Name: Iniezione virale stereotassica e impianto di lenti con indice di gradiente per limaging del calcio in vivo nel cervello profondo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 11 s
Description: Impara l'imaging del calcio in vivo nel cervello profondo di topi liberamente comportanti utilizzando miniscopio e lenti GRIN. Questo protocollo chirurgico consente registrazioni neuronali su larga scala e longitudinali.

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Questo lavoro è supportato da sovvenzioni del National Institute of Health (NIH) 5P20GM121310, R61NS115161 e UG3NS115608.

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<li>Liang, B., Zhang, L., Moffitt, C., Li, Y., Lin, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+open-source+automated+surgical+instrument+for+microendoscope+implantation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">An open-source automated surgical instrument for microendoscope implantation.</a> Journal of Neuroscience Methods. 311, 83-88 (2019).</li>
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<li>Barbera, G., Liang, B., Zhang, L., Li, Y., Lin, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+wireless+miniScope+for+deep+brain+imaging+in+freely+moving+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">A wireless miniScope for deep brain imaging in freely moving mice.</a> Journal of Neuroscience Methods. 323, 56-60 (2019).</li>
<li>Shuman, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breakdown+of+spatial+coding+and+interneuron+synchronization+in+epileptic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Breakdown of spatial coding and interneuron synchronization in epileptic mice.</a> Nature Neuroscience. 23 (2), 229-238 (2020).</li>
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</ol>

Gli autori non riportano interessi finanziari concorrenti.

Una domanda centrale nelle neuroscienze è capire come le dinamiche neurali e i circuiti codificano e memorizzano le informazioni e come vengono alterate nelle malattie del cervello. Utilizzando un miniscopio in vivo Ca2+ sistema di imaging, l'attività neurale individuale di diverse centinaia di neuroni all'interno di un microcircuito locale può essere monitorata simultaneamente da un animale che si comporta liberamente. Qui, viene descritto un protocollo chirurgico dettagliato per l'iniezione virale e l'impianto di lenti GRIN per preparare i roditori per un cervello profondo in vivo Ca2+ imaging tramite un sistema di registrazione miniscopio sviluppato su misura. La tabella 1 mostra i confronti del nostro sistema miniscopio con altri sistemi miniscopi disponibili in commercio e personalizzati 7,8,9,10,11,13,25,26. Vale la pena notare che l'impianto di lenti GRIN utilizzando l'attuale protocollo chirurgico è compatibile con qualsiasi sistema di imaging a singolo fotone e due fotoni commerciale o personalizzato per un'imaging di calcio in vivo nel cervello profondo.
Dall'iniezione virale all'acquisizione dei dati del miniscopio in vivo per l'imaging del calcio, l'intera procedura sperimentale richiede almeno 2 mesi per essere completata. È un processo complicato e laborioso. Il successo finale dell'esperimento dipende da molteplici fattori, tra cui la corretta scelta dei GECI, l'iniezione di virus con precisione nell'area cerebrale mirata, una sufficiente espressione virale nella popolazione neurale desiderata, l'impianto della lente GRIN esattamente nella posizione desiderata, un adeguato recupero dagli interventi chirurgici, nonché se si verifica una grave infiammazione post-operatoria e se il comportamento dell'animale è gravemente influenzato dagli interventi chirurgici, E così via.
Due passaggi critici includono l'iniezione stereotassica del virus e l'impianto della lente GRIN. A scopo dimostrativo, la microiniezione stereotassica è stata eseguita nel mPFC del topo, con il virus adeno-associato (AAV1) che codifica GCaMP6f sotto il controllo del promotore CaMKII che etichetta selettivamente i neuroni piramidali nell'mPFC. GCaMP6f è stato scelto in quanto è uno degli indicatori di calcio più veloci e sensibili con un tempo di semidecosio di 71 ms15. Inoltre, l'espressione virale AAV di GCaMP6f è di lunga durata (cioè diversi mesi), rendendolo ideale per eseguire immagini ripetitive in vivo Ca2+ per un lungo periodo per studi longitudinali in modelli murini di malattie neurodegenerative27. L'attuale protocollo chirurgico può essere adattato per colpire diverse popolazioni cellulari in qualsiasi altra regione del cervello. Vari strumenti virali disponibili consentono l'etichettatura selettiva di specifiche popolazioni neurali nella regione del cervello desiderata all'età desiderata. Inoltre, i ricercatori possono sfruttare il sistema di ricombinazione Cre-LoxP e vari modelli murini transgenici disponibili per effettuare modifiche genetiche e studiare l'esito dei circuiti comportamentali e neurali28,29.
Una caratteristica unica del protocollo presentato è che l'aspirazione automatizzata del tessuto cerebrale strato per strato è stata eseguita prima dell'impianto della lente GRIN (1 mm di diametro). Ciò si ottiene attraverso un ago da 27 G collegato a un sistema di vuoto, controllato da un braccio robotico personalizzato e dal software23. Sulla base della nostra esperienza, questo metodo genera una superficie uniforme per il contatto della lente GRIN e provoca meno danni al tessuto vicino rispetto all'aspirazione manuale del tessuto23. Per questo motivo, questa procedura porta un ovvio vantaggio per le lenti GRIN con un diametro relativamente più ampio (ad esempio, 1 mm). Tuttavia, l'aspirazione del tessuto potrebbe non essere necessaria per impiantare una lente GRIN con un diametro inferiore (0,5 mm o 0,25 mm). Invece, può essere piantato direttamente lungo il binario principale realizzato con un ago 30 G21.
Oltre ai due passaggi critici discussi sopra, molti altri fattori devono essere attentamente considerati per un'operazione di successo. (1) Tutti gli strumenti che contattano il cervello devono essere sterilizzati per prevenire l'infezione. (2) Tutte le fasi chirurgiche devono essere eseguite per ridurre al minimo i danni al cervello per prevenire ulteriori infiammazioni e formazione eccessiva di tessuto cicatriziale. (3) Le dosi di anestesia somministrate inizialmente e mantenute durante l'intervento chirurgico, in particolare quelle somministrate per via intraperitoneale, devono essere attentamente considerate. Le dosi di anestesia possono essere modificate in base a diversi ceppi di topo, in quanto alcuni possono essere più suscettibili. (4) La condizione del topo deve essere costantemente monitorata durante l'intervento chirurgico. Infine, (5) i topi devono essere regolarmente monitorati dopo l'intervento chirurgico, poiché molte complicazioni possono verificarsi dopo l'intervento chirurgico.
Sebbene un pezzo di tessuto cerebrale venga rimosso unilateralmente durante la fase di impianto della lente GRIN, non abbiamo osservato alcun deficit comportamentale evidente 7,12. Il peso del miniscopio è di circa 2 grammi e il cavo è progettato su misura per renderlo leggero e per garantire che il mouse possa facilmente trasportarlo. Il miniscopio e il cavo sono collegati all'animale solo prima dell'imaging in vivo e staccati dopo l'imaging. L'intero processo di imaging di solito non richiede più di 30 minuti. Pertanto, queste strumentazioni non impediscono al mouse di comportarsi liberamente. Le fasi di installazione e disinstallazione del miniscopio richiedono una breve anestesia (meno di 2 minuti) con isoflurano ai fini del contenimento degli animali. In genere lasciamo che il topo si riprenda dalla breve esposizione di isoflurano per 30 minuti prima di eseguire l'imaging in vivo. Abbiamo eseguito miniscope in vivo calcium imaging una volta alla settimana per alcune settimane senza notare alcun impatto sulla salute del topo e sul comportamento sociale del topo12.
Una delle principali limitazioni dell'attuale sistema di registrazione del miniscopio è la necessità di collegare il microscopio a un cavo per l'acquisizione dei dati. La presenza del cavo a volte limita le prestazioni del compito del mouse e limita la registrazione di un animale alla volta. Recentemente, è stato sviluppato un miniscopio wireless25,26. Ciò amplierà le prestazioni del compito e consentirà l'imaging simultaneo in vivo da più animali in un gruppo. Inoltre, lo sviluppo di GECI più sensibili con lunghezze d'onda separabili spettralmente combinate con un miniscopio a doppio colore offrirà possibilità più interessanti per la ricerca neuroscientifica.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/63049">Stereotaxic Viral Injection and Gradient-Index Lens Implantation for Deep Brain In Vivo Calcium Imaging</a>. The Discussion&#160;was&#160;updated.
The following paragraph was added to the end of the Discussion:
Although a chunk of brain tissue is removed unilaterally during the GRIN lens implantation step, we did not observe any obvious behavior deficits7,12. The weight of the miniscope is around 2 grams and the cable is custom-designed to make it light and to ensure that the mouse can easily carry it. The miniscope and cable are only attached to the animal prior to in vivo imaging and detached after imaging. The entire imaging process usually takes no longer than 30 minutes. Therefore, these instrumentations do not prevent the mouse from freely behaving. The miniscope installation and deinstallation steps need a brief anesthesia (less than 2 minutes) with isoflurane for the purpose of animal restraining. We typically let the mouse recover from the brief exposure of isoflurane for 30 minutes before performing in vivo imaging. We have performed miniscope in vivo calcium imaging once per week for a few weeks without noticing any impact on mouse health and mouse social behavior12.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/63049">Stereotaxic Viral Injection and Gradient-Index Lens Implantation for Deep Brain In Vivo Calcium Imaging</a>. The Discussion&#160;was&#160;updated.

Erratum: Stereotaxic Viral Injection and Gradient-Index Lens Implantation for Deep Brain In Vivo Calcium Imaging

La segnalazione intracellulare di Ca2+ è un regolatore essenziale della crescita cellulare, proliferazione, differenziazione, migrazione, trascrizione genica, secrezione e apoptosi1. Nei neuroni, la segnalazione di Ca2+ è controllata con precisione poiché il suo modello spazio-temporale è correlato a funzioni cruciali come l'eccitabilità della membrana, il rilascio di neurotrasmettitori e la plasticità sinaptica2.
L'imaging del calcio in vivo è una potente tecnica che può essere utilizzata per decodificare la rappresentazione del circuito neurale elementare ai normali comportamenti animali, identificare attività neuronali aberranti in modelli animali di disturbi cerebrali e svelare potenziali bersagli terapeutici che possono normalizzare questi circuiti alterati. I due comuni sistemi di imaging del calcio in vivo sono la microscopia a fluorescenza a scansione laser a due fotoni 3,4,5,6 e la microscopia miniaturizzata montata sulla testa (miniscopio)7,8,9,10,11,12,13 . La microscopia convenzionale a due fotoni offre vantaggi impressionanti come una migliore risoluzione, un rumore inferiore e un minore fotosbiancamento; tuttavia, gli animali da esperimento devono essere fissati a testa in giù, limitando gli studi comportamentali che possono essere eseguiti 3,4,5,6. Al contrario, il sistema miniscopio montato sulla testa è piccolo e portatile, rendendo possibile studiare un'ampia varietà di test comportamentali utilizzando animali che si comportano liberamente 7,8,9,10,11,12,13.
Esistono due indicatori principali di Ca2+, indicatori chimici 5,14 e indicatori di calcio geneticamente codificati (GECI)15,16. L'imaging Ca2+ è stato facilitato utilizzando GECI altamente sensibili forniti con vettori virali che consentono l'etichettatura specifica dei neuroni nel circuito mirato. Il continuo sforzo per migliorare la sensibilità, la longevità e la capacità di etichettare anche i compartimenti subcellulari, rende i GECI ideali per vari studi di imaging del calcio in vivo 17,18,19.
La dispersione della luce nel tessuto cerebrale durante l'imaging limita la penetrazione ottica in profondità, anche con la microscopia a due fotoni. Tuttavia, la lente Gradient Index (GRIN) supera questo problema in quanto la lente GRIN può essere incorporata direttamente nei tessuti biologici e trasmettere immagini dalla regione profonda del cervello all'obiettivo del microscopio. A differenza dell'obiettivo convenzionale realizzato in materiale otticamente omogeneo e richiede una superficie sagomata complicata per mettere a fuoco e creare immagini, le prestazioni dell'obiettivo GRIN si basano su un graduale cambiamento dell'indice di rifrazione all'interno del materiale dell'obiettivo che raggiunge la messa a fuoco con una superficiepiana 20. L'obiettivo GRIN può essere fabbricato fino a 0,2 mm di diametro. Pertanto, una lente GRIN miniaturizzata può essere impiantata nel cervello profondo senza causare troppi danni.
In questo articolo, viene presentato un protocollo chirurgico completo per l'imaging del calcio in vivo nel cervello profondo. A scopo dimostrativo, descriviamo gli interventi chirurgici al cervello specificamente mirati alla corteccia prefrontale mediale (mPFC) del cervello del topo e la registrazione dell'imaging del calcio in vivo tramite un sistema miniscopio personalizzato sviluppato dal gruppo del Dr. Lin presso il National Institute on Drug Abuse (NIDA / IRP) 7,12. La procedura sperimentale prevede due importanti interventi chirurgici al cervello. Il primo intervento chirurgico consiste nell'iniezione stereotassica di un vettore virale che esprime GCaMP6f (un GECI) nella mPFC. Il secondo intervento chirurgico consiste nell'impiantare la lente GRIN nella stessa regione del cervello. Dopo il recupero da questi interventi chirurgici al cervello, la procedura successiva consiste nell'apporre il supporto del miniscopio (base) sul cranio del topo usando cemento dentale. In vivo L'imaging Ca2+ può essere eseguito in qualsiasi momento dopo aver montato il miniscopio sulla sua base. Il protocollo chirurgico per l'iniezione virale e l'impianto di lenti GRIN è compatibile con qualsiasi sistema di imaging a singolo fotone e due fotoni commerciale o personalizzato per l'imaging di calcio in vivo nel cervello profondo.

<table><tbody><tr><td>Frese da 0,6 mm e 1,2 mm Tecnologia</td><td>KF</td><td>8000037800</td><td>Per craniotomia</td></tr><tr><td>Ago da 27 G e 30 G</td><td>Ago BD PrecisionGlide REF</td><td>305109 e REF305106</td><td>Per entrambi gli interventi chirurgici</td></tr><tr><td>45 pinze angolate</td><td>Strumenti Fine Science</td><td>11251-35</td><td>Per interventi chirurgici</td></tr><tr><td>Soluzione di iodio povidone al 7,5% (Betadine)</td><td>Purdue Products L.P.</td><td>NDC 67618-151-17</td><td>Disinfettante per superfici</td></tr><tr><td>Acetone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>179124-1L</td><td>Detergente per lenti GRIN</td></tr><tr><td>Agarosio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9539-25G</td><td>Per l'impianto di lenti GRIN</td></tr><tr><td>Unguento antibiotico</td><td>Tecnologia HeliDerm</td><td>81073087</td><td>Per iniezione di virus</td></tr><tr><td>Farmaco antinfiammatorio (Ibuprofene)</td><td>Johnson & Johnson Consumer Inc</td><td>30043308</td><td>Agisce come antidolorifico dopo gli interventi chirurgici</td></tr><tr><td>AutoStereota</td><td>NIDA/IRP</td><td>github.com/liang-bo/autostereota</td><td>Per l'impianto di lenti GRIN</td></tr><tr><td>Software di ricodifica del comportamento (Point Grey FlyCap2)</td><td>Point Grey</td><td>Point Grey Research Blackfly BFLY-PGE-12A2C</td><td>Per la registrazione del comportamento</td></tr><tr><td>Dado esagonale in ottone</td><td>McMASTER-CARR</td><td>92736A112</td><td>Per l'impianto di lenti GRIN</td></tr><tr><td>Buprenorfina</td><td>Par Pharmaceuticals</td><td>NDC 4202317905</td><td>Per l'impianto di lenti GRIN</td></tr><tr><td>Cloruro di calcio</td><td>Sigma</td><td>10043-52-4</td><td>Per la preparazione</td></tr><tr>del<td>commutatore</td><td>aCSF NIDA/IRP</td><td>Componente progettato su misura</td><td>del sistema di acquisizione delle immagini</td></tr><tr><td>Serbatoio di ossigeno compresso e caxbondioxide</td><td>Soluzioni d'aria delle Montagne Rocciose</td><td>BI-OX-CD5C-K</td><td>Per lente GRIN impianto</td></tr><tr><td>Serbatoio di ossigeno compresso</td><td>Rocky Mountain Air Solutions</td><td>OX-M-K</td><td>Per l'iniezione di virus</td></tr><tr><td>Microtrapano a batteria</td><td>Tecnologia KF</td><td>8000037800</td><td>Per craniotomia</td></tr><tr><td>Cianoacrilato</td><td>Henkel Coorporation</td><td># 1811182</td><td>Per l'impianto di lenti GRIN Controller</td></tr><tr><td>di acquisizione dati</td><td>NIDA/IRP</td> Componente di acquisizione immagini <td>progettato su misura</td><td> sistema</td></tr><tr><td>Cavo di trasmissione dati</td><td>NIDA/IRP</td><td>Componente del sistema di acquisizione delle immagini</td>progettato <td>su misura</td></tr><tr><td>Set di cemento dentale</td><td>C& B Metabond e catalizzatore</td><td>A00253revA306 e A00168revB306</td><td>Per l'impianto di lenti GRIN</td></tr><tr><td>Set di cemento dentale</td><td>Duralay</td><td>2249D</td><td>Per l'impianto di lenti GRIN</td></tr><tr><td>Desametasone</td><td>VETone</td><td>NDC 1398503702</td><td>Per l'impianto di lenti GRIN</td></tr><tr><td>Destrosio</td><td>Sigma</td><td>50-99-7</td><td>Per la preparazione di aCSF</td></tr><tr><td>Diet gel</td><td>Clear H20</td><td>72-06-5022</td><td>Integratore alimentare per</td></tr><tr><td>mouse lente GRIN</td><td>GRINTECH</td><td>NEM-100-25-10-860-S</td><td>per impianto di lenti GRIN</td></tr><tr><td>Pad riscaldante</td><td>Physitemp Instruments LLC.</td><td>#10023</td><td>Per mantenere caldo il corpo del topo durante gli interventi chirurgici</td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>VETone</td><td>V1 502017</td><td>Anestesia</td></tr><tr><td>Ketamina</td><td>VETone</td><td>V1 501072</td><td>Per l'impianto di lenti GRIN</td></tr><tr><td>Lidocaina</td><td>WEST-WARD</td><td>NDC 0143-9575-01</td><td>Anestesia locale</td></tr><tr><td>Cloruro di magnesio esaidrato</td><td>Sigma</td><td>7791-18-6</td><td>Per la preparazione di un</td></tr><tr><td>microlitro di aCSF siringa (Hamilton)</td><td>Hamilton</td><td>7653-01</td><td>Per l'iniezione di virus</td></tr><tr><td>MicroSyringe Pump Controller</td><td>World Precision Instrument</td><td>#178647</td><td>Per l'iniezione di virus</td></tr><tr><td>Miniscope</td><td>NIDA/IRP</td><td>Progettato su misura</td><td>Per l'imaging</td></tr><tr><td>Base del miniscopio</td><td>Protolabs</td><td>Progettato su misura</td><td>Per il montaggio del</td></tr><tr><td>braccio di supporto del miniscope</td><td>di base NIDA/IRP</td><td>Progettato su misura</td><td>Per il montaggio della base</td></tr><tr><td>Cappuccio di protezione del miniscopio</td><td>Protolabs</td><td>Progettato su misura</td><td>Per la protezione del miniscopio</td></tr><tr><td>Controller motorizzato</td><td>Thorlabs</td><td>KMTS50E</td><td>Per il montaggio della base</td></tr><tr><td>NeuView</td><td>NIDA/IRP</td><td>https://github.com/giovannibarbera/miniscope_v1.0</td><td>Per l'imaging in vivo</td></tr><tr><td>Unguento oftalmico Unguento</td><td>Puralube Vet</td><td>NDC 17033-211-38</td> Provetta <td>PCR oftalmica</td></tr><tr><td></td><td>Thermo Scientific</td><td>AB-0622</td><td>Per l'impianto di lenti GRIN</td></tr><tr><td>Pinch Clamp</td><td>World Precision Instrument</td><td>14040</td><td>Per il bloccaggio del tubo</td></tr><tr><td>Nastro in politetrafluoroetilene (PTFE)</td><td>TegaSeal Nastro PTFE</td><td>A-A-58092</td><td>Per il fissaggio del miniScope alla base</td></tr><tr><td>Cloruro di potassio</td><td>Sigma</td><td>7447-40-7</td><td>Per la preparazione di aCSF</td></tr><tr><td>Braccio robotico</td><td>NIDA/IRP</td><td>Progettato su misura</td><td>Per l'impianto di lenti GRIN</td></tr><tr><td>Saline</td><td>Hospira</td><td>RL 7302</td><td>Per entrambi gli interventi chirurgici</td></tr><tr><td>Vite di fermo</td><td>DECORAH LLC.</td><td>3BT-P9005-00-0025</td><td>Per avvitare il dado esagonale in ottone nella base del miniscopio</td></tr><tr><td>&nbsp; Tubo in gomma siliconica, 0,062 "ID, 1/8" OD</td><td>McMaster</td><td>2124T3</td><td>Per l'irrigazione di aCSF</td></tr><tr><td>Bicarbonato di sodio</td><td>Sigma</td><td>144-55-8</td><td>Per la preparazione di aCSF</td></tr><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>Sigma</td><td>7647-14-5</td><td>Per la preparazione di aCSF</td></tr><tr><td>Fosfato di sodio monobasico</td><td>Sigma</td><td>7558-80-7</td><td>Per la preparazione di aCSF</td></tr><tr><td>Stadio stereotassico</td><td>KOPF</td><td>Modello 962 Dual Ultra Preciso Piccolo Animale Stereotassico</td><td>Per entrambi gli interventi chirurgici</td></tr><tr><td>Batuffolo di cotone sterile</td><td>Puritan</td><td>REF 806-WC</td><td>Per entrambi gli interventi chirurgici</td></tr><tr><td>Strumenti chirurgici</td><td>Strumenti di scienze fini</td><td>11251-35</td><td>Per interventi chirurgici</td></tr><tr><td>Sutura</td><td>Sofsilk</td><td>REF SS683</td><td>Per iniezione di virus</td></tr><tr><td>&nbsp; Filtro per siringa (0,22 & micro; m)</td><td>Millex</td><td>SLGVR33RS</td><td>Per filtrare l'aCSF durante l'impianto di lenti GRIN</td></tr><tr><td>Sospensione virale (AAV1-CamKII-GCamp6f)</td><td>Addgene</td><td>100834-AAV1</td><td>Per iniezione</td></tr><tr><td></td><td></td> di virus <td>Titolo: 2,8 X 10^13 GC/ml</td><td></td></tr><tr><td>Xilazina</td><td>VETone</td><td>V1 510650</td><td>Per l'impianto di lenti GRIN</td></tr></tbody></table>

iniezione virale stereotassica e impianto di lenti con indice di gradiente per l'imaging del calcio in vivo nel cervello profondo

Stereotaxic Viral Injection and Gradient-Index Lens Implantation for Deep Brain In Vivo Calcium Imaging

Un microscopio a fluorescenza in miniatura (miniscopio) è un potente strumento per l'imaging del calcio in vivo da animali che si comportano liberamente. Offre diversi vantaggi rispetto ai tradizionali sistemi di imaging del calcio multi-fotone: (1) compatto; (2) leggero; (3) a prezzi accessibili; e (4) consente la registrazione da animali che si comportano liberamente. Questo protocollo descrive gli interventi chirurgici cerebrali per l'imaging del calcio in vivo del cervello profondo utilizzando un sistema di registrazione miniscopio sviluppato su misura. La procedura di preparazione consiste in tre fasi, tra cui (1) iniezione stereotassica del virus nella regione cerebrale desiderata di un cervello di topo per etichettare uno specifico sottogruppo di neuroni con sensore di calcio geneticamente codificato; (2) impianto di lenti a gradiente(GRIN) in grado di trasmettere l'immagine del calcio dalla regione profonda del cervello al sistema miniscopio; e (3) apporre il supporto del miniscopio sul cranio del mouse dove il miniscopio può essere collegato in seguito. Per eseguire l'imaging del calcio in vivo , il miniscopio viene fissato sul supporto e le immagini di calcio neuronale vengono raccolte insieme a registrazioni simultanee del comportamento. L'attuale protocollo chirurgico è compatibile con qualsiasi sistema di imaging a singolo fotone e due fotoni commerciale o personalizzato per l'imaging del calcio in vivo nel cervello profondo.

La Figura 1 mostra la procedura sperimentale schematica, tra cui l'iniezione virale, l'impianto della lente GRIN, l'apposizione della base del miniscopio al cranio del topo e l'imaging del calcio in vivo tramite un miniscopio. L'intera procedura richiede ~ 2 mesi. La Figura 2 mostra i principali componenti descritti nel protocollo per l'imaging del calcio miniscopio in vivo. La Figura 3 mostra le interfacce del software AutoStereota durante l'impianto della lente GRIN. La Figura 4 mostra le interfacce di NeuView e il software di registrazione del comportamento durante l'imaging del calcio in vivo.
Il risultato dell'imaging del calcio in vivo dipende dal successo sia dell'iniezione virale che degli interventi chirurgici di impianto di lenti GRIN. La Figura 5 mostra una serie di risultati (cioè infruttuosi, non ottimali e buoni) dalle registrazioni di imaging del calcio in vivo . In casi non riusciti, l'immagine del calcio potrebbe apparire scura o luminosa, ma di solito non rivela alcun neurone attivo o pochissimi. In genere non perseguiamo esperimenti di registrazione del calcio in vivo se ci sono meno di cinque neuroni attivi. Una buona imaging del calcio in vivo rivela in genere diverse centinaia di neuroni attivi. Se una registrazione contiene meno di cento neuroni attivi, la consideriamo una registrazione non ottimale.
Sia nelle registrazioni subottimali che in quelle buone sono stati perseguiti esperimenti di imaging del calcio in vivo e la successiva analisi dei dati è stata eseguita. Il filmato 1 mostra una registrazione rappresentativa dell'imaging del calcio in vivo dal mPFC del topo. I video comportamentali e i dati di imaging del calcio vengono solitamente elaborati separatamente. I video sul comportamento del mouse possono essere valutati manualmente. I file di imaging del calcio vengono elaborati utilizzando il Toolbox di elaborazione delle immagini di calcio CaImAn24. La Figura 6 mostra una mappa cellulare rappresentativa e diverse tracce di calcio da una buona registrazione di imaging del calcio in vivo .
Dopo aver completato l'imaging del calcio in vivo , il passo finale è confermare se l'iniezione virale e l'impianto della lente GRIN si sono verificati nella regione cerebrale desiderata. A tale scopo, il topo è stato perfuso con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) seguita da paraformaldeide (PFA) al 4%. Il cervello del topo è stato raccolto, postfisso in PFA al 4% per 12 ore e conservato in PBS a 4 °C. Il cervello del topo è stato quindi sezionato in fette spesse 50 μm con un vibratoma. Le fette di cervello sono state colorate con DAPI e osservate al microscopio (non descritte nel protocollo)12. La Figura 7 è una fetta di cervello di topo ~ 1,94 mm anteriore al bregma di un topo sperimentale, che mostra la traccia in cui è stata impiantata la lente GRIN. La regione di fluorescenza verde sotto e intorno alla traccia dell'obiettivo GRIN indica l'espressione di GCaMP6f nella regione mPFC.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63049/63049fig01.jpg"> Figura 1: Panoramica schematica della procedura sperimentale. (A) Iniezione stereotassica di virus nell'mPFC. (B) Impianto della lente GRIN nell'mPFC. (C) Apposizione della base del miniscopio al cranio del topo. (D) Montaggio miniscopio e imaging del calcio in vivo . <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63049/63049fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63049/63049fig02.jpg"> Figura 2: Componenti principali necessari per l'imaging del calcio in vivo . (A) Un obiettivo GRIN con diametro di 1 mm e lunghezza di 4,38 mm. (B) Un ago smussato da 27 G lucidato manualmente utilizzato per l'aspirazione del tessuto cerebrale. (C) Il braccio robotico accoppiato al supporto dell'ago. (D) Un cappuccio su misura da un tubo PCR per proteggere la lente GRIN esposta fino all'apposizione della base del miniscopio sul cranio del mouse. (E) Il supporto del miniscopio (base) con un dado esagonale. (F) Un miniscopio la cui parte filettata è avvolta con il nastro in PTFE. G) Un miniscopio fissato alla base con una vite di bloccaggio. H) Il braccio di tenuta del miniscopio. (I) Un controller motorizzato 3D personalizzato utilizzato per facilitare il movimento del miniscopio in posizioni XYZ. (J) Un cappuccio protettivo fissato alla base per proteggere la lente GRIN esposta mentre il mouse non esegue l'imaging del calcio in vivo . (K) Il miniscopio collegato al cavo. (L) Il sistema di acquisizione dati per l'imaging in vivo Ca2 +. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63049/63049fig02large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63049/63049fig03.jpg"> Figura 3: Interfacce del software AutoStereota durante l'aspirazione del tessuto cerebrale strato per strato. (A) L'interfaccia corrispondente ai passaggi da 2.17.1 a 2.17.3. (B) L'interfaccia corrispondente ai passaggi da 2.17.4 a 2.17.6. (C) L'interfaccia corrispondente ai passaggi da 2.17.7 a 2.17.9. (D) L'interfaccia corrispondente ai passaggi da 2.17.10 a 2.17.12. Le caselle rosse evidenziano i valori di input. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63049/63049fig03large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63049/63049fig04.jpg"> Figura 4: Interfacce del software NeuView e del software di registrazione del comportamento durante l'imaging del calcio in vivo . (A) L'interfaccia di NeuView. (B,C) Le interfacce del software di registrazione del comportamento. Le caselle rosse evidenziano i pulsanti che devono essere cliccati. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63049/63049fig04large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63049/63049fig05.jpg"> Figura 5: Mappe cellulari a fluorescenza a proiezione massima per mostrare la gamma di possibili risultati. (A,B) Imaging di calcio in vivo non riuscito che non è accettabile per la successiva analisi dei dati. (A) è scuro e contiene meno di 5 neuroni attivi. (B) è luminoso ma non ha neuroni attivi. (C) La mappa cellulare da un'immagine subottimale del calcio in vivo che contiene alcuni neuroni attivi. (D) La mappa cellulare da una buona immagine di calcio in vivo che include diverse centinaia di neuroni attivi. Barra di scala: 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63049/63049fig05large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63049/63049fig06.jpg"> Figura 6: Mappa cellulare rappresentativa e transienti di calcio da un imaging di calcio in vivo di successo. Il pannello di sinistra è la mappa cellulare a fluorescenza di proiezione massima da una registrazione di imaging del calcio in vivo nell'mPFC durante un test in campo aperto. La registrazione dura 5 minuti. Il pannello di destra mostra i transienti di calcio provenienti da 15 regioni di interesse (a colori abbinati). Barra di scala: 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63049/63049fig06large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63049/63049fig07.jpg"> Figura 7: Valutazione post mortem di un topo sperimentale. La valutazione post mortem per l'espressione di GCaMP6f e l'impianto della lente GRIN nell'mPFC di un topo sperimentale. L'area rettangolare indica il percorso per l'impianto della lente GRIN. L'area verde sotto la regione impiantata della lente GRIN conferma che GCaMP6f è stato espresso e la lente GRIN è stata impiantata precisamente nella regione del cervello desiderata. Cg, corteccia cingolata; PrL, corteccia prelimbica; IL, corteccia infralimbica. Barra di scala: 400 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63049/63049fig07large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Tabella 1: Confronti del sistema di miniscopio su misura presso il NIDA con altri sistemi di miniscopio 7,8,9,10,11,13,25,26. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63049/63049_Table%201_1.xlsx" target="_blank">Fare clic qui per scaricare questa tabella.</a>
Filmato 1: Una registrazione di immagini di calcio in vivo dal mPFC del topo durante un test in campo aperto. A scopo dimostrativo, questo video mostra solo 1 minuto di registrazione. La frequenza fotogrammi di registrazione originale è di 10 fotogrammi/s. Il video è 6 volte più veloce della registrazione originale. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63049/movie.mp4" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo film.</a>

Miniscope in vivo calcium imaging è una potente tecnica per studiare le dinamiche neuronali e i microcircuiti in topi che si comportano liberamente. Questo protocollo descrive l'esecuzione di interventi chirurgici al cervello per ottenere una buona imaging del calcio in vivo utilizzando un miniscopio.

Iniezione virale stereotassica e impianto di lenti con indice di gradiente per l'imaging del calcio in vivo nel cervello profondo

A miniature fluorescence microscope (miniscope) is a potent tool for in vivo calcium imaging from freely behaving animals. It offers several advantages ...

Miniscope in vivo calcium imaging consente ai ricercatori di esaminare l'attività coordinata spazialmente e temporalmente da centinaia di neuroni in strutture cerebrali profonde di animali che si comportano liberamente. L'imaging del calcio miniscopio in vivo offre molti vantaggi, tra cui la possibilità di eseguire registrazioni specifiche per tipo di cellula, su larga scala e longitudinali. Il nostro protocollo chirurgico per l'iniezione virale e l'impianto di lenti GRIN è compatibile con qualsiasi sistema di imaging a singolo fotone e due fotoni commerciali o personalizzati per l'imaging del calcio in vivo nel cervello profondo.A dimostrare la procedura sarà Rashmi Thapa, uno studente laureato del mio laboratorio. Dopo aver disinfettato l'area chirurgica rasata di un topo anestetizzato, utilizzare un bisturi per fare un'incisione di due centimetri attraverso la pelle lungo la linea mediana per esporre la lambda e il bregma del cranio. Dopo aver localizzato la bava dentale da 0,5 millimetri in una posizione posteriore anteriore di 1,94 millimetri e laterale mediale a 0,5 millimetri dal bregma, iniziare a perforare il cranio.Quindi, caricare il virus nella siringa del microlitri utilizzando il pannello di controllo della micro pompa e prelevare 500 nanolitri di bolle d'aria seguiti da 800 nanolitri del virus ad una portata di 50 nanolitri al secondo. Spostare lentamente l'ago nel tessuto cerebrale fino alla coordinata Z mirata di 1,75 millimetri ventrali dorsali e quindi spostarlo leggermente fino alla coordinata Z del ventrale dorsale di 1,65 millimetri. Sul pannello di controllo, impostare la micropompa per iniettare 500 nanolitri del virus alla portata di 50 nanolitri al minuto prima di premere il pulsante Esegui per iniettare il virus.Al termine dell'iniezione, allineare i bordi della pelle e chiudere con attenzione l'incisione con una sutura 4-0. Applicare un unguento antibiotico sulla zona cucita per prevenire l'infezione. Per impiantare l'indice di gradiente o la lente GRIN, asportare un'area triangolare della pelle di 1,5 centimetri di altezza e 1,5 centimetri di base dal lato anteriore tra gli occhi al lato posteriore dietro la lambda usando forbici fini.Dopo che il cranio è stato accuratamente pulito e asciugato, applicare cianoacrilato sui bordi della pelle e attaccare la pelle al cranio. Dopo cinque minuti, quando il cianoacrilato si asciuga, individuare una bava per trapano dentale di 1,2 millimetri di diametro in una posizione posteriore anteriore di 1,94 millimetri, laterale mediale a 0,8 millimetri dal bregma. Perforare il cranio, seguito dalla rimozione della dura utilizzando una punta dell'ago calibro 30.Pulire tutti i pezzi di detriti ossei con pinze affilate angolate di 45 gradi. Quindi, collegare un ago smussato lucidato manualmente calibro 27 al supporto dell'ago accoppiato a un braccio robotico inclinato con un angolo di 10 gradi e collegare l'altra estremità del supporto dell'ago al sistema di aspirazione della casa. Individuare la punta dell'ago per toccare semplicemente il bregma prima di fare clic sul pulsante Bregma per impostare la coordinata Z di bregma su zero.Impostare il valore X di ingresso su 0,8, il valore di ingresso Y su 1,94, il valore Z di ingresso su 1,0 e fare clic sul pulsante Trova per spostare l'ago sulla parte superiore del foro praticato sul cranio. Centrare la punta dell'ago sul foro praticato e portarlo verso il basso fino allo zero di posizione Z. Accendere il vuoto e iniziare a risciacquare l'area del cervello esposta con liquido cerebrospinale artificiale, o ACSF, attraverso un sistema di tubi a gravità controllata collegato a un ago calibro 30 con una punta piegata.ACSF viene continuamente gonfiato con una miscela di gas del 95% di ossigeno e 5% di anidride carbonica mentre viene filtrato attraverso un filtro da 0,2 micron. Utilizzando il software AutoStereota, l'aspirazione del tessuto cerebrale verrà completata in quattro round. Per il primo round di aspirazione, assicuratevi che il valore Z sia uguale a zero.Quindi, nella sessione zStep, fare clic e controllare la prima e la seconda riga. Impostare i valori per la prima riga su 0,2 e 1. Impostare i valori per la seconda riga su 0,15 e 4.Nella sessione in modalità, impostare la dimensione dell'ago 27 gauge e 1.2. Impostare Dims 0,9. Tutti gli altri valori saranno predefiniti.Per avviare l'aspirazione, fare clic in sequenza sui pulsanti NotSet, KeepZero e Start. Il primo round di aspirazione genera una tasca a colonna con 0,8 millimetri di profondità e 1 millimetro di diametro. Nel terzo round di aspirazione, fate clic e selezionate la prima riga per la sessione zStep e impostate i valori per la prima riga su 1.8 e 1.Nella sessione in modalità, impostare la dimensione dell'ago 27 gauge e 2.2. Inizia l'aspirazione mantenendo gli altri valori uguali a quelli del round precedente. Dopo il terzo round di aspirazione, la profondità della tasca della colonna è di 1,8 millimetri.L'ultimo round di aspirazione è quello di ripulire il sangue accumulato nella parte inferiore della tasca. Impostare i valori per la prima riga su 1,6 e 1 nella sessione zStep e impostare la dimensione dell'ago 27 gauge e 2,2 e Dims 0,6 nella sessione in modalità prima di iniziare l'aspirazione. Una volta che la tasca è priva di sangue, interrompere il vuoto, interrompere l'irrigazione di ACSF e portare l'ago su 2 millimetri in coordinata Z e 0,5 millimetri anteriormente al centro.Posizionare la lente GRIN sterile da 1 millimetro nella tasca del tessuto cerebrale. Quindi, applicare l'agarosio fuso nello spazio tra la lente GRIN e il tessuto cerebrale con l'aiuto di una spatola. Dopo che l'agarosio forma un gel, rimuovere l'agarosio in eccesso usando una micro lama.Mescolare la polvere di cemento dentale e il liquido catalizzatore in un po 'di miscelazione pre-refrigerato e applicare uno strato di cemento resina adesivo auto-polimerizzante sul cranio, iniziando circondando la lente GRIN e quindi coprendo l'intero cranio esposto. In un pozzo di plastica pulito, mescolare la polvere di cemento dentale e il carbone nero con il liquido per applicare uno strato sottile della miscela sopra il primo strato di cemento dentale. Lasciare indurire per cinque minuti.Collegare il Miniscope al cavo e accendere il software personalizzato NuView. In NuView, fai clic su Hardware, seleziona LED1 e fai clic sul pulsante Stream per visualizzare le immagini dal vivo. Per interrompere lo streaming live, fai clic sul pulsante Stop.Quindi, sistemare il Miniscope in un braccio di tenuta Miniscope personalizzato. Con l'aiuto di controller motorizzati, posizionare il Miniscope appena sopra l'obiettivo GRIN esposto, rendendolo parallelo alla superficie dell'obiettivo. Abbassare lentamente il miniscopio verso l'obiettivo GRIN e regolare la sua posizione Z fino a trovare il miglior piano di messa a fuoco.Applicare il primo strato di cemento dentale attorno alla base del Miniscope senza alterare la posizione del Miniscope. Dopo che il cemento è indurito, rimuovere delicatamente il braccio di tenuta in modo che il Miniscope possa stare da solo sulla testa del mouse. Applicare un secondo strato di cemento dentale attorno alla base per riempire tutti gli spazi vuoti, assicurandosi che non vi siano perdite di luce LED dagli spazi vuoti.Lasciare che il cemento dentale si indurisca. Dopo aver brevemente anestetizzato il mouse con isoflurano, allentare la vite di bloccaggio nella base con un piccolo cacciavite prima di rimuovere il cappuccio protettivo e pulire la superficie della lente GRIN con un batuffolo di cotone imbevuto di acetone. Collegare il miniscopio al cavo e avviare il software NuView per iniziare a identificare il piano focale migliore regolando la posizione del miniscopio rispetto alla base stringendo leggermente o allentando con l'aiuto di pinze smussate.Una volta determinato il miglior piano focale, stringere la vite di bloccaggio prima di scollegare il cavo e rimettere il mouse nella sua gabbia di casa. Attivare il software della telecamera di comportamento per visualizzare l'arena di comportamento del mouse tramite una funzione di livestream. Regolare manualmente la messa a fuoco della fotocamera superiore.Seleziona Trigger Strobe e seleziona abilita / disabilita trigger, quindi fai clic sul pulsante Registra. Quindi utilizzare Sfoglia per selezionare una posizione in cui verranno salvate le registrazioni del comportamento. Selezionare il formato immagine desiderato.Avvicinare il mouse all'arena e collegare il Miniscope al cavo collegato al sistema di acquisizione dati. Quindi posiziona il mouse al centro dell'arena. Nel software della telecamera comportamentale, fare clic su Avvia registrazione.In NuView, controlla LED1, fai clic su Cattura e quindi attiva i pulsanti per avviare la registrazione. Ciò consente registrazioni simultanee dell'imaging del calcio e del comportamento del topo. Premi Stop dopo 3.000 fotogrammi e salva i file.Al termine della registrazione, anestetizzare brevemente il mouse con isoflurano, staccare il Miniscope dalla base e posizionare il cappuccio protettivo sulla base prima di rimettere il mouse nella sua gabbia di casa. La mappa cellulare dell'imaging di calcio in vivo subottimale conteneva alcuni neuroni attivi, mentre quella dell'imaging di successo includeva diverse centinaia di neuroni attivi nell'area focalizzata. Nel tipico esempio di un'imaging di calcio in vivo senza successo, la regione è stata osservata essere scura e conteneva meno di cinque neuroni attivi, o la regione era luminosa ma non aveva neuroni attivi.Nell'analisi rappresentativa, vengono mostrate la mappa cellulare a fluorescenza di proiezione massima e i transitori di calcio da una successiva registrazione di imaging del calcio in vivo. La valutazione post-mortem per l'espressione di GCaMP6f e l'impianto della lente GRIN nella PFC mediale di un topo sperimentale ha indicato che GCaMP6f è stato espresso e la lente GRIN è stata impiantata precisamente nella regione cerebrale desiderata. Per ottenere una buona imaging del calcio, è necessario assicurarsi che l'emorragia si sia completamente fermata e che il campo sia privo di coaguli di sangue prima di impiantare la lente GRIN.Questa tecnica può essere utilizzata per studiare i cambiamenti del circuito neurale nel modello murino di diversi disturbi del cervello umano e testare se un candidato farmaco può normalizzare i circuiti alterati.

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Per capire le dinamiche della rete di microcircuiti nella neocorteccia, è essenziale per registrare contemporaneamente l'attività di un gran numero di neuroni. In vivo a due fotoni di imaging del calcio è l'unico metodo che permette di registrare l'attività di una densa popolazione neuronale con cella singola risoluzione.

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In questo articolo, mostriamo un metodo per fare gli aghi capillare di vetro con un 50-micron lumen. Questa tecnica riduce in modo significativo il danno al cervello, riduce al minimo la diffusione passiva di farmaci e permette una mira precisa nel cervello dei roditori.

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Qui si descrivono le procedure sperimentali coinvolti in due fotoni di imaging di topo corteccia durante il comportamento in un ambiente di realtà virtuale.

Due fotoni Imaging di calcio in topi Navigazione una realtà ambiente virtuale

L'imaging microendoscopico in vivo del calcio è uno strumento inestimabile che consente il monitoraggio in tempo reale delle attività neuronali negli animali che si comportano liberamente. Tuttavia, l'applicazione di questa tecnica all'amigdala è stata difficile. Questo protocollo mira a fornire una linea guida utile per indirizzare con successo le cellule di amigdala con un microscopio miniaturizzato nei topi.

Imaging di calcio in vivo di successo con un microscopio miniaturizzato head-mount nell'amigdala del topo che si comporta liberamente

Presentiamo un protocollo per esporre il tronco encefalico del topo adulto dal lato ventrale. Utilizzando una lente indice gradient-rifrazione con un microscopio in miniatura, l'imaging di calcio può essere utilizzato per esaminare l'attività dei somata neurali olivari inferiori in vivo.

In vivo Imaging del calcio nell'oliva inferiore del topo

Il restringimento del cemento dentale durante la polimerizzazione sposta la piastra di base. Questo protocollo minimizza il problema creando una base iniziale del cemento dentale che lascia spazio per cementare la piastra di base. Settimane dopo, la piastra di base può essere cementata in posizione su questa impalcatura utilizzando poco nuovo cemento, riducendo così il restringimento.

Utilizzo di baseplating e un miniscopio preancorato con una lente obiettiva per la ricerca transitoria di calcio nei topi

Il giro dentato dell'ippocampo svolge funzioni essenziali e distinte nell'apprendimento e nella memoria. Questo protocollo descrive una serie di procedure robuste ed efficienti per l'imaging in vivo del calcio di cellule granulari nel giro dentato in topi che si muovono liberamente.

Imaging in vivo del calcio delle cellule dei granuli nel giro dentato dell'ippocampo nei topi 

Questo protocollo dettaglia l'imaging in vivo del calcio dei neuroni ipotalamici utilizzando un microscopio miniaturizzato (miniscopio) in topi che si comportano liberamente durante la manipolazione dello stato sociale (isolamento sociale e riunione sociale). Questo metodo consente l'imaging a risoluzione neuronale singola dell'attività ipotalamica che rappresenta il bisogno sociale e la sazietà sociale, consentendo studi meccanicistici sull'omeostasi sociale.

In vivo Imaging del calcio con microscopio miniaturizzato nell'ipotalamo per comprendere i comportamenti sociali nei topi

Impara l'imaging del calcio in vivo nel cervello profondo di topi liberamente comportanti utilizzando miniscopio e lenti GRIN. Questo protocollo chirurgico consente registrazioni neuronali su larga scala e longitudinali.

Iniezione virale stereotassica e impianto di lenti con indice di gradiente per limaging del calcio in vivo nel cervello profondo (Video) | JoVE Journal

Iniezione virale stereotassica e impianto di lenti con indice di gradiente per l'imaging del calcio in vivo nel cervello profondo

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