Name: Determinazione del dispendio energetico basale e della capacità degli adipociti termogenici di spendere energia nei topi obesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-11-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 57 s
Description: Impara a misurare il metabolismo basale e la capacità termogenica degli adipociti nei topi obesi con calorimetria indiretta. Questo metodo aiuta a studiare i meccanismi del bilancio energetico e le malattie metaboliche.

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ML è finanziato dal Dipartimento di Medicina dell'UCLA, sovvenzioni pilota da P30 DK 41301 (UCLA: DDRC NIH) e P30 DK063491 (UCSD-UCLA DERC).

Tutti gli esperimenti sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee dell'Università della California, Los Angeles (UCLA). Ai topi è stata somministrata la loro dieta e acqua ad libitum nella gabbia metabolica, alloggiati in un ambiente a temperatura controllata (~ 21-22 o 30 ° C) con un ciclo di luce / buio di 12 ore. Per questo studio sono stati utilizzati topi femmina di 8 settimane alimentati con una dieta ricca di grassi o una dieta a base di chow per 8 settimane.
1. Misurazione del metabolismo basale (BMR)
<ol><li>Misurare il peso corporeo totale del mouse utilizzando una bilancia con precisione nell'intervallo di 0,1 g. NOTA: Questo deve essere fatto prima di alloggiare i topi in gabbie metaboliche e dopo i 2-3 giorni di periodo di acclimatazione alle gabbie metaboliche.</li>
	<li>Misurare la composizione corporea, compresa la massa grassa e magra in topi non anestetizzati, utilizzando un appropriato sistema di analisi della composizione corporea (vedere Tabella dei materiali). NOTA: queste misurazioni sono necessarie per determinare il dispendio energetico e vengono eseguite in parallelo alle misurazioni del peso corporeo totale (fase 1.1).</li>
	<li>Impostare le gabbie metaboliche e iniziare il periodo di acclimatazione. NOTA: Il sistema di gabbie metaboliche include un involucro che consente all'utente di controllare la temperatura e la luce dell'alloggiamento di 12 gabbie (Figura 1A, B). Ogni gabbia ha una bottiglia d'acqua, un alimentatore e una griglia (Figura 1C). La griglia separa il mouse dal fondo della gabbia, consentendo la raccolta delle feci. Una volta installata la gabbia su ogni spazio predeterminato, un coperchio che sigilla la gabbia include la fessura della bottiglia d'acqua, l'aria di campionamento del tubo, il sistema di flusso d'aria e il sensore di attività fisica (Figura 1D).<ol>
<li>Accendere l'involucro della temperatura, il sistema di flusso d'aria e il computer 2 ore prima di iniziare il test.</li>
		<li>Dopo 2 ore, aprire il software che controlla l'involucro (vedere Tabella dei materiali) e il flusso d'aria e lasciare che il software verifichi la comunicazione del computer con l'apparecchiatura. NOTA: il software Oxymax è stato utilizzato per il presente lavoro.</li>
		<li>Una volta stabilita la comunicazione, fare clic su File, quindi su Apri configurazione esperimento (Figura 2A) e selezionare la configurazione dell'esperimento predefinita dal fornitore (o configurata da un test precedente).</li>
		<li>Fare clic su Esperimento, quindi fare clic su Proprietà, che aprirà la finestra Proprietà esperimento (Figura 2B).</li>
		<li>Nella finestra Proprietà, impostare i parametri dell'involucro ambientale, inclusi i cicli di temperatura ambiente (21 °C) e 12 ore di luce. NOTA: mantenere il software aperto e funzionante consente all'aria di fluire nelle gabbie e nell'involucro per mantenere la temperatura selezionata e i cicli di luce. Pertanto, l'intero sistema può funzionare con topi all'interno delle gabbie per diversi giorni, anche senza misurare ossigeno e CO2.
</li>
		<li>Fare clic su Esperimento, quindi fare clic su Configurazione e si aprirà la finestra Impostazione esperimento , in cui vengono definiti i parametri di ciascuna gabbia metabolica.</li>
		<li>Assegnare ogni ID del mouse alla singola gabbia in cui è alloggiato il mouse (Figura 2C).</li>
		<li>Includere la massa magra o il peso corporeo totale per ciascun topo solo se non si osservano differenze nel peso corporeo tra i gruppi. NOTA: L'ottenimento di valori grezzi del consumo di ossigeno e del dispendio energetico facilita le analisi ANCOVA.</li>
		<li>Impostare la portata d'aria nella gabbia metabolica a 0,5-0,6 L/min.</li>
		<li>Nella finestra Configurazione esperimento selezionare il percorso e il nome di salvataggio del file. Selezionare la directory di backup (Figura 2D).</li>
		<li>Aggiungi una quantità pre-ponderata di cibo agli alimentatori che copra almeno l'assunzione di cibo per 1 giorno. NOTA: se le gabbie hanno bilance integrate, il cibo può essere aggiunto direttamente e il software lo registrerà.</li>
		<li>Aggiungere le bottiglie d'acqua. Controllare che la bottiglia sia sigillata correttamente e non perda.</li>
		<li>24 ore dopo aver aggiunto il cibo, pesare il cibo che viene lasciato sulla gabbia. NOTA: I grammi di cibo aggiunti meno i grammi di cibo rimasti misureranno l'assunzione di cibo.</li>
		<li>Iniziare le misurazioni di ossigeno, CO2 e attività (fase 1.4.10) una volta che i valori di assunzione di cibo sono gli stessi di quelli dei topi alloggiati in gabbie regolari. NOTA: Qui, il periodo di acclimatazione (di solito 2-3 giorni) è completato e le misurazioni del dispendio energetico possono iniziare.</li>
	</ol></li>
	<li>Calorimetria indiretta e misure di attività per valutare il dispendio energetico<ol>
<li>Misura il peso corporeo, il grasso e la massa magra di tutti i topi prima di iniziare le misurazioni. NOTA: Questi sono i valori di peso corporeo e massa magra utilizzati per eseguire analisi ANCOVA.</li>
		<li>Calibrare il rivelatore A base di zirconia O2 e CO2 del sistema CLAMS (vedi Tabella dei materiali) con la concentrazione di ossigeno raccomandata; ricalibrare sempre il rilevatore prima di iniziare un nuovo esperimento.</li>
		<li>Utilizzare un gas di taratura di composizione nota (20,50% di ossigeno e 0,50% di CO2). NOTA: i fornitori di gas spesso si riferiscono a questo gas come "Primary Standard Grade".</li>
		<li>Accendere e assicurarsi che la pressione di uscita del serbatoio sia a 5-10 psi.</li>
		<li>Aprire il software Calibration Utility per calibrare e testare i sensori di gas (Figura 2E). Fai clic su Esperimento, quindi su Calibra.</li>
		<li>Premere Start. Quindi, attendere che i sensori vengano testati e che il software chieda all'utente di ruotare le manopole del sensore di gas (Figura 2F) fino a quando il valore dell'identità O2 è 1 (Figura 2G-H). Fare clic su Avanti al termine del passaggio. NOTA: se l'utilità di calibrazione esegue tutti i passaggi correnti, la calibrazione procederà automaticamente al passaggio successivo quando la barra di avanzamento viene riempita.</li>
		<li>Verificare i risultati della calibrazione quando tutti i passaggi sono stati completati e i risultati sono stati presentati.</li>
		<li>Spegnere il gas di calibrazione.</li>
		<li>Cambia il cibo e aggiungi cibo sufficiente per un periodo di 48-72 ore. NOTA: Sebbene le gabbie possano essere aperte durante le misurazioni del dispendio energetico per monitorare il peso corporeo e cambiare il cibo ogni giorno, i topi possono essere stressati da queste manipolazioni e le misurazioni vengono perse quando le gabbie vengono aperte. Pertanto, si raccomanda di evitare qualsiasi manipolazione durante il periodo di misurazione.</li>
		<li>Nel software, fare clic su Esperimento e quindi su Esegui per avviare le misurazioni di ossigeno, CO2 e attività (Figura 3A). NOTA: L'esecuzione delle misurazioni può essere tracciata in tempo reale in una casella situata nella sezione in basso a sinistra del software (rettangolo rosso, Figura 3B). Il rettangolo rosso nella Figura 3B mostra che il sistema misura la gabbia #1 all'intervallo #3, vale a dire la terza misurazione. Una misurazione in una gabbia può richiedere circa 1 minuto. Pertanto, con 12 gabbie collegate, il consumo di ossigeno può essere misurato approssimativamente ogni 12 minuti. Si consigliano misurazioni continue per un minimo di 48 ore.</li>
		<li>Interrompere l'esperimento facendo clic su Esperimento e quindi su Interrompi (Figura 3C).</li>
		<li>Apri le gabbie, pesa i topi e il cibo. Raccogli le feci per calcolare il numero di calorie e lipidi escreti nel periodo di misurazione di 48-72 ore. NOTA: Le feci possono essere conservate a -20 °C per analisi successive. Queste gabbie non possono essere utilizzate efficacemente per raccogliere l'urina.</li>
		<li>Fare clic su Esperimenti, quindi su Esporta ed Esporta tutti i soggetti come file CSV (Figura 3D). NOTA: Per facilitare le analisi ANCOVA, è essenziale esportare i valori di consumo di ossigeno grezzo (VO2) e produzione di CO2 (VCO2) senza essere normalizzati dal peso corporeo.</li>
	</ol></li>
	<li>Analisi dei dati e controllo qualità<ol>
<li>Nel foglio CSV esportato (Figura 3D) (dal passaggio 1.4.13), utilizzare i valori grezzi del consumo di ossigeno (VO2) e della produzione di CO2 (VCO2) misurati ogni 12 minuti nel periodo di 2-3 giorni che vengono automaticamente elencati dal software e includono un timestamp, ovvero l'ora e la data in cui sono stati misurati. NOTA: i valori di VO2 e VCO2 verranno corretti automaticamente se vengono aggiunti valori di peso corporeo o massa magra.</li>
		<li>Nel foglio CSV esportato, utilizzare i valori grezzi del rapporto di scambio respiratorio (RER: VCO2/VO2) che vengono calcolati automaticamente ed elencati dal software in base al loro timestamp. NOTA: Valori vicini a 1 mostrano che il topo ossida principalmente i carboidrati, mentre valori più vicini a 0,7 rappresentano che il topo sta principalmente ossidando il grasso. RER superiore a 1 può verificarsi durante l'esercizio anaerobico, poiché il corpo espelle più CO2 per compensare l'acidosi causata dal lattato. RER superiore a 1 può indicare stress. Il file CSV esportato contiene anche i valori grezzi del dispendio energetico (EE) o della produzione di calore in calorie al minuto per mouse, misurati ogni 12 minuti nei 2-3 giorni. Qui, tutti i valori elencati includono un timestamp.</li>
		<li>Poiché sono necessari valori EE singoli per mouse per un ANCOVA, mediare i valori EE registrati tra 09:00-16:00 per la fase di luce (giorno) e 19:00-04:00 per la fase scura (notte) per mouse e giorno. NOTA: questa operazione può essere eseguita manualmente utilizzando Excel o Graph Pad. La selezione di queste finestre bitempo evita di calcolare la media dei valori EE intermedi, graduali e instabili associati alla transizione di fase chiaro-scuro.</li>
		<li>Per un periodo di 48 ore, calcolare la media dei due valori di luce diurna e dei due valori di fase scura per mouse utilizzando Excel o Graph Pad.</li>
		<li>Per quantificare l'attività fisica totale, utilizzare Excel o Graph Pad per sommare i conteggi di rottura del fascio x, y e z misurati nelle gabbie metaboliche ed elencati nel file CSV per ciascun mouse. NOTA: l'attività totale x,y,z viene calcolata eseguendo prima il valore medio di ogni X, Y, Z per mouse e ciclo. Quindi, la somma di ogni valore medio X, Y, Z per mouse e ciclo viene determinata per tracciare i dati come nella Figura 5E (essendo la media di 2 giorni).</li>
		<li>In alternativa, rappresentare i dati che mostrano ogni valore di misurazione nel tempo, che genera curve che illustrano i cambiamenti in EE durante la transizione dai cicli di luce a quelli scuri. NOTA: fare riferimento alla sezione di discussione su come e quando eseguire le analisi ANCOVA e le diverse formule utilizzate per calcolare VO2, VCO2 ed EE sono fornite nel file supplementare 1.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Misurazione della capacità degli adipociti termogenici di spendere energia
<ol><li>Impostare le misurazioni e i trattamenti del mouse. Vedere la fase 1 per i dettagli sui preparati sperimentali per monitorare il consumo di ossigeno, poiché la capacità termogenica negli adipociti è determinata indirettamente dal consumo di ossigeno seguendo le fasi 2.1.1-2.2.2. NOTA: Questo protocollo richiede l'anestesia del topo e il trattamento acuto con l'agonista del recettore beta-3 CL-316.243 (vedere Tabella dei materiali), fornendo una rapida valutazione della capacità termogenica del BA.<ol>
<li>Eseguire l'analisi della composizione corporea e pesare i topi. Accendere il CLAMS, impostare la temperatura a 30 °C (termoneutralità) e attendere 2 ore affinché l'intero sistema si riscaldi.</li>
		<li>Impostare il resto delle condizioni di analisi, compresa la luce, assegnare l'ID del mouse a ciascuna gabbia e aggiungere il valore del peso corporeo di ciascun topo nella gabbia corrispondente se non si osserva alcuna differenza di peso corporeo tra i gruppi.</li>
		<li>Calibrare il rilevatore di ossigeno/CO2 come nei passaggi 1.4.2-1.4.7.</li>
		<li>Avviare l'esperimento nel software.</li>
		<li>Iniettare ogni topo con pentobarbital (60-120 mg/kg) e collocare ciascun topo nella gabbia metabolica assegnata (fase 2.1.2). NOTA: La dose di pentobarbital necessaria per mantenere i topi addormentati a termoneutralità (30 °C) varia con il ceppo e il genotipo del topo. Si raccomanda di testare diverse dosi di pentobarbital da 50 a 120 mg/kg e scegliere quella mantenendo il topo anestetizzato durante 2-3 ore a 30 °C. Un'anestesia efficiente è essenziale per rimuovere il contributo dell'attività fisica al dispendio energetico.</li>
		<li>Per garantire l'anestesia, osservare i topi dopo l'iniezione di pentobarbital fino a quando non sono completamente addormentati e i loro tassi di consumo di ossigeno diminuiscono costantemente.</li>
		<li>Attendere di ottenere almeno 3 tassi di consumo consecutivo di ossigeno stabili prima di iniettare CL-316.243. NOTA: In attesa della stabilizzazione del consumo di ossigeno, preparare le siringhe con CL-316.243 per ciascun topo (1 mg/kg).</li>
		<li>Aprire la gabbia #1 e iniettare CL-316.243 per via sottocutanea immediatamente dopo che si è verificata una misurazione di VO2 e VCO2 nella gabbia #1. Riportare il topo nella gabbia #1 immediatamente dopo l'iniezione. NOTA: le misurazioni vengono indicate in tempo reale nella sezione in basso a sinistra del software (Figura 3B, rettangolo rosso).</li>
		<li>Attendere la misurazione della gabbia n. 2 (Figura 3B, rettangolo rosso) e quindi procedere come nel passaggio 2.1.8 per la gabbia n. 2. NOTA: L'iniezione di CL-316.243 immediatamente dopo una misurazione consente di mantenere il tempo costante tra le iniezioni. Ad esempio, se ci sono 12 topi / gabbie in esecuzione, con misurazioni raccolte in singole gabbie sequenzialmente e la raccolta della durata di 55 s per gabbia, allora dovresti iniettare un topo ogni minuto. Con queste velocità di iniezione, la prima misurazione avverrà dopo 12 minuti dall'iniezione in tutte le 12 gabbie.</li>
		<li>Continuare le misurazioni del dispendio energetico fino a quando i valori di dispendio energetico si stabilizzano per 5-6 misurazioni consecutive, di solito 90-180 minuti dopo l'iniezione. NOTA: I topi potrebbero svegliarsi dall'anestesia durante gli esperimenti. Questi topi devono essere rimossi dall'analisi. Pertanto, testare le dosi di pentobarbital in anticipo aumenterà l'efficienza degli studi.</li>
		<li>Interrompi le misurazioni del dispendio energetico, ma tieni i topi nelle loro gabbie a 30 ° C, fino a quando non si svegliano.</li>
		<li>Dopo che i topi sono completamente svegli, ispeziona la salute dei topi e riportali alle loro gabbie iniziali.</li>
		<li>Esportare i dati di ciascun mouse come file CSV utilizzando il software dell'apparecchiatura, come descritto nella sezione 1.4.13.</li>
	</ol></li>
	<li>Analisi dei dati NOTA: l'analisi dei dati è stata eseguita da Excel o Graphpad<ol>
<li>Traccia i 3-5 valori consecutivi di VO2, VCO2 ed EE che sono stabili e costanti nel tempo, poiché questi sono i valori che rappresentano il tasso metabolico quando i topi sono completamente anestetizzati.</li>
		<li>Quindi, tracciare la prima e le successive misurazioni consecutive di VO2, VCO2 ed EE ottenute dopo l'iniezione. NOTA: I valori assoluti di EE e l'aumento di piega dell'EE indotto dall'iniezione indicano la funzione termogenica del BA7.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Rolfe, D. F., Brown, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+energy+utilization+and+molecular+origin+of+standard+metabolic+rate+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Cellular energy utilization and molecular origin of standard metabolic rate in mammals.</a> Physiological Reviews. 77 (3), 731-758 (1997).</li>
<li>Heymsfield, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+energy+expenditure%3A+advances+in+organ-tissue+prediction+models%5BTitle%5D)+AND+%22Obesity+Reviews%22%5BJournal%5D)">Human energy expenditure: advances in organ-tissue prediction models.</a> Obesity Reviews. 19 (9), 1177-1188 (2018).</li>
<li>Kummitha, C. M., Kalhan, S. C., Saidel, G. M., Lai, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relating+tissue%2Forgan+energy+expenditure+to+metabolic+fluxes+in+mouse+and+human%3A+experimental+data+integrated+with+mathematical+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reports%22%5BJournal%5D)">Relating tissue/organ energy expenditure to metabolic fluxes in mouse and human: experimental data integrated with mathematical modeling.</a> Physiological Reports. 2 (9), 12159(2014).</li>
<li>Tschop, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+analysis+of+mouse+energy+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A guide to analysis of mouse energy metabolism.</a> Nature. 9 (1), 57-63 (2011).</li>
<li>Mina, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CalR%3A+A+Web-Based+Analysis+Tool+for+Indirect+Calorimetry+Experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">CalR: A Web-Based Analysis Tool for Indirect Calorimetry Experiments.</a> Cell Metabolism. 28 (4), 656-666 (2018).</li>
<li>Shum, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ABCB10+exports+mitochondrial+biliverdin%2C+driving+metabolic+maladaptation+in+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">ABCB10 exports mitochondrial biliverdin, driving metabolic maladaptation in obesity.</a> Science Translational Medicine. 13 (594), (2021).</li>
<li>Assali, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NCLX+prevents+cell+death+during+adrenergic+activation+of+the+brown+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">NCLX prevents cell death during adrenergic activation of the brown adipose tissue.</a> Nature Communication. 11 (1), 3347(2020).</li>
<li>Clark, J. D., Gebhart, G. F., Gonder, J. C., Keeling, M. E., Kohn, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Special+Report%3A+The+1996+Guide+for+the+Care+and+Use+of+Laboratory+Animals%5BTitle%5D)+AND+%22ILAR+Journal%22%5BJournal%5D)">Special Report: The 1996 Guide for the Care and Use of Laboratory Animals.</a> ILAR Journal. 38 (1), 41-48 (1997).</li>
<li>Schena, G., Caplan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Everything+You+Always+Wanted+to+Know+about+beta3-AR+%2A+%28%2A+But+were+afraid+to+ask%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Everything You Always Wanted to Know about beta3-AR * (* But were afraid to ask).</a> Cells. 8 (4), 357(2019).</li>
<li>Granneman, J. G., Burnazi, M., Zhu, Z., Schwamb, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((White+adipose+tissue+contributes+to+UCP1-independent+thermogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">White adipose tissue contributes to UCP1-independent thermogenesis.</a> American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 285 (6), 1230-1236 (2003).</li>
<li>Szentirmai, E., Kapas, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+brown+adipose+tissue+in+beta3-adrenergic+receptor+activation-induced+sleep%2C+metabolic+and+feeding+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">The role of the brown adipose tissue in beta3-adrenergic receptor activation-induced sleep, metabolic and feeding responses.</a> Scientific Reports. 7 (1), 958(2017).</li>
</ol>

Gli autori non dichiarano alcun conflitto di interessi a questo documento protocollare. M.L. è co-fondatore e consulente di Enspire Bio LLC.

La calorimetria indiretta è stata utilizzata per anni per valutare il dispendio energetico di tutto il corpo4. Questo protocollo qui descritto fornisce un metodo semplice per misurare il metabolismo basale e determinare la capacità termogenica di BA in vivo utilizzando gabbie metaboliche.
Il metodo della calorimetria indiretta qui descritto conferma che dividere i valori di dispendio energetico per i valori del peso corporeo può essere fuorviante. Ad esempio, p...

Il metabolismo può essere definito come l'integrazione delle reazioni biochimiche responsabili dell'assorbimento, dello stoccaggio, della trasformazione e della rottura dei nutrienti che le cellule usano per crescere e svolgere le loro funzioni. Le reazioni metaboliche trasformano l'energia contenuta nei nutrienti in una forma che può essere utilizzata dalle cellule per sintetizzare nuove molecole ed eseguire il lavoro. Queste reazioni biochimiche sono intrinsecamente inefficienti nel trasformare questa energia in una forma utilizzabile per sostenere la vita1. Tale inefficienza si traduce in dissipazione di energia sotto forma di calore, con questa produzione di calore utilizzata per quantificare il tasso metabolico standard (SMR) di un organismo1. La condizione standard è stata classicamente definita come produzione di calore che si verifica in un adulto sveglio ma a riposo, non ingerendo o digerendo cibo, a termoneutralità e senza alcuno stress1. Il metabolismo basale (BMR) o dispendio energetico basale nei topi è indicato come SMR, ma negli individui che ingeriscono e digeriscono il cibo sotto lieve stress termico (temperature ambiente 21-22 ° C)1. Le sfide e le difficoltà di misurare direttamente la produzione di calore hanno reso la calorimetria indiretta, vale a dire il calcolo della produzione di calore dalle misurazioni del consumo di ossigeno, l'approccio più popolare per determinare il BMR. Il calcolo del BMR dal consumo di ossigeno è possibile perché l'ossidazione dei nutrienti da parte dei mitocondri per sintetizzare l'ATP è responsabile del 72% dell'ossigeno totale consumato in un organismo, con l'8% del consumo totale di ossigeno che si verifica anche nei mitocondri ma senza generare ATP (respirazione disaccoppiata)1. La maggior parte del restante 20% dell'ossigeno consumato può essere attribuita all'ossidazione dei nutrienti in altre posizioni subcellulari (ossidazione degli acidi grassi perossisomiali), ai processi anabolici e alla formazione di specie reattive dell'ossigeno1. Così, nel 1907, Lusk stabilì un'equazione, basata su misurazioni empiriche, ampiamente utilizzata per trasformare il consumo di ossigeno e la produzione di CO2 in dissipazione di energia come calore. Negli esseri umani, il cervello rappresenta ~ 25% del BMR, il sistema muscolo-scheletrico per ~ 18,4%, il fegato per ~ 20%, il cuore per ~ 10% e il tessuto adiposo per ~ 3-7% 2. Nei topi, il contributo tissutale al BMR è leggermente diverso, con il cervello che rappresenta ~ 6,5%, il muscolo scheletrico ~ 13%, il fegato ~ 52%, il cuore ~ 3,7% e il tessuto adiposo ~ 5% 3.
Sorprendentemente, le reazioni biochimiche che definiscono il BMR non sono fisse e cambiano in risposta a diverse esigenze, come il lavoro esterno (attività fisica), lo sviluppo (crescita dei tessuti), gli stress interni (contrastando infezioni, lesioni, turnover dei tessuti) e i cambiamenti nella temperatura ambiente (difesa dal freddo)1. Alcuni organismi reclutano attivamente processi per generare calore nell'esposizione al freddo, il che implica che il calore prodotto dal metabolismo non è solo un sottoprodotto accidentale. Invece, l'evoluzione ha selezionato meccanismi regolatori che potrebbero specificamente sovraregolare la produzione di calore modificando il tasso di reazioni metaboliche1. Pertanto, queste stesse misurazioni del consumo di ossigeno possono essere utilizzate per determinare la capacità di un organismo di generare calore in risposta al freddo.
Due processi principali contribuiscono alla generazione di calore in caso di esposizione al freddo. Il primo è il brivido, che genera calore aumentando la fosforilazione ossidativa mitocondriale e la glicolisi nel muscolo per coprire il lavoro fisico svolto dalla contrazione muscolare involontaria. Pertanto, l'esposizione al freddo aumenterà il consumo di ossigeno nei muscoli1. Il secondo è la termogenesi non da brividi, che si verifica attraverso un aumento del consumo di ossigeno negli adipociti marroni e beige (BA). La dissipazione di energia in calore in BA è mediata dalla proteina di disaccoppiamento mitocondriale 1 (UCP1), che consente il rientro del protone nella matrice mitocondriale, diminuendo il gradiente protonico mitocondriale. La dissipazione del gradiente protonico mitocondriale da parte di UCP1 aumenta la produzione di calore mediante l'elevazione del trasferimento di elettroni e del consumo di ossigeno e l'energia rilasciata dalla dissipazione protonica di per sé senza generare ATP (disaccoppiato). Inoltre, il BA termogenico può reclutare meccanismi aggiuntivi che elevano il consumo di ossigeno senza causare una grande dissipazione nel gradiente protonico, attivando futili cicli di sintesi e consumo ossidativo di ATP. Le gabbie metaboliche qui descritte, ovvero il sistema CLAMS-Oxymax di Columbus Instruments, offrono la possibilità di misurare il dispendio energetico a diverse temperature ambiente. Tuttavia, per determinare la capacità termogenica di BA utilizzando misurazioni del consumo di ossigeno in tutto il corpo, è necessario: (1) eliminare il contributo dei brividi e di altri processi metabolici non BA al dispendio energetico e (2) attivare specificamente l'attività termogenica BA in vivo. Pertanto, un secondo protocollo descrive come attivare selettivamente IL BA in vivo utilizzando la farmacologia in topi anestetizzati a termoneutralità (30 °C), con anestesia e termoneutralità che limitano altri processi termogenici non BA (cioè l'attività fisica). La strategia farmacologica per attivare il BA è il trattamento dei topi con l'agonista del recettore β3-adrenergico CL-316.246. Il motivo è che l'esposizione al freddo promuove una risposta simpatica che rilascia noradrenalina per attivare i recettori β-adrenergici in BA, che attiva UCP1 e ossidazione dei grassi. Inoltre, l'espressione del recettore β3-adrenergico è altamente arricchita nel tessuto adiposo nei topi.

<table><tbody><tr><td>Sistema CLAMS-Oxymax</td><td>Columbus Instruments</td><td>CLAMS-alimentatore centrale-ENC</td><td>Incluso involucro ambientale e sensore di ossigeno in zirconia</td></tr><tr><td>PC desktop con software Oxymax</td><td>HP/Columbus</td><td>N/A</td><td>PC da acquistare separatamente</td></tr><tr><td>Brocca in drierite (solfato di calcio con indicatore di cloruro di cobalto)</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-116681</td><td>Necessaria per asciugare il gas che entra nel sensore di ossigeno, l'umidità può danneggiare il sensore</td></tr><tr><td>NMR per la composizione corporea</td><td>Echo-MRI</td><td>Echo-MRI 100</td><td>Misura la massa magra e grassa nei topi vivi. E' necessario per le analisi ANCOVA.</td></tr><tr><td>CL-316-243</td><td>Sigma</td><td>C5976</td><td>Iniettato ai topi per via sottocutanea per attivare la termogenesi</td></tr><tr><td>Dieta ricca di grassi</td><td>Diete di ricerca</td><td>D12266B</td><td>Fornito ai topi prima e durante le misurazioni</td></tr><tr><td>Pentobarbital/Nembutal</td><td>Farmacia a DLAM</td><td>N/A</td><td>Anestesia per i topi</td></tr><tr><td>Gas primario di grado standard (serbatoio e regolatore)</td><td>Praxair</td><td>NI CD5000O6P-K/PRS 2012-2331-590</td><td>20,50% di ossigeno, 0,50% CO2 bilanciato con azoto utilizzato per la calibrazione</td></tr></tbody></table>

determinazione del dispendio energetico basale e della capacità degli adipociti termogenici di spendere energia nei topi obesi

Determining Basal Energy Expenditure and the Capacity of Thermogenic Adipocytes to Expend Energy in Obese Mice

Le misurazioni del dispendio energetico sono necessarie per capire come i cambiamenti nel metabolismo possono portare all'obesità. Il dispendio energetico basale può essere determinato nei topi misurando il consumo di ossigeno in tutto il corpo, la produzione di CO2 e l'attività fisica utilizzando gabbie metaboliche. Gli adipociti termogenici marrone/beige (BA) contribuiscono in modo significativo al dispendio energetico dei roditori, in particolare a basse temperature ambiente. Qui, le misurazioni del dispendio energetico basale e della capacità totale di BA di spendere energia nei topi obesi sono descritte in due protocolli dettagliati: il primo spiega come impostare il test per misurare il dispendio energetico basale utilizzando l'analisi della covarianza (ANCOVA), un'analisi necessaria dato che il dispendio energetico co-varia con la massa corporea. Il secondo protocollo descrive come misurare la capacità di dispendio energetico di BA in vivo nei topi. Questa procedura prevede l'anestesia, necessaria per limitare la spesa causata dall'attività fisica, seguita dall'iniezione di agonista beta3-adrenergico, CL-316.243, che attiva il dispendio energetico in BA. Questi due protocolli e le loro limitazioni sono descritti in modo sufficientemente dettagliato da consentire un primo esperimento di successo.

La Figura 4 mostra i valori di attività fisica VO2, VCO2, produzione di calore/dispendio energetico (EE), respiratory exchange ratio (RER) e X, Y, Z ottenuti utilizzando le gabbie metaboliche del sistema CLAMS. Il VO2 e VCO2 forniti dal sistema CLAMS è il volume di gas (mL) al minuto e può essere già diviso per il peso corporeo o i valori di massa magra inserendo questi valori di peso nel software CLAMS prima di iniziare le misurazioni. Tuttavia, i...

Questo manoscritto descrive un protocollo per misurare il metabolismo basale e la capacità ossidativa degli adipociti termogenici nei topi obesi.

Determinazione del dispendio energetico basale e della capacità degli adipociti termogenici di spendere energia nei topi obesi

Energy expenditure measurements are necessary to understand how changes in metabolism can lead to obesity. Basal energy expenditure can be determined in ...

Questo protocollo consente a un ricercatore di determinare se ci sono differenze nell'equilibrio energetico dei topi, che possono aiutare a identificare i processi fisiologici responsabili di un cambiamento nel peso corporeo. Può anche essere usato per determinare la capacità del grasso bruno di spendere energia. Questa tecnica quantifica l'ossigeno consumato e la CO2 prodotta da un singolo topo in un ambiente controllato.Consente agli utenti di calcolare il dispendio energetico in questo singolo topo e determinare se diversi trattamenti o manipolazioni genetiche possono modificare il dispendio energetico. Per iniziare, aprire il software che controlla l'involucro e il flusso d'aria e lasciare che il software verifichi la comunicazione del computer con l'apparecchiatura. Una volta stabilita la comunicazione, fare clic su File, quindi aprire configurazione esperimento e selezionare la configurazione dell'esperimento pre-progettata dal fornitore o configurata da un test precedente.Quindi, fai clic su esperimento, quindi fai clic su Proprietà per aprire la finestra delle proprietà dell'esperimento. Nella finestra delle proprietà, impostare i parametri dell'involucro ambientale, tra cui la temperatura ambiente e i cicli di luce di 12 ore. Quindi fare clic su esperimento, seguito da configurazione per aprire la finestra di configurazione dell'esperimento in cui sono definiti i parametri di ciascuna gabbia metabolica.Quindi, aggiungi una quantità pre-pesata di cibo agli alimentatori nelle gabbie metaboliche che ospitano topi femmina di otto settimane. Inoltre, posizionare le bottiglie d'acqua e controllare che le bottiglie siano sigillate correttamente e non perdano. Dopo 24 ore, pesare il cibo rimasto nelle gabbie e pesare i topi.Due o tre giorni dopo che i topi sono stati alloggiati nel sistema, iniziare la calorimetria indiretta e le misurazioni dell'attività. In primo luogo, calibrare il rilevatore a base di ossigeno e zirconia dei sistemi CLAMS utilizzando un gas di calibrazione di composizione nota. Dopo aver acceso e assicurato che la pressione di uscita del serbatoio sia compresa tra 5 e 10 libbre per pollice quadrato, aprire il software di utilità di calibrazione per calibrare e testare i sensori di gas.Fai clic su esperimento, quindi calibra e premi Start. Attendere che i sensori vengano testati e che il software chieda all'utente di ruotare le manopole del sensore di gas fino a quando il valore dell'identità dell'ossigeno è uno. Fare clic su Avanti al termine del passaggio.Dopo aver misurato il peso corporeo e la composizione dei topi, avvia le misurazioni di ossigeno, anidride carbonica e attività facendo clic su sperimenta ed esegui. Dopo un minimo di 48 ore, interrompi l'esperimento facendo clic su Esperimento, quindi interrompi. Per esportare i dati, fai clic su file, quindi esporta ed esporta tutti i soggetti come file CSV.Durante la fase oscura, i topi hanno un maggiore consumo di ossigeno e produzione di anidride carbonica, e quindi hanno un maggiore dispendio energetico. I topi con una dieta regolare e uno stato alimentato con ingestione di cibo che si verifica nel ciclo buio sono caratterizzati da valori di rapporto di scambio respiratorio vicini a uno, indicando una preferenza per l'uso di carboidrati. Durante il ciclo di luce, quando i topi dormono per lo più e quindi velocemente, c'è un passaggio all'ossidazione dei grassi con valori RER più vicini a 0,7.Di conseguenza, l'attività fisica misurata come numero di interruzioni del raggio laser XYZ aumenta durante la fase oscura e diminuisce durante la fase di luce. L'alimentazione dietetica ricca di grassi aumenta il peso corporeo e la massa grassa senza modificare la massa magra. I topi alimentati con dieta ad alto contenuto di grassi mangiavano più chilocalorie al giorno, principalmente a causa della maggiore densità calorica per grammo di cibo.Tuttavia, l'attività fisica è simile tra il chow e i topi nutriti con dieta ricca di grassi anche durante il periodo buio. I valori più bassi del coefficiente respiratorio dei topi alimentati con diete ad alto contenuto di grassi indicano una preferenza per l'uso del grasso come substrato primario per l'ossidazione. Il consumo di ossigeno, ma non la produzione di anidride carbonica, aumenta nei topi alimentati con dieta ricca di grassi, il che si traduce in un aumento significativo del dispendio energetico per topo.Il dispendio energetico è aumentato da un'iniezione di beta-3 agonisti, principalmente a seguito dell'attivazione adrenergica degli adipociti termogenici, che aumenta il consumo di ossigeno, la produzione di anidride carbonica e quindi il dispendio energetico stesso. Per misurare il dispendio energetico con il CLAMS, la calibrazione deve essere completata e il peso corporeo deve essere misurato per eseguire l'analisi ANCOVA. Inoltre, l'assunzione di cibo deve essere misurata sia nel periodo di adattamento che durante le misurazioni.Il periodo di adattamento è finito quando i topi recuperano l'assunzione iniziale di cibo e il peso corporeo. Questa procedura può anche essere utilizzata per testare gli effetti acuti dei farmaci sull'attività e sul comportamento del topo. Usiamo anche questo sistema in uno studio collaborativo che ha dimostrato quale popolazione di neuroni controllata Questa tecnica è essenziale per studiare le malattie legate all'aumento di peso e per identificare i processi che controllano le preferenze nutrizionali, nonché l'attività fisica, la termogenesi e l'equilibrio energetico.

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Biologia

Un metodo di imaging funzionale di tessuto adiposo bruno topo (BAT) è descritto in cui freddo stimolato l'assorbimento di 18F-fluorodesossiglucosio (FDG) in BAT è non invasivo valutata con un protocollo standardizzato micro-PET/CT. Questo metodo è robusto e sensibile per rilevare le differenze nelle attività BAT in modelli murini.

Imaging funzionale del grasso bruno nei topi con FDG micro-PET/CT

Il metodo qui presentata utilizza 18 F-Fluorodeoxyglucose (18 F-FDG) tomografia ad emissione di positroni / tomografia computerizzata (PET-CT) e grasso-acqua separata risonanza magnetica (MRI), ciascuna scansione dopo 2 ore di esposizione a thermoneutral (24 ° C ) e freddo (17 ° C), al fine di mappare tessuto adiposo bruno (BAT) in soggetti umani adulti.

Umano Brown adipose Depositi tessuti segmentato automaticamente da Positron Emission Tomography / tomografia computerizzata e registrati Risonanza Magnetica Images

Questo protocollo descrive il metodo di determinazione della lipolisi basale e forskolin-stimolata nei pastelli grassi inguinali ottenuti dalla normale dieta di chow (NCD) o dieta ad alta percentuale di grassi (HFD) ± capsaicina alimentata da topi selvatici. Come indice per la lipolisi, il rilascio di glicerolo è stato misurato dai placche grasse adipose inguinali.

Misurazione della lipolisi stimolata da Basal e Forskolin nei ghiandoli grassi adiposi inguinali

Questo protocollo descrive l'uso di un analizzatore di composizione corporea e sistema di monitoraggio degli animali metabolica per caratterizzare la composizione corporea e parametri metabolici nei topi. Un modello di obesità indotta alimentando grassi viene utilizzato come esempio per l'applicazione di queste tecniche.

Analisi metabolica ingabbiamento in topi alta Fed grasso e della composizione corporea

La differenziazione degli adipociti bianchi e beige da progenitori vascolari del tessuto adiposo porta il potenziale di miglioramento metabolico nell'obesità. Descriviamo i protocolli per CD34 + CD31 + isolamento di cellule endoteliali da grasso umano e per una successiva in vitro espansione e differenziazione in adipociti bianchi e beige. Diverse applicazioni a valle sono discussi.

Isolamento, espansione e adipogenico induzione di CD34 + CD31 + cellule endoteliali dal tessuto adiposo umano omentale e sottocutaneo

Questo documento fornisce tre saggi facili e accessibili per valutare il metabolismo lipidico nei topi.

Valutazione della capacità di manipolazione dei lipidi di tutto il corpo nei topi

Imaging funzionale e quantificazione di depositi adiposi termogenici nei topi utilizzando un approccio basato sull'imaging micro-PET/MR.

Visualizzazione e quantificazione dei tessuti adiposi marroni e beige nei topi utilizzando [18F]FDG Micro-PET/MR Imaging

Qui, presentiamo un protocollo per quantificare il significato fisiologico dell'impatto dell'attività del tessuto adiposo bruno (BAT) sul metabolismo umano. Ciò si ottiene combinando il carico di carboidrati e la calorimetria indiretta con misurazioni dei cambiamenti sopraclavicolari della temperatura. Questo nuovo approccio può aiutare a sviluppare un bersaglio farmacologico per la termogenesi BAT negli esseri umani.

Utilizzando una combinazione di calorimetria indiretta, termografia a infrarossi e livelli di glucosio nel sangue per misurare la termogenesi del tessuto adiposo bruno nell'uomo

Qui, presentiamo un protocollo per misurare l'attività del tessuto adiposo bruno dopo un pasto negli esseri umani e negli animali da laboratorio.

Termografia a infrarossi per la rilevazione di cambiamenti nell'attività del tessuto adiposo bruno

In questo protocollo, vengono descritti i metodi rilevanti per la metabolomica arterovenosa ottimizzata per BAT utilizzando GC-MS in un modello murino. Questi metodi consentono l'acquisizione di preziose informazioni sullo scambio di metaboliti mediati da BAT a livello di organismo.

Metabolomica arterovenosa per misurare lo scambio di metaboliti in vivo nel tessuto adiposo bruno

Qui presentiamo un protocollo di trapianto di tessuto adiposo bianco e marrone che offre una strategia promettente per invertire la subfertilità, l'obesità e l'iperglicemia, migliorando al contempo la funzione renale nei topi BTBR diabetici e obesi.

Innesti adiposi bianchi e marroni: un approccio per correggere i deficit riproduttivi, metabolici e renali nei topi obesi Black and Tan Brachyury (BTBR)

Impara a misurare il metabolismo basale e la capacità termogenica degli adipociti nei topi obesi con calorimetria indiretta. Questo metodo aiuta a studiare i meccanismi del bilancio energetico e le malattie metaboliche.

Determinazione del dispendio energetico basale e della capacità degli adipociti termogenici di spendere energia nei topi obesi

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