Generazione di transgenici e knockout in specie di Strongyloides mediante microiniezione

L'uso della microiniezione per fornire costrutti di DNA in Strongyloides ci consente di generare knockout e transgenici, che possono essere utilizzati per studiare come questi vermi si sviluppano, navigare nel loro ambiente e parassitare gli ospiti. Finora, questa è l'unica tecnica di successo per generare knockout e transgenici in questi parassiti. Un giorno prima della microiniezione, aggiungere 180 microlitri della soluzione di agarosio su un coperchio di copertura usando una pipetta pasteur di vetro, quindi far cadere immediatamente un secondo coperchio per appiattire l'agarosio in un tampone sottile.

Dopo 5-10 secondi, rimuovere lo slittamento del coperchio superiore facendo scorrere i due e determinare su quale scivolo si trova il cuscinetto di agar e appoggiarlo a faccia in su. Quindi, selezionare un piccolo pezzo di frammento di vetro da uno slip di copertura rotto e, usando una pinza, premerlo delicatamente nell'agar vicino al bordo superiore del pad. Il giorno della microiniezione, fodera il supporto Baermann, che è un setaccio costituito da due anelli di plastica con due strati di rete tuile in nylon fissati tra loro con tre pezzi sovrapposti di tessuto da laboratorio.

Quindi aggiungere la miscela fecale-carbone al supporto Baermann. Quindi posizionare il supporto Baermann con la miscela fecale-carbone nell'imbuto, piegare i pezzi di tessuto attorno alla miscela fecale-carbone e aggiungere abbastanza acqua per immergere la maggior parte del carbone fecale. Quindi, coprire l'imbuto con un coperchio di plastica di Petri da 15 centimetri per contenere l'odore ed etichettare l'imbuto secondo necessità.

Dopo una o due ore, tenere un tubo centrifugo da 50 millilitri sotto il tubo di gomma sul fondo dell'imbuto e aprire con attenzione i morsetti sul fondo per erogare da 30 a 40 millilitri di acqua contenente vermi nel tubo da 50 millilitri. Allora. trasferire 15 millilitri dell'acqua Baermann contenente i vermi in un tubo centrifugo da 15 millilitri. Ruotare il tubo, rimuovere fino a 13 millilitri del surnatante e gettarlo in un contenitore di rifiuti liquidi con iodio per uccidere eventuali vermi.

Dopo aver raccolto tutti i vermi, ispezionare il pellet di vermi sul fondo del tubo. Se non sono visibili vermi, attendere una o due ore, quindi raccogliere più vermi dall'apparato di Baermann. Trasferire i vermi in meno acqua possibile in una piastra media di crescita del nematode al 2% di sei centimetri con un prato di E.coli HB101 e utilizzare questa piastra come piastra di origine per la microiniezione.

Sotto il microscopio di dissezione, coprire il frammento di vetro sul coperchio del pad di microiniezione con olio di alocarbonio utilizzando un plettro a vite senza fine in platino standard. Quindi, posizionare il coperchio del cuscinetto di microiniezione sul telescopio di microiniezione e individuare il frammento di vetro coperto di olio. Allineare il frammento di vetro in modo tale che un bordo sia perpendicolare alla direzione dell'ago per fungere da superficie utilizzata per rompere l'ago.

Successivamente, utilizzando un microscopio sezionante, assicurarsi che l'ago non abbia bolle o detriti nell'albero affusolato, quindi fissare l'ago da 1 a 1,5 centimetri nel supporto pressurizzato. Posizionare la punta dell'ago al centro del campo visivo del microscopio ad occhio e, sotto basso ingrandimento, posizionare la punta dell'ago nel campo visivo perpendicolare al lato del frammento di vetro. Quindi, passare a un ingrandimento più elevato e allineare la punta dell'ago con il bordo del vetro, vicino, ma senza toccarlo.

Successivamente, per rompere la punta dell'ago e consentire il flusso del liquido, picchiettare delicatamente l'ago sul lato del pezzo di vetro mentre si applica una pressione continua dal gas. Una volta che il liquido inizia a fluire, controllare la forma della punta e assicurarsi che sia affilata con liquido che scorre facilmente. Quando il liquido scorre bene dall'ago, spostare il vetrino di microiniezione nell'ambito di dissezione e aggiungere uno o due microlitri di olio di alocarburi sul cuscinetto di agar per il posizionamento dei vermi.

Trasferire da 20 a 30 giovani adulti Strongyloides in una piastra media di crescita al 2% di nematodi senza batteri per almeno cinque minuti per rimuovere i batteri superficiali in eccesso e selezionare singoli vermi per la microiniezione. Aggiungere più vermi alla piastra secondo necessità durante l'iniezione. Usando una piccola quantità di olio di alocarburi su un verme, seleziona una giovane femmina adulta strongyloides con una o quattro uova nella sua gonade dal piatto senza batteri e trasferisci il verme in una piccola goccia di olio sul cuscinetto di agar.

Usando il worm pick, posiziona delicatamente il worm in modo che non sia arrotolato e la gonade sia visibile e di facile accesso. Quindi, posizionare il verme nel campo visivo del microscopio a microiniezione, assicurandosi che la gonade si trovi sullo stesso lato dell'ago e posizionata in modo che l'ago entri in contatto con la gonade con una leggera angolazione. Quindi, portare la punta dell'ago sul lato del verme nello stesso piano focale.

Quindi, mirando al braccio della gonade vicino al centro del verme, inserire delicatamente l'ago nella gonade usando un microiniettore. Applicare immediatamente una pressione sull'ago per riempire delicatamente l'intero braccio gondico con la soluzione di DNA. Dopo aver iniettato abbastanza liquido, rimuovere l'ago e osservare che la ferita si chiude.

Ripetere la procedura con l'altro braccio della gonade, se è visibile. Una volta completata l'iniezione, verificare rapidamente che l'ago non sia intasato applicando una pressione con la punta dell'ago sul tampone di agar, quindi trasferire il vetrino con il verme iniettato al microscopio di dissezione. Per recuperare il verme iniettato, prima posizionare alcune gocce di soluzione salina tamponata dal verme sul verme per farlo galleggiare dal cuscinetto dell'agar.

Quindi raccogliere una piccola quantità di batteri su un worm pick e toccare il worm con i batteri aderenti per rimuoverlo dal liquido. Trasferire delicatamente il verme sulla piastra di recupero. Per gli esperimenti comportamentali, trasferire da 20 a 30 larve in una piastra media di crescita del nematode al 2% con uno spesso prato batterico HB101 e, sotto un microscopio di sezionamento a fluorescenza, identificare le larve che esprimono il transgene di interesse.

Quindi, usando un plettro a verme, seleziona le larve transgeniche e mettile in un piccolo bicchiere da orologio con soluzione salina tamponata da vermi. Per la microscopia, utilizzando una lama di rasoio, segnare una griglia sul fondo di plastica di una piastra di chemiotassi di 10 centimetri per tracciare facilmente la posizione dei vermi sulla piastra. Quindi, aggiungere tre microlitri di larve in soluzione salina tamponata da vermi in un quadrato sulla griglia, riempiendo tutti i quadrati necessari.

Quindi aggiungere da 15 a 20 microlitri gocce di nicotina all'1% in acqua alle gocce di vermi. Dopo quattro minuti, quando i vermi sono paralizzati, esaminarli usando un microscopio di dissezione a fluorescenza. Le larve transgeniche di Strongyloides stercolaris con un modello di espressione incompleto e completo di act-2 mRFPmars sono mostrate qui.

L'espressione irregolare nel muscolo della parete corporea è più comune quando il transgene non è integrato nel genoma. Al contrario, l'espressione coerente in tutto il muscolo della parete corporea spesso indica che il transgene si è integrato nel genoma. Il passo chiave è posizionare l'ago nello stesso piano di messa a fuoco della gonade per garantire che il DNA venga iniettato nella gonade e venga incorporato nelle uova in via di sviluppo.

Lo sviluppo di questa tecnica ha permesso di studiare la funzione genica nei nematodi parassiti, che sta fornendo nuove informazioni sui meccanismi del parassitismo e delle interazioni ospite-parassita.