Tecnica per ottenere cellule staminali mesenchimali dal tessuto adiposo e dalla caratterizzazione della frazione vascolare stromale nella crioconservazione a lungo termine

Qui, abbiamo dimostrato il protocollo per ottenere e preservare le cellule buone e vitali per usi di fasi terapeutiche, come l'infusione di cellule mesenchimali pluripotenti. Il vantaggio principale di questo, che utilizzando questa tecnica, possiamo ottenere il volume cellulare vitale rispetto al tempo guadagnato nella fase di isolamento delle cellule dal tessuto raccolto. Questa tecnica può essere estesa a tutte le malattie o condizioni in cui vengono applicate la medicina eterogena e la terapia cellulare.

Questo metodo può essere applicato anche ai test di stabilità citogenomica in aree come i test farmacologici, dove possono essere incoraggiate colture cellulari a lungo termine. Ogni volta che manipolate le cellule vive, siate calmi e fiduciosi. Fai estrema attenzione alla sepsi e sii costantemente vigile con gli occhi di uno scienziato per osservare eventuali avversità e prendere buone decisioni.

Inizia pesando la sacca e misurando la temperatura con un termometro clinico digitale a infrarossi senza contatto. Lasciare la sacca per cinque minuti all'interno della camera a flusso laminare per precipitare gli strati più grassi e separare il tessuto contenente le cellule. Iniettare 100 millilitri di DPBS con calcio nella sacca di trasferimento e mescolare con le mani.

Lasciare riposare per cinque minuti. Quindi utilizzare una siringa da 60 millilitri collegata all'adattatore del sacchetto per eliminare la maggior parte del liquido basale che precipita. Ripeti questo processo due volte.

Aggiungere 100 millilitri della soluzione di digestione al sacchetto e lasciarlo a 37 gradi Celsius per 30 minuti sotto lenta agitazione. Quindi trasferire tutto il contenuto del sacchetto in quattro tubi conici da 50 millilitri e centrifugarli a 400G per 10 minuti a 22 gradi Celsius. Scartare il surnatante e aggiungere 5 millilitri di DMEM a basso glucosio integrato con il 20% di siero bovino fetale al pellet cellulare.

Mescolare una soluzione fresca di 10 microlitri di tripano blu allo 0,05% in acqua distillata con 10 microlitri di sospensione cellulare per cinque minuti. Utilizzare un microscopio a luce invertita con ingrandimento 20X e contare le cellule vitali in una camera di conteggio delle cellule Neubauer. Sospendere il pellet cellulare in un mezzo crioprotettivo ad una concentrazione di 1 milione di cellule per millilitro.

Quindi posizionare 1 millilitro di questa miscela in flaconcini di crio. Utilizzare un contenitore di congelamento con una velocità di raffreddamento di 1 grado Celsius al minuto e conservare a 80 gradi Celsius per un anno. Dopo un anno, conservarlo in scatole standard immerse in fase di vapore di azoto liquido.

I dati delle diverse fasi della procedura dei nove pazienti sono presentati in questa tabella. In base alla resa cellulare iniziale, è stato determinato un volume variabile di cellule per ciascun campione. 1 millilitro di campioni con resa cellulare più elevata, 1,1 millilitri per campioni con resa cellulare intermedia e 2 millilitri per campioni con resa cellulare inferiore.

La resa cellulare prima del passaggio uno variava ampiamente anche quando si osservava la stessa confluenza prima della tripsinizzazione. Pertanto, qui le cellule potrebbero essere cresciute a strati. L'immagine rappresentativa mostra le ADSC mesenchimali plastico-aderenti al primo passaggio dopo l'isolamento al microscopio ottico.

Le cellule mostrano adesione alla morfologia plastica e fibroblasto. Le cellule vitali contate nella camera di Neubauer nel saggio del blu di tripano sono mostrate qui. I dati di citometria a flusso di sei pazienti sono presentati in questa tabella.

Da queste cellule CD45 negative, è stata determinata la percentuale di ADSC con diverse combinazioni di marcatori delle cellule staminali. Le immagini rappresentative mostrano la sottopopolazione di cellule positive per i marcatori associati alle cellule staminali nella SVF del caso nove dopo otto mesi di crioconservazione. Qui, R1 è la regione cellulare totale analizzata nel grafico di dispersione diretta rispetto al grafico di dispersione laterale.

E R2 è la regione CD45 negativa. Le popolazioni CD73, CD90 e CD105 sono positive in questa regione. La differenziazione ADSC nei condrociti, negli osteociti e negli adipociti è mostrata qui.

Durante il tentativo di questa procedura, ricordarsi di mescolare lentamente, preferibilmente con le mani, lasciando a 37 gradi Celsius per 30 minuti per osservare le aderenze e le vesciche. Mantenere la temperatura della stanza di lavoro intorno ai 25 gradi Celsius ed evitare qualsiasi shock termico a temperature molto più elevate. La tecnica che abbiamo mostrato qui può essere utilizzata per isolare con successo le cellule mesenchimali pluripotenti da altri tessuti.