Un metodo semplice ed efficace per isolare in modo coerente i cardiomiociti di topo
11 novembre 2022
Il gold standard in cardiologia per esperimenti funzionali cellulari e molecolari sono i cardiomiociti. Questo articolo descrive gli adattamenti alla tecnica non-Langendorff per isolare i cardiomiociti di topo.
Questa tecnica è più affidabile ed efficiente e non richiede una pratica o un addestramento approfonditi rispetto alle tecniche di apparecchi Langendorff più comunemente usate. Il vantaggio principale di questa tecnica è che limita il tempo ischemico poiché la perfusione iniziale avviene in vivo. Durante l'esecuzione di questa tecnica, è essenziale evitare bolle nel collettore e per evitare un eccessivo movimento del cuore durante la digestione, queste possono diminuire la resa.
A dimostrare questa tecnica sarà Sarah Sturgill, una studentessa laureata nel laboratorio del Dr.Mark Ziolo. Iniziare con la pulizia del collettore a temperatura controllata utilizzando un tampone di perfusione appena preparato. Per fare ciò, avvitare un ago calibro 27 e rimuovere le bolle utilizzando un connettore luer lock.
Assicurati che non rimangano bolle. Per isolare il cardiomiocita, esporre lo sterno del topo completamente anestetizzato, e lateralmente alla linea mediana, tagliare prossimalmente attraverso le costole e all'ascella. Quindi tagliare attraverso il diaframma, assicurando tagli superficiali per evitare il cuore.
Bloccare lo sterno con un emostatico e piegare le costole all'indietro per esporre la cavità toracica. Rimuovere delicatamente il pericardio dal cuore prima di tagliare la vena cava inferiore immediatamente distale al cuore. Iniettare tre millilitri di tampone ghiacciato nel ventricolo destro del cuore in un minuto utilizzando un ago da 27 gauge.
Quindi, tieni il cuore usando una pinzetta. Tirarlo via dal corpo ed esporre il più possibile l'aorta. Quindi bloccare l'aorta ascendente usando un emostato e asportare il cuore.
Trasferire rapidamente il cuore bloccato sul coperchio di una capsula di Petri in polipropilene contenente 10 millilitri di tampone di perfusione calda. Posizionare il cuore bloccato nella piattaforma di supporto e iniettare 10 millilitri di tampone di perfusione a temperatura controllata a 37 gradi Celsius nel ventricolo sinistro per cinque minuti utilizzando un ago stabilizzato da 27 gauge collegato al collettore. Quindi, trasferire il cuore bloccato e la piattaforma di supporto in una capsula di Petri con circa cinque millilitri di tampone di digestione.
Sostituire le siringhe di ingresso con una siringa da 50 millilitri contenente 25 millilitri di tampone di digestione. Eliminare il collettore da eventuali bolle e il tampone di perfusione rimanente prima dell'iniezione. Riposizionare con cautela l'ago nella stessa posizione dell'ago nell'apice ventricolare sinistro.
Con l'aiuto di una pompa di perfusione, iniettare tampone di digestione a 37 gradi Celsius nel ventricolo sinistro per 15 minuti utilizzando una siringa da 50 millilitri. Controllare la temperatura della soluzione con una camicia d'acqua calibrata per espellere la soluzione a 37 gradi Celsius. Rimuovere i ventricoli dagli atri prima di trasferirli in un becher da 10 millilitri.
Aggiungere tre millilitri di tampone di digestione al becher e tagliare i ventricoli in grandi pezzi usando forbici affilate. Coprire il becher con un foglio di alluminio e metterlo in un bagno d'acqua agitante preriscaldato a 37 gradi Celsius per cinque minuti. Dopo aver scartato il surnatante, risospendere i pezzi di tessuto in tre millilitri di tampone digestivo e triturarlo per circa quattro minuti o fino a raggiungere una miscela omogenea.
Una volta fatto, filtrare le celle in un tubo di polipropilene da 50 millilitri utilizzando un filtro di nylon da 70 micrometri. Lavare il filtro cellulare in nylon con tre millilitri di tampone digestivo. Riportare il filtrato in un tubo di polipropilene con fondo rotondo da 14 millilitri e centrifugarlo.
Scartare il surnatante prima di risospendere il pellet in tre millilitri di tampone di arresto. Alla sospensione cellulare, aggiungere 54 microlitri di 100 millimolari di calcio cloruro di calcio per rendere la concentrazione finale di cloruro di calcio 1,8 millimolare. Lasciare riposare le cellule vive per 10 minuti e rimuovere il surnatante contenente cellule morte.
Dopo aver risospeso il pellet in una soluzione di stoccaggio, le cellule possono essere utilizzate per esperimenti funzionali e colture. Le immagini al microscopio a campo chiaro di cellule isolate hanno mostrato che l'isolamento dei cardiomiociti di topo produceva cellule quiescenti a forma di bastoncello senza macchie di membrana o bordi arrotondati. Le cellule hanno mostrato una resa di circa l'80% e alti tassi di sopravvivenza che hanno determinato il successo della tecnica di isolamento.
Per un isolamento di successo, è molto importante rimuovere le bolle dal collettore e inserire l'ago nello stesso foro nel cuore. Una volta isolati, i cardiomiociti possono essere utilizzati per esperimenti funzionali cellulari e molecolari.
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Panoramica
In questo articolo viene descritta una tecnica affidabile ed efficiente per isolare cardiomiociti di topo senza la necessità di un addestramento approfondito. Il metodo minimizza il tempo ischemico eseguendo la perfusione iniziale in vivo.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Cardiologia
- Biologia cellulare
- Biologia molecolare
Sfondo
- I cardiomiociti sono essenziali per esperimenti funzionali cellulari e molecolari in cardiologia.
- La tecnica di Langendorff è comunemente usata ma presenta limitazioni.
- Questo articolo presenta adattamenti per migliorare il processo di isolamento.
- La riduzione del tempo ischemico è fondamentale per un rendimento migliore.
Scopo dello studio
- Presentare una tecnica non Langendorff per l'isolamento di cardiomiociti murini.
- Dimostrare i vantaggi di questo metodo rispetto alle tecniche tradizionali.
- Fornire un protocollo affidabile per i ricercatori.
Metodi Utilizzati
- Perfusione iniziale eseguita in vivo per limitare il tempo ischemico.
- Utilizzo di un manifold a temperatura controllata con buffer di perfusione appena preparato.
- Rimozione delle bolle d'aria nel manifold mediante connettore luer lock.
- Manipolazione accurata del cuore durante la digestione per mantenere il rendimento.
Risultati principali
- La tecnica è più affidabile ed efficiente rispetto ai metodi Langendorff.
- Riduce la necessità di un addestramento approfondito.
- Migliora il rendimento dei cardiomiociti isolati.
- Dimostrata da uno studente laureato in un contesto di laboratorio.
Conclusioni
- La tecnica non-Langendorff rappresenta un'alternativa praticabile per l'isolamento dei cardiomiociti.
- Offre vantaggi significativi in termini di efficienza e affidabilità.
- Questo metodo può migliorare la ricerca in cardiologia e in campi correlati.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Contenuto
L'isolamento costante di cardiomiociti murini di alta qualità è fondamentale per la validazione degli obiettivi cardiaci e la riduzione dei rischi meccanicistici nella fase iniziale della scoperta. Questo protocollo semplificato, privo della tecnica di Langendorff, riduce le barriere tecniche e gli artefatti ischemici, consentendo saggi funzionali affidabili che guidano la selezione del portafoglio e aumentano la previsione predittiva. Il metodo supporta flussi di lavoro scalabili e riproducibili, essenziali per il confronto tra programmi nella ricerca e sviluppo cardiovascolare.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Permette un'analisi accurata dei meccanismi delle malattie cardiache mediante cardiomiociti primari di topo.
- Riduce la variabilità tecnica, favorendo la validazione funzionale delle proteine bersaglio e una chiara comprensione dei meccanismi.
- Facilita previsioni affidabili negli studi di biologia cardiaca nelle fasi iniziali.
Sviluppo di Screening e Saggi
- Fornisce una fonte riproducibile di cardiomiociti vitali per saggi funzionali successivi.
- Permette la standardizzazione delle misurazioni di contrazione, elettrofisiologia e ciclo del calcio.
- Migliora la prontezza e la scalabilità dei saggi per piattaforme di screening di composti.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Si allinea a endpoint funzionali rilevanti per la malattia negli studi traslazionali sui biomarcatori.
- Consente una continuità dalla fase di scoperta alla validazione preclinica, utilizzando preparazioni cellulari costanti.
- Supporta decisioni di avanzamento basate sulla valutazione del rischio, riducendo l'ambiguità biologica.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo protocollo di isolamento si colloca all'interfaccia tra la fase iniziale della scoperta e lo sviluppo di saggi, fornendo cardiomiociti di alta qualità per test funzionali, screening e ricerca traslazionale.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi e la riduzione del rischio meccanicistico consentendo un'analisi funzionale diretta delle cellule cardiache.
- Screening: Fornisce risultati quantitativi riproducibili per la valutazione di composti in sistemi biologici validati.
- Analisi: Permette la misurazione della contrazione, della vitalità e dei parametri elettrofisiologici per studi comparativi.
- Ricerca traslazionale: Mantiene la continuità degli endpoint funzionali dall'ambiente in vitro ai modelli preclinici.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce un protocollo standardizzato e scalabile per un uso ripetuto in diversi programmi di ricerca cardiovascolare.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva e riduce l'ambiguità meccanicistica nella validazione degli obiettivi cardiaci.
- Valore operativo: Semplifica i requisiti di formazione e migliora la riproducibilità tra i diversi gruppi di lavoro.
- Valore strategico: Permette decisioni più informate sul proseguimento o l'interruzione dei progetti e una gestione del portafoglio più efficiente in termini di capitale.
- Impatto sul portafoglio: Favorisce la priorità e l'avanzamento dei programmi cardiaci con una valutazione adeguata del rischio.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze di base in chirurgia e perfusione, ma meno esperienza tecnica rispetto ai metodi Langendorff.
- Necessita di un sistema di perfusione e digestione con controllo della temperatura.
- Richiede un'attenta rimozione delle bolle e un posizionamento costante dell'ago per garantire riproducibilità.
- Adattabile a diversi modelli murini e contesti di malattie cardiache.
- Il rendimento e la vitalità dipendono da un'accurata manipolazione e dai tempi descritti nel protocollo.
