Uso di Crystal Violet per migliorare la lettura basata sull'effetto citopatico visivo per la titolazione virale utilizzando i saggi TCID50

L'obiettivo di questo protocollo è quello di produrre una titolazione delle scorte di virus e visualizzarla utilizzando la colorazione viola cristallina. Per fare ciò, verrà dimostrata una titolazione virale generale seguita dalla colorazione. Questa titolazione sarà eseguita in una piastra da 96 pozzetti per un periodo di sette giorni in un armadio di biosicurezza all'interno di un laboratorio di livello di biosicurezza 2.

Per fare ciò, una piastra a 96 pozzetti della linea cellulare preferita verrà seminata utilizzando il mezzo corrispondente e lasciata crescere fino alla confluenza. Lo stock di virus sarà diluito utilizzando dieci diluizioni, mescolando 900 microlitri di media e 100 microlitri di virus, o la corrispondente diluizione. Assicurarsi di ruotare ogni tubo per garantire una corretta miscelazione del fluido e del virus ed evitare errori sulle diluizioni.

Scrivi il layout della tua piastra in testa e ogni diluizione per aiutare durante il processo di infezione. Prima dell'infezione, lavare con 200 microlitri di PBS. Aggiungi 50 microlitri del tuo inoculo nei pozzetti corrispondenti.

Quindi, incubare a 37 gradi Celsius in un incubatore a CO2 al 5% per sette giorni. Dopo l'incubazione di sette giorni, lavare con 200 microlitri di PBS. Fissare le cellule aggiungendo 50 microlitri per pozzetto di PFA al 4% in PBS e incubare per 15 minuti a temperatura ambiente.

Dopo l'incubazione, lavare nuovamente le cellule due volte con 200 microlitri di PBS prima dell'aggiunta di 50 microlitri per pozzetto di viola cristallino in acqua e incubare per cinque minuti a temperatura ambiente. Infine, aspirare il cristallo viola dai pozzetti e, facoltativamente, lasciare asciugare le piastre all'aria per due-cinque minuti a temperatura ambiente o lavarlo con 200 microlitri d'acqua per rimuovere le macchie eccessive prima della visualizzazione. Di conseguenza, dopo la ricolorazione, le cellule negative saranno macchiate.

I pozzi positivi saranno eliminati. Queste informazioni verranno utilizzate in una delle due formule descritte per calcolare il titolo virale finale. Quando il titolo ottenuto con ciascun metodo è stato confrontato, ha dimostrato che nella chimica monocyto la colorazione potrebbe in alcuni casi rilevare ulteriori pozzetti positivi rispetto al viola cristallino e che, allo stesso modo, entrambi i metodi di colorazione potrebbero rilevare più pozzi positivi rispetto alla valutazione visiva tramite microscopia.