plastica o acciaio inossidabile; 4) un anello di fissaggio; 5) olio ad immersione per microscopio come sigillante (Figura 1). Il volume totale della soluzione di cristallizzazione caricata su un chip dipende dallo scopo dell'esperimento. La capacità della camera di cristallizzazione può essere regolata scegliendo uno spessore di diverso spessore e/o diametro interno. Installiamo regolarmente dispositivi di cristallizzazione di capacità di 10-20 μL utilizzando spessori di 50-100 μm di spessore. Un dispositivo tipico può produrre da decine a migliaia di cristalli proteici adeguati per la raccolta seriale dei dati (Figura 2).
In caso di successo, la cristallizzazione su chip produrrà da decine a centinaia o addirittura migliaia di cristalli proteici su ciascun dispositivo al quarzo pronti per la diffrazione a raggi X. A una linea di fascio di sincrotrone, tale dispositivo è montato su uno stadio di traslazione a tre assi del diffrattometro utilizzando un meccanismo cinematico. La finestra di cristallizzazione di un dispositivo montato viene scansionata otticamente e ripresa in decine o centinaia di micrografie. Queste micrografie vengono poi cucite in un montaggio ad alta risoluzione. Per i cristalli fotosensibili, la scansione ottica può essere eseguita sotto luce infrarossa (IR) per evitare fotoattivazione involontaria. È stato sviluppato un software di visione artificiale per identificare e localizzare cristalli proteici distribuiti casualmente sul dispositivo. Questi cristalli vengono quindi classificati in base alle loro dimensioni, forma e posizione per informare o guidare la strategia di raccolta dei dati nella cristallografia seriale. Ad esempio, colpi singoli o multipli possono essere posizionati su ciascun cristallo mirato. Gli utenti potrebbero pianificare un singolo passaggio o più percorsi attraverso cristalli mirati. Abbiamo implementato un software per calcolare vari percorsi di viaggio. Ad esempio, il percorso più breve viene calcolato utilizzando algoritmi che risolvono il problema del commesso viaggiatore13. Per applicazioni cristallografiche dinamiche pompa-sonda, è possibile scegliere la tempistica e la durata delle riprese laser (pompa) e a raggi X (sonda). Una raccolta automatica di dati seriali è programmata per traslocare ogni cristallo mirato nel fascio di raggi X uno dopo l'altro.
I componenti chiave del diffrattometro insituX includono: 1) un supporto per dispositivo; 2) una fase di traslazione a tre assi; 3) una sorgente luminosa per la scansione ottica; 4) un arresto del fascio di raggi X; 5) pompare laser se vengono studiate proteine sensibili alla luce; 6) Microcomputer Raspberry Pi dotato di una fotocamera sensibile agli infrarossi; 7) software di controllo per sincronizzare motori, telecamera, sorgenti luminose, laser a pompa, e per interfacciarsi con i controlli beamline.

<table><tbody><tr><td>Software di analisi</td><td>Sviluppato</td><td></td><td></td>internamente</tr><tr><td>Granato di ittrio e alluminio drogato con cerio</td><td>Forniture MSE Substrati</td><td></td><td>monocristallini Ce:Y3Al5O12, YAG</td></tr><tr><td>Portachip Sviluppato</td><td></td><td></td><td>internamente</td></tr><tr><td>Software di controllo</td><td>Olio da immersione sviluppato</td><td></td><td></td>internamente</tr><tr><td></td><td>Cargille Laboratories</td><td>16482</td><td>Tipo A basso viscosità 150 cSt</td></tr><tr><td>piattaforma inSituX</td> Sorgente di luce IR sviluppata <td></td><td></td><td>internamente</td></tr><tr><td></td><td>Thorlabs Incorporated</td><td>LED1085L</td><td>LED con lente in vetro, 1085 nm, 5 mW, microscopio TO-18</td></tr><tr><td>Zeiss</td><td></td><td></td><td>SteREO Discovery V8</td></tr><tr><td>Anello esterno Piastra di</td> Petri <td>sviluppata</td><td></td><td></td>internamente</tr><tr><td></td><td>Fisher Scietific</td><td>FB0875713</td><td></td></tr><tr><td>Pipetta</td><td>Pipetman</td><td>F167380</td><td>P10</td></tr><tr><td>Pompa laser</td><td>Thorlabs Incorporated</td><td>LD785-SE400</td><td>785 nm, 400 mW, &Oslash; 9 mm, codice pin E, diodo laser</td></tr><tr><td>Raspberry Pi</td><td>Raspberry Pi Anello</td> di ritenzione per <td></td><td></td>fondazione</tr><tr><td></td><td>Thorlabs Incorporated</td><td>SM1RR</td><td>SM1 Anello di ritenzione per &Oslash; 1" tubi per lenti e supporti</td></tr><tr><td>in cristallo di quarzo senza semi</td><td>University Wafers, Inc.</td><td>U01-W2-L-190514</td><td>25,4 mm di diametro Z-cut 0,05 mm di spessore doppia lucidatura laterale 8 mm su -X</td></tr><tr><td>Shim</td> Arresto <td></td> del fascio di raggi X sviluppato <td></td><td></td>internamente</tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

cristallizzazione su chip e diffrazione seriale su larga scala a temperatura ambiente

On-Chip Crystallization and Large-Scale Serial Diffraction at Room Temperature

Le reazioni biochimiche e i processi biologici possono essere meglio compresi dimostrando come le proteine passano tra i loro stati funzionali. Poiché le temperature criogeniche non sono fisiologiche e possono prevenire, scoraggiare o addirittura alterare la dinamica strutturale delle proteine, è altamente auspicabile un metodo robusto per esperimenti di diffrazione a raggi X di routine a temperatura ambiente. Il dispositivo cristallo su cristallo e l'hardware e il software di accompagnamento utilizzati in questo protocollo sono progettati per consentire la diffrazione a raggi X in situ a temperatura ambiente per cristalli proteici di diverse dimensioni senza alcuna manipolazione del campione. Qui presentiamo i protocolli per i passaggi chiave dall'assemblaggio del dispositivo, alla cristallizzazione su chip, alla scansione ottica, al riconoscimento dei cristalli, alla pianificazione dei colpi a raggi X e alla raccolta automatica dei dati. Poiché questa piattaforma non richiede la raccolta di cristalli né altre manipolazioni del campione, centinaia di migliaia di cristalli proteici cresciuti su chip possono essere introdotti in un fascio di raggi X in modo programmabile e ad alto rendimento.

Negli ultimi anni sono stati pubblicati diversi set di dati rappresentativi 10,12 insieme ai risultati cristallografici e ai risultati scientifici di una vasta gamma di campioni proteici, tra cui proteine ed enzimi fotorecettoriali, ad esempio, un fotorecettore UV-B UVR8, una fotoliasi di riparazione del DNA guidata dalla luce PhrB10, una nuova proteina sensibile alla luce rossa da una istidina chinasi sensoriale multidominio 14<sup class=...

Questo contributo descrive come impostare la cristallizzazione delle proteine su dispositivi cristallo su cristallo e come eseguire la raccolta automatica di dati seriali a temperatura ambiente utilizzando la piattaforma di cristallizzazione su chip.

Cristallizzazione su chip e diffrazione seriale su larga scala a temperatura ambiente

Biochemical reactions and biological processes can be best understood by demonstrating how proteins transition among their functional states. Since ...

Questo protocollo dimostra la cristallizzazione delle proteine su un dispositivo simile a un chip nella raccolta dei dati di diffrazione a raggi X. Questo dispositivo è chiamato cristallo su cristallo perché i cristalli proteici crescono su un singolo cristallo di quarzo. Dopo aver raggiunto con successo la crescita dei cristalli proteici su tali dispositivi, migliaia di immagini di diffrazione vengono raccolte da ciascun dispositivo a temperatura ambiente senza nemmeno toccare i cristalli proteici.La diffrazione dei raggi X a temperatura ambiente è molto essenziale per studiare la funzione delle proteine che coinvolgono molti stati conformazionali. Questi cambiamenti informativi della proteina o le azioni proteiche possono essere congelati, quindi non rilevabili nella criocristallografia. Questi dispositivi possono essere utilizzati per studiare i processi di segnalazione indotti dalla luce e i cambiamenti redox.Solo una manciata di dispositivi fornisce set di dati completi e ridondanti. Per iniziare il preassemblaggio del dispositivo, etichettare l'anello esterno per l'identificazione del campione. Includi il nome del progetto, il numero del dispositivo, la condizione di cristallizzazione e la data come desiderato.Quindi posizionare l'anello etichettato capovolto su una superficie pulita e posizionare un wafer di quarzo all'interno dell'anello esterno. Quindi, versare una piccola quantità di olio di immersione al microscopio in una piastra di Petri e immergere uno spessore nell'olio assicurandosi che entrambi i lati dello spessore siano ben rivestiti. Rimuovere l'olio in eccesso tamponando lo spessore su una superficie pulita.Quindi posizionare lo spessore oliato sopra il primo wafer di quarzo. Mescolare la soluzione proteica e il tampone di cristallizzazione sul primo wafer di quarzo usando una pipetta. Cerca di evitare bolle d'aria durante la miscelazione.Il volume totale della soluzione di cristallizzazione non deve superare la capacità massima della camera di cristallizzazione determinata dalla dimensione e dallo spessore dello spessore. Posizionare il secondo wafer di quarzo sulla soluzione miscelata. La soluzione si diffonderà spontaneamente.Quindi picchiettare leggermente il secondo wafer di quarzo sul bordo per aiutare a diffondere l'olio mentre si spinge l'aria fuori. Fissare il dispositivo avvitando un anello di fissaggio nell'anello esterno. Se necessario, utilizzare uno strumento di serraggio.Evitare un serraggio eccessivo in quanto potrebbe causare la deformazione o la rottura di delicati wafer di quarzo. Conservare i dispositivi assemblati in una scatola a temperatura ambiente o all'interno di un'incubatrice a temperatura controllata. Dopo alcune ore o giorni, posizionare il dispositivo di cristallizzazione al microscopio e monitorare la crescita dei cristalli.Se necessario, ottimizzare le condizioni di cristallizzazione come descritto nel manoscritto. Per la calibrazione, installare un cristallo YAG sottile sul supporto del chip, quindi installare il beam stop. Quindi, aprire il software Insitux ed eseguire il programma indicato per acquisire immagini a fluorescenza a raggi X del fascio diretto in cui il dispositivo è un nome selezionato dall'utente per il dispositivo di cristallizzazione e il dispositivo.param è il nome del file che contiene i parametri di controllo specifici del dispositivo. Quindi trova la posizione precisa del fascio di raggi X diretto eseguendo il programma di adattamento del profilo del fascio in cui l'immagine bruciata è il nome file dell'immagine a fluorescenza a raggi X. Per la scansione ottica, posizionare un dispositivo di cristallizzazione nel supporto del chip e fissare utilizzando una vite a testa zigrinata.Quindi montare il supporto del chip sullo stadio di traslazione del diffrattometro attraverso un meccanismo cinematico. A seconda della sensibilità alla luce del campione proteico e dello scopo dell'esperimento, installare una sorgente luminosa bianca o infrarossa per acquisire micrografie dalla finestra ottica del dispositivo. Una volta che la configurazione è pronta, eseguire il programma di scansione inserendo il comando indicato per la scansione in movimento sulla linea del fascio.Quindi eseguire il programma di affiancamento su un computer utente dove x è il valore iniziale per la colonna e y è il valore iniziale per gli spostamenti non autorizzati di micrografie. Il programma cuce tutte le micrografie in un montaggio da uno a tre micrometri di risoluzione pixel. Dopo aver cucito le micrografie, immettere il comando indicato per eseguire il programma di ricerca dei cristalli.Questo programma esegue il riconoscimento dei cristalli e la pianificazione dello scatto e i parametri chiave in questo programma consentono la selezione specifica dei cristalli e la pianificazione del target. Rimuovere la sorgente luminosa e posizionare l'arresto del fascio. Quindi eseguire il programma di raccolta dati per la diffrazione seriale.Il comando suggerito innesca la raccolta dei dati visitando gli scatti pianificati in una sequenza pre-programmata. Ogni cristallo mirato viene traslocato nella posizione del fascio. Ad ogni fermata, l'esposizione ai raggi X viene effettuata con o senza illuminazione laser con un ritardo programmato.Nello studio, sono state confrontate le condizioni di cristallizzazione tra la diffusione del vapore e un lotto su chip. Qui vengono illustrati quattro casi di studio di cristallizzazione su chip e set di dati rappresentativi raccolti direttamente dai dispositivi al quarzo. Gli esperimenti di cristallografia dinamica hanno rivelato cambiamenti indotti dalla luce nella proteina dei fotorecettori rosso lontano confrontando i dati di 4.352 cristalli al buio e 8.287 cristalli dopo l'illuminazione della luce.Il set di dati scuro dalla diffrazione seriale di Laue in situ ha portato a densità di elettroni meglio risolte, consentendo la costruzione di modelli sicuri di un cromoforo bilin in una conformazione di segno Z. Le mappe delle differenze indotte dalla luce hanno rivelato movimenti concertati nel foglio beta centrale che suggeriscono l'importanza dell'impilamento pi-pi tra gli anelli pirrolici del cromoforo e diversi residui aromatici. Questa piattaforma si chiama Insitux.Il vantaggio unico di questa piattaforma è che non è necessario eseguire alcuna manipolazione dei cristalli una volta eseguita la cristallizzazione. È necessario raccogliere molti set di dati in condizioni mutevoli per catturare i movimenti delle proteine. E questo diventa possibile con Insitux perché consente la raccolta di dati su larga scala da migliaia di cristalli proteici a temperatura ambiente.Con questa nuova capacità, compresa la cristallografia, i sistemi sensibili alla luce possono essere attivati all'interno del dispositivo e il sistema inerte alla luce può essere studiato se il dispositivo cristallo su cristallo viene convertito in flussi.

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JoVE Journal

Biochemistry

Biochimica

Questo protocollo descrive dettagliatamente come fabbricare e gestire dispositivi microfluidici per la raccolta di dati di diffrazione di raggi x a temperatura ambiente. Inoltre, viene descritto come monitorare la cristallizzazione della proteina di dispersione della luce dinamica e come elaborare e analizzare dati di diffrazione ottenuti.

Chip microfluidici per dispersione della luce dinamica In Situ diffrazione di raggi x di cristallo ed In Situ per la cristallografia seriale

Questo documento descrive in dettaglio il protocollo di fabbricazione dei chip microfluidici sviluppati per la cristallizzazione delle proteine su chip con il metodo della dialisi e gli esperimenti di diffrazione a raggi X in situ. Il processo di microfabbricazione consente di integrare una membrana semipermeabile di dialisi della cellulosa rigenerata con qualsiasi taglio di peso molecolare, tra due strati del chip.

Cristallizzazione delle proteine su chip mediante microdialisi per studi di diffrazione a raggi X in situ

Viene descritto un dispositivo microfluidico versatile che consente la cristallizzazione di un enzima utilizzando il metodo di contro-diffusione, l'introduzione di un substrato nei cristalli mediante ammollo e la determinazione della struttura 3D del complesso enzima:substrato mediante un'analisi seriale dei cristalli all'interno del chip a temperatura ambiente.

Cristallizzazione e determinazione strutturale di un enzima:complesso di substrati mediante cristallografia seriale in un chip microfluidico versatile

Presentiamo un protocollo per la cristallizzazione delle proteine utilizzando l'impianto di cristallizzazione nel complesso di ricerca di Harwell e la successiva raccolta di dati cristallografici a raggi X in situ dai cristalli all'interno delle piastre presso la linea di luce della cristallografia macromolecolare versatile in situ (VMXi) di Diamond. Descriviamo i requisiti dei campioni, i protocolli di cristallizzazione e le linee guida per la raccolta dei dati.

Cristallizzazione e raccolta dati a temperatura ambiente in situ utilizzando l'impianto di cristallizzazione di Harwell e Beamline VMXi, sorgente luminosa diamantata

Descriviamo le procedure per la preparazione e la consegna di microcristalli proteici di membrana in fase cubica lipidica per la cristallografia seriale su laser a elettroni liberi a raggi X e sorgenti di sincrotrone. Questi protocolli possono essere applicati anche per l'incorporazione e la somministrazione di microcristalli proteici solubili, con conseguente riduzione sostanziale del consumo di campione rispetto all'iniezione di liquidi.

Preparazione e consegna di microcristalli proteina nella fase cubica lipidica per Serial femtosecondi Cristallografia

Sistemi automatizzati e protocolli per la preparazione sistematica di un gran numero di schermi e goccioline di cristallizzazione nanolitro per gli esperimenti di diffusione del vapore sono descritti e discussi.

Automatizzato di protocolli per cristallizzazione macromolecolare al MRC Laboratorio di biologia molecolare

Viene presentato un protocollo per la cristallografia a raggi X utilizzando microcristalli di proteine. Sono stati confrontati due esempi che analizzano microcristalli in vivo dopo la purificazione o in cellulo .

Microcristallografia dei cristalli proteici e<em&gt; In Cellulo</em&gt; Diffrazione

Questo protocollo descrive un metodo per la coltivazione su larga scala di Caenorhabditis elegans su terreni solidi. Come alternativa alla coltura liquida, questo protocollo permette di ottenere parametri di diverse scale sotto la piastra-base di coltivazione. Questo aumenta la comparabilità dei risultati omettendo le differenze morfologiche e metaboliche tra cultura mediatica di liquidi e solidi.

Piastra-base di coltivazione su larga scala di Caenorhabditis elegans: preparazione del campione per la studio di alterazioni metaboliche nel diabete

Spettroscopia di risonanza paramagnetica elettronica (EPR) è un metodo univoco per misurare i radicali liberi. L'utilizzo di sonde di spin selettiva permette per la rilevazione dei radicali liberi in diversi compartimenti cellulari. Presentiamo un metodo pratico, efficiente per raccogliere campioni biologici che facilitano il trattamento, l'archiviazione e trasferire campioni per misure di EPR.

Uso di risonanza paramagnetica elettronica in campioni biologici a temperatura ambiente e 77 K

Qui, presentiamo un protocollo per produrre grandi quantità di RNA ricombinante in Escherichia coli co-esprimendo un RNA chimerico che contiene il RNA di interesse in un'impalcatura viroid e una pianta ligasi di tRNA. Il prodotto principale è una molecola circolare che facilita la purificazione di omogeneità.

Produzione su larga scala di RNA ricombinante su un'impalcatura circolare utilizzando un sistema derivato Viroid in Escherichia coli

Impara la cristallizzazione su chip per la diffrazione seriale a temperatura ambiente. Questo metodo consente la raccolta automatica di migliaia di immagini di diffrazione da cristalli proteici senza manipolazione fisica, facilitando lo studio delle dinamiche e degli stati conformazionali delle proteine.

Cristallizzazione su chip e diffrazione seriale su larga scala a temperatura ambiente

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