Name: Imaging dal vivo dello stato redox del glutatione mitocondriale nei neuroni primari utilizzando un indicatore raziometrico (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-20T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 47 s
Description: Impara a valutare lo stato redox mitocondriale in tempo reale nei neuroni primari ippocampali e corticali utilizzando la microscopia confocale. Questo protocollo permette di studiare le risposte a perturbazioni acute e strategie terapeutiche.

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Questo lavoro è stato sostenuto dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft (BA 3679/5-1; PER 2289: BA 3679/4-2). A.K. è supportato da una borsa di studio ERASMUS+. Ringraziamo Iris Bünzli-Ehret, Rita Rosner e Andrea Schlicksupp per la preparazione dei neuroni primari. Ringraziamo il Dr. Tobias Dick per aver fornito pLPCX-mito-Grx1-roGFP2. Gli esperimenti mostrati nella Figura 4 sono stati eseguiti presso il Nikon Imaging Center, Università di Heidelberg. La figura 2 è stata preparata con BioRender.com.

<ol><li>Roede, J. R., Go, Y. M., Jones, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redox+equivalents+and+mitochondrial+bioenergetics%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Redox equivalents and mitochondrial bioenergetics.</a> Methods in Molecular Biology. 810, 249-280 (2012).</li>
<li>Turrens, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+formation+of+reactive+oxygen+species%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial formation of reactive oxygen species.</a> Journal of Physiology. 552, Pt 2 335-344 (2003).</li>
<li>Lin, M. T., Beal, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dysfunction+and+oxidative+stress+in+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dysfunction and oxidative stress in neurodegenerative diseases.</a> Nature. 443 (7113), 787-795 (2006).</li>
<li>Manfredi, G., Beal, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+mitochondria+in+the+pathogenesis+of+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Pathology%22%5BJournal%5D)">The role of mitochondria in the pathogenesis of neurodegenerative diseases.</a> Brain Pathology. 10 (3), 462-472 (2000).</li>
<li>Mari, M., Morales, A., Colell, A., Garcia-Ruiz, C., Fernandez-Checa, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+glutathione%2C+a+key+survival+antioxidant%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxidants+%26+Redox+Signaling%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial glutathione, a key survival antioxidant.</a> Antioxidants & Redox Signaling. 11 (11), 2685-2700 (2009).</li>
<li>Murphy, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+thiols+in+antioxidant+protection+and+redox+signaling%3A+distinct+roles+for+glutathionylation+and+other+thiol+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxidants+%26+Redox+Signaling%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial thiols in antioxidant protection and redox signaling: distinct roles for glutathionylation and other thiol modifications.</a> Antioxidants & Redox Signaling. 16 (6), 476-495 (2012).</li>
<li>Dooley, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+dynamic+redox+changes+in+mammalian+cells+with+green+fluorescent+protein+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Imaging dynamic redox changes in mammalian cells with green fluorescent protein indicators.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (21), 22284-22293 (2004).</li>
<li>Hanson, G. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+mitochondrial+redox+potential+with+redox-sensitive+green+fluorescent+protein+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Investigating mitochondrial redox potential with redox-sensitive green fluorescent protein indicators.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (13), 13044-13053 (2004).</li>
<li>Gutscher, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+imaging+of+the+intracellular+glutathione+redox+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Real-time imaging of the intracellular glutathione redox potential.</a> Nature Methods. 5 (6), 553-559 (2008).</li>
<li>Morgan, B., Sobotta, M. C., Dick, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+E%28GSH%29+and+H2O2+with+roGFP2-based+redox+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Biology+%26+Medicine%22%5BJournal%5D)">Measuring E(GSH) and H2O2 with roGFP2-based redox probes.</a> Free Radical Biology & Medicine. 51 (11), 1943-1951 (2011).</li>
<li>Marwick, K. F. M., Hardingham, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfection+in+primary+cultured+neuronal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Transfection in primary cultured neuronal cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1677, 137-144 (2017).</li>
<li>Kohrmann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((convenient%2C+and+effective+method+to+transiently+transfect+primary+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">convenient, and effective method to transiently transfect primary hippocampal neurons.</a> Journal of Neuroscience Research. 58 (6), 831-835 (1999).</li>
<li>Depp, C., Bas-Orth, C., Schroeder, L., Hellwig, A., Bading, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+activity+protects+neurons+against+calcium-mediated+oxidation+and+contraction+of+mitochondria+during+excitotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxidants+%26+Redox+Signaling%22%5BJournal%5D)">Synaptic activity protects neurons against calcium-mediated oxidation and contraction of mitochondria during excitotoxicity.</a> Antioxidants & Redox Signaling. 29 (12), 1109-1124 (2018).</li>
<li>Hauck, B., Chen, L., Xiao, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+and+characterization+of+chimeric+recombinant+AAV+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Generation and characterization of chimeric recombinant AAV vectors.</a> Molecular Therapy. 7 (3), 419-425 (2003).</li>
<li>Brand, M. D., Nicholls, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+mitochondrial+dysfunction+in+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Assessing mitochondrial dysfunction in cells.</a> Biochemical Journal. 435 (2), 297-312 (2011).</li>
<li>Zhang, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+calcium+signaling+controls+expression+of+a+large+gene+pool%3A+identification+of+a+gene+program+for+acquired+neuroprotection+induced+by+synaptic+activity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Nuclear calcium signaling controls expression of a large gene pool: identification of a gene program for acquired neuroprotection induced by synaptic activity.</a> PLoS Genetics. 5 (8), 1000604(2009).</li>
<li>Winterbourn, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+challenges+of+using+fluorescent+probes+to+detect+and+quantify+specific+reactive+oxygen+species+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">The challenges of using fluorescent probes to detect and quantify specific reactive oxygen species in living cells.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1840 (2), 730-738 (2014).</li>
<li>Sies, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+stress%3A+a+concept+in+redox+biology+and+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Redox+Biology%22%5BJournal%5D)">Oxidative stress: a concept in redox biology and medicine.</a> Redox Biology. 4, 180-183 (2015).</li>
<li>Lukyanov, K. A., Belousov, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+fluorescent+redox+sensors%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded fluorescent redox sensors.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1840 (2), 745-756 (2014).</li>
<li>Nietzel, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redox-mediated+kick-start+of+mitochondrial+energy+metabolism+drives+resource-efficient+seed+germination%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Redox-mediated kick-start of mitochondrial energy metabolism drives resource-efficient seed germination.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (1), 741-751 (2020).</li>
<li>Albrecht, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redesign+of+genetically+encoded+biosensors+for+monitoring+mitochondrial+redox+status+in+a+broad+range+of+model+eukaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+Screening%22%5BJournal%5D)">Redesign of genetically encoded biosensors for monitoring mitochondrial redox status in a broad range of model eukaryotes.</a> Journal of Biomolecular Screening. 19 (3), 379-386 (2014).</li>
<li>Albrecht, S. C., Barata, A. G., Grosshans, J., Teleman, A. A., Dick, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+mapping+of+hydrogen+peroxide+and+oxidized+glutathione+reveals+chemical+and+regional+specificity+of+redox+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">In vivo mapping of hydrogen peroxide and oxidized glutathione reveals chemical and regional specificity of redox homeostasis.</a> Cell Metabolism. 14 (6), 819-829 (2011).</li>
<li>Breckwoldt, M. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiparametric+optical+analysis+of+mitochondrial+redox+signals+during+neuronal+physiology+and+pathology+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Multiparametric optical analysis of mitochondrial redox signals during neuronal physiology and pathology in vivo.</a> Nature Medicine. 20 (5), 555-560 (2014).</li>
<li>Ricke, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dysfunction+combined+with+high+calcium+load+leads+to+impaired+antioxidant+defense+underlying+the+selective+loss+of+nigral+dopaminergic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dysfunction combined with high calcium load leads to impaired antioxidant defense underlying the selective loss of nigral dopaminergic neurons.</a> Journal of Neuroscience. 40 (9), 1975-1986 (2020).</li>
<li>Bjornberg, O., Ostergaard, H., Winther, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanistic+insight+provided+by+glutaredoxin+within+a+fusion+to+redox-sensitive+yellow+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Mechanistic insight provided by glutaredoxin within a fusion to redox-sensitive yellow fluorescent protein.</a> Biochemistry. 45 (7), 2362-2371 (2006).</li>
<li>Shokhina, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Red+fluorescent+redox-sensitive+biosensor+Grx1-roCherry%5BTitle%5D)+AND+%22Redox+Biology%22%5BJournal%5D)">Red fluorescent redox-sensitive biosensor Grx1-roCherry.</a> Redox Biology. 21, 101071(2019).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere alcun conflitto di interessi.

Le misurazioni quantitative e dinamiche dello stato redox mitocondriale forniscono importanti informazioni sulla fisiologia mitocondriale e cellulare. Sono disponibili diverse sonde chimiche fluorogeniche che rilevano specie reattive dell'ossigeno, "stress redox" o "stress ossidativo". Tuttavia, questi ultimi termini non sono ben definiti e spesso mancano di specificità9,17,18. Rispetto ai coloranti chimici, Grx1-roGFP2 offre di...

Diversi importanti enzimi mitocondriali e molecole di segnalazione sono soggetti alla regolazione redox del tiolo1. Inoltre, i mitocondri sono una delle principali fonti cellulari di specie reattive dell'ossigeno e sono selettivamente vulnerabili al danno ossidativo2. Di conseguenza, il potenziale redox mitocondriale influenza direttamente la bioenergetica, la segnalazione cellulare, la funzione mitocondriale e, infine, la vitalità cellulare3,4. La matrice mitocondriale contiene elevate quantità (1-15 mM) del glutatione tampone redox tiolo-disolfuro (GSH) per mantenere l'omeostasi redox e montare difese antiossidanti5,6. Il GSH può essere attaccato covalentemente alle proteine bersaglio (S-glutationilazione) per controllarne lo stato redox e l'attività ed è utilizzato da una serie di enzimi disintossicanti che riducono le proteine ossidate. Pertanto, il potenziale redox del glutatione mitocondriale è un parametro altamente informativo quando si studia la funzione mitocondriale e la fisiopatologia.
roGFP2 è una variante della GFP che è stata resa redox-sensibile dall'aggiunta di due ciste esposte in superficie che formano una coppia artificiale ditiolo-disolfuro7,8. Ha un singolo picco di emissione a ~ 510 nm e due picchi di eccitazione a ~ 400 nm e 490 nm. È importante sottolineare che le ampiezze relative dei due picchi di eccitazione dipendono dallo stato redox di roGFP2 (Figura 1), rendendo questa proteina un sensore raziometrico. Nel sensore Grx1-roGFP2, la glutaredossina-1 umana (Grx1) è stata fusa al N-terminus di roGFP29,10. L'attacco covalente dell'enzima Grx1 a roGFP2 offre due importanti miglioramenti del sensore: rende la risposta del sensore specifica per la coppia GSH/GSSG glutatione redox (Figura 1) e accelera l'equilibrio tra GSSG e roGFP2 di un fattore di almeno 100.0009. Pertanto, Grx1-roGFP2 consente l'imaging specifico e dinamico del potenziale redox del glutatione cellulare.
L'imaging Grx1-roGFP2 può essere eseguito su una vasta gamma di microscopi, tra cui microscopi a fluorescenza a campo largo, microscopi confocali a disco rotante e microscopi confocali a scansione laser. L'espressione del sensore nei neuroni primari può essere ottenuta con vari metodi che includono la lipofezione11, la coprecipitazione DNA/calcio-fosfato12, il trasferimento genico mediato da virus o l'uso di animali transgenici come fonte cellulare (Figura 2). Per gli esperimenti in questo articolo sono stati utilizzati virus adeno-associati ricombinanti pseudotipizzati (rAAV) contenenti un rapporto 1:1 delle proteine del capside AAV1 e AAV2 13,14. Con questo vettore, l'espressione massima del sensore viene in genere raggiunta 4-5 giorni dopo l'infezione e rimane stabile per almeno due settimane. Abbiamo utilizzato con successo Grx1-roGFP2 nei neuroni primari dell'ippocampo e corticale di topi e ratti.
In questo articolo, l'espressione mediata da rAAV di Grx1-roGFP2 mirato ai mitocondri nei neuroni primari dell'ippocampo e corticale del ratto viene utilizzata per valutare lo stato redox del glutatione mitocondriale basale e la sua perturbazione acuta. Viene fornito un protocollo per l'imaging confocale dal vivo con istruzioni dettagliate su come (i) ottimizzare le impostazioni del microscopio confocale a scansione laser, (ii) eseguire un esperimento di imaging dal vivo e (iii) analizzare i dati con FIJI.

<table><tbody><tr><td><reagenti>forti</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di calcio (CaCl2&middot; 2H2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3306</td><td></td></tr><tr><td>Diamide (DA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D3648</td><td></td></tr><tr><td>Ditiotreitolo (DTT)</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>6908.1</td><td></td></tr><tr><td>Glucosio (2,5 M soluzione madre)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8769</td><td></td></tr><tr><td>Glucosio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>Glicina</td><td>neoFroxx GmbH</td><td>LC-4522.2</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1 soluzione madre M)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di magnesio (MgCl2&middot; 6H2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>442611-M</td><td></td></tr><tr><td>N-metil-D-aspartato (NMDA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3262</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di potassio (KCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di sodio (NaCl)</td><td>neoFroxx GmbH</td><td>LC-5932.1</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato di sodio (0,1 M soluzione madre)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8636</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato di sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8574</td><td></td></tr><tr><td>Saccarosio</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>4621.1</td><td></td></tr><tr><td>Perclorato di estere etilico tetrametilrodamina (TMRE)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>87917</td><td></td></tr><tr><td>equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>imaging chamber</td><td>Life Imaging Services (Basilea, Svizzera)</td><td>10920</td><td>Camera Ludin Tipo 3 per & Oslash; Vetrini coprioggetti da 12 mm</td></tr><tr><td>, microscopio Confocale a scansione laser</td><td>Leica</td><td>DMI6000</td><td></td></tr><tr><td>, unità di scansione,</td><td></td> pompa peristaltica <td>VWR</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>PP1080 181-4001</td><td></td></tr>, <tr><td>microscopio confocale a disco rotante</td><td>Hamamatsu</td><td>C9100-02, EMCCD</td><td></td></tr><tr><td>, microscopio confocale a disco rotante, sistema di incubazione</td><td>TokaiHit</td><td>INU-ZILCF-F1</td><td></td></tr>, <tr><td>microscopio a disco rotante, microscopio,</td><td>microscopio</td><td></td><td>Nikon</td> Ti</tr><tr><td>, microscopio confocale a disco rotante, unità di scansione</td><td>Yokagawa</td><td>CSU-X1</td><td></td></tr><tr><td>software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FIJI</td><td></td><td>https://fiji.sc</td><td></td></tr><tr><td>StackReg plugin</td><td></td><td></td><td></td>https://github.com/fiji-BIG/StackReg/blob/master/src/main/java/StackReg_.java</tr><tr><td>Plug-in</td><td></td> TurboReg <td>https://github.com/fiji-BIG/TurboReg/blob/master/src/main/java/TurboReg_.java</td><td></td></tr></tbody></table>

imaging dal vivo dello stato redox del glutatione mitocondriale nei neuroni primari utilizzando un indicatore raziometrico

Live Imaging of the Mitochondrial Glutathione Redox State in Primary Neurons using a Ratiometric Indicator

L'omeostasi redox mitocondriale è importante per la vitalità e la funzione neuronale. Sebbene i mitocondri contengano diversi sistemi redox, il glutatione tampone redox tiolo-disolfuro altamente abbondante è considerato un attore centrale nelle difese antiossidanti. Pertanto, la misurazione del potenziale redox del glutatione mitocondriale fornisce informazioni utili sullo stato redox mitocondriale e sullo stress ossidativo. La glutaredossina1-roGFP2 (Grx1-roGFP2) è un indicatore raziometrico basato su proteine fluorescenti verdi (GFP) geneticamente codificate del potenziale redox del glutatione che ha due picchi di eccitazione sensibili allo stato redox a 400 nm e 490 nm con un singolo picco di emissione a 510 nm. Questo articolo descrive come eseguire la microscopia confocale dal vivo di Grx1-roGFP2 mirato ai mitocondri nei neuroni primari dell'ippocampo e corticale. Descrive come valutare il potenziale redox del glutatione mitocondriale allo stato stazionario (ad esempio, per confrontare stati patologici o trattamenti a lungo termine) e come misurare i cambiamenti redox sui trattamenti acuti (usando il farmaco eccitotossico N-metil-D-aspartato (NMDA) come esempio). Inoltre, l'articolo presenta la co-imaging di Grx1-roGFP2 e l'indicatore del potenziale di membrana mitocondriale, tetrametilrodramina, estere etilico (TMRE), per dimostrare come Grx1-roGPF2 può essere multiplexato con indicatori aggiuntivi per analisi multiparametriche. Questo protocollo fornisce una descrizione dettagliata di come (i) ottimizzare le impostazioni del microscopio a scansione laser confocale, (ii) applicare farmaci per la stimolazione seguiti dalla calibrazione del sensore con diammide e ditiotreitolo e (iii) analizzare i dati con ImageJ / FIJI.

Quantificazione delle differenze nello stato redox mitocondriale allo stato stazionario dopo la sospensione del fattore di crescita Per dimostrare la quantificazione delle differenze allo stato stazionario nello stato redox mitocondriale, i neuroni primari cresciuti in mezzo standard sono stati confrontati con i neuroni coltivati senza fattori di crescita per 48 ore prima dell'imaging. L'astinenza del fattore di crescita provoca la morte delle cellule neuronali apoptotiche dopo 72 h1...

Questo articolo descrive un protocollo per determinare le differenze nello stato redox basale e le risposte redox alle perturbazioni acute nei neuroni primari dell'ippocampo e corticale utilizzando la microscopia confocale dal vivo. Il protocollo può essere applicato ad altri tipi di cellule e microscopi con modifiche minime.

Imaging dal vivo dello stato redox del glutatione mitocondriale nei neuroni primari utilizzando un indicatore raziometrico

Mitochondrial redox homeostasis is important for neuronal viability and function. Although mitochondria contain several redox systems, the highly abundant ...

Questo metodo consente di indagare su come lo stato redox mitocondriale è influenzato in condizioni fisiopatologiche. Può anche essere utilizzato per valutare l'efficacia delle strategie di trattamento che mirano a proteggere i mitocondri. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente una valutazione organica e specifica dei cambiamenti dinamici e di tracciamento sullo stato redox dei mitocondri in tempo reale.Questo metodo può essere combinato con indicatori aggiuntivi per registrare simultaneamente, ad esempio, il potenziale di membrana mitocondriale o le concentrazioni di calcio oltre allo stato redox. Questo protocollo può essere applicato a cellule di coltura, espianti tissutali e colture di fette. Inizia ottimizzando le impostazioni del microscopio confocale a scansione.Per fare ciò, impostare il rilevatore a 12 bit o 16 bit, attivare la modalità di scansione sequenziale e aggiungere una seconda sequenza / traccia. Per entrambi i canali, selezionare una tabella di ricerca a pseudo colori che indichi i pixel sovra e sottoesposti, quindi selezionare un obiettivo adatto all'oggetto di interesse. Montare un coverslip con le cellule nella camera di imaging.Aggiungere un millilitro di tampone di imaging e posizionare la camera sul microscopio. Utilizzare l'oculare e la luce trasmessa per mettere a fuoco le cellule. Registra immagini con diversi formati di pixel e dimensioni stenopeiche.Quindi registrare immagini con diverse intensità laser e di conseguenza regolare il guadagno e la soglia del rilevatore. Infine, registra immagini con diverse velocità di scansione e diversi numeri di medie dei fotogrammi. Per l'imaging dal vivo, impostare l'intervallo di timelapse su 30 secondi e la durata su 25 minuti.Quindi montare le cellule, posizionare la camera sul microscopio e focalizzare le cellule come dimostrato in precedenza. Passare alla modalità di scansione e utilizzare il canale a 488 nanometri nella vista dal vivo per mettere a fuoco e individuare le celle per l'imaging. Facoltativamente, per aumentare il numero di celle registrate per esecuzione, utilizzare la funzione multipunto per visualizzare due o tre campi visivi per copertina.Avviare l'acquisizione del timelapse e registrare cinque immagini come registrazione di base di due minuti. Aggiungere 500 microlitri di soluzione NMDA 3X alla camera per raggiungere la concentrazione finale di 30 micromolari e registrare ulteriori 20 immagini come risposta NMDA di 10 minuti. Quindi, aggiungere 500 microlitri di soluzione 4X DA alla camera e registrare altre sei immagini.Aspirare il tampone dalla camera di imaging e sostituirlo con un millilitro di soluzione DTT. Dopo aver registrato altre 10 immagini, terminare la registrazione e salvare la serie di immagini. Per importare i dati nel software di analisi delle immagini, fare clic su plug-in, selezionare i formati bio e quindi l'importatore di formati bio.Nella finestra di dialogo, scegliete hyperstack nello stack di viste con, impostate la modalità colore come predefinita e selezionate ridimensionamento automatico. Modificare il formato dell'immagine a 32 bit facendo clic sull'immagine, selezionando tipo, quindi dalle opzioni scegliere 32 bit. Per dividere i canali di colore in finestre separate, fare clic sull'immagine, andare a colorare e selezionare i canali divisi.Regolare la soglia per selezionare i mitocondri per l'analisi facendo clic sull'immagine, selezionando regola e soglia. Nella finestra di dialogo, selezionare lo sfondo scuro rosso predefinito e l'istogramma della pila. Quando i pixel selezionati appaiono rossi, fare clic su Applica.Quindi selezionare Imposta pixel di sfondo su NAN elaborare tutte le immagini ed eseguire la stessa procedura per il canale due. Per visualizzare il rapporto da 405 a 488 nanometri, creare un'immagine di rapporto facendo clic su processo e calcolatrice di immagini. Nella finestra di dialogo, selezionare il canale uno nell'immagine uno dividere nel canale operativo due nell'immagine due.Quindi selezionare Crea nuova finestra ed elaborare tutte le immagini. Modificare la tabella di ricerca del rapporto immagine in pseudo colore facendo clic sull'immagine, selezionando tabelle di ricerca e quindi attivare. Per analizzare l'immagine, disegnare ROI attorno a singole cellule o mitocondri sull'immagine del rapporto.Per aggiungere i ROI a ROI manager, vai ad analizzare, fai clic sugli strumenti, seleziona ROI manager, fai clic su aggiungi e seleziona mostra tutto. Per misurare i rapporti da 405 a 488 nanometri delle singole celle, fare clic su ROI manager, selezionare tutti i ROI premendo Ctrl A, andare su altro e selezionare multi-misura. Nella finestra di dialogo, selezionate Misura tutte le sezioni e una riga per sezione.Dopo aver esportato le misurazioni nel software del foglio di calcolo, selezionare l'immagine a 405 nanometri, misurare le intensità di tutti i ROI ed esportare nuovamente le misurazioni nel software del foglio di calcolo. Allo stesso modo, misurare le intensità roi dell'immagine a 488 nanometri. Per salvare i ROI per riferimento futuro, selezionare tutti i ROI premendo Ctrl A, andare su altro e selezionare Salva.Queste istantanee rappresentative da una registrazione timelapse mostrano immagini di rapporto dei neuroni prima e dopo il trattamento NMDA e dopo la calibrazione max / min con DA e DTT. Il trattamento dei neuroni con 30 NMDA micromolari ha indotto l'ossidazione dei mitocondri in pochi minuti. L'analisi dei singoli canali di fluorescenza ha rivelato che l'acidosi mitocondriale indotta da NMDA ha causato una caduta della fluorescenza GFP sia all'eccitazione di 405 che a 488 nanometri.In un esperimento di controllo, il pretrattamento con DA ha precluso qualsiasi ulteriore ossidazione dei mitocondri da parte di NMDA. E di conseguenza, il rapporto 405 a 488 non è cambiato nonostante una notevole tempra dell'intensità di fluorescenza GFP2 redox-sensibile. Questo esperimento ha confermato che il rapporto tra 405 e 488 nanometri non è influenzato dai cambiamenti di pH.In un esperimento separato, il potenziale di membrana mitocondriale, lo stato redox e la morfologia sono stati valutati in parallelo. Il trattamento dei neuroni con NMDA 60 micromolari ha provocato la perdita del segnale tetrametilrodramina o TMRE e un aumento del rapporto rho GFP da 405 a 488 nanometri seguito da un arrotondamento ritardato dei mitocondri. Quando si inizia a utilizzare questo metodo, è molto importante dedicare del tempo per ottimizzare attentamente le impostazioni microscopiche.Questo aiuterà a mantenere i neuroni sani durante i tuoi esperimenti. È anche molto importante rispettare sempre le regole di sicurezza laser. Assicurati di non essere esposto alle radiazioni laser quando aggiungi farmaci da manomettere durante le registrazioni dal vivo.

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Noi descriviamo un protocollo che permette l'imaging di mitocondri in vita i neuroni tramite microscopia a fluorescenza su durate lunghe. Imaging per lunghi periodi si realizza attraverso lentivirus-mediata espressione di una proteina fluorescente mitocondri mirata e l'uso di un poco costoso stadio-top incubatore che è stato progettato e costruito nel nostro laboratorio.

Neuromodulazione e mitocondriale di trasporto: Imaging Live in neuroni dell&#39;ippocampo oltre durate a lungo

Dimostriamo applicazione del indicatore di fluorescenza, TMRM, nei neuroni corticali per determinare le variazioni relative a TMRM intensità di fluorescenza, prima e dopo l'applicazione di uno stimolo specifico. Mostriamo anche l'applicazione della sonda di fluorescenza...

Determinazione della mitocondriale Oxygen Species potenziale di membrana e reattiva in neuroni corticali di ratto dal vivo

Fonte: Katsalifis, A., et al. Imaging dal vivo dello stato redox del glutatione mitocondriale nei neuroni primari utilizzando un indicatore raziometrico. J. Vis. Exp. (2021)Questo video mostra l'imaging dello stato redox mitocondriale nei neuroni primari utilizzando un indicatore fluorescente raziometrico. Applicando due lunghezze d'onda di eccitazione al microscopio a fluorescenza, viene misurato il rapporto di intensità della fluorescenza per valutare l'ossidazione mitocondriale. Il...

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Descriviamo l'uso di due raziometrici, biosensori geneticamente codificati, che si basano sulla GFP, per monitorare lo stato redox mitocondriale e livelli di ATP a risoluzione subcellulare in vita cellule di lievito.

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La microscopia confocale a scansione viene applicato per l'imaging eventi mitocondriali singoli in cuore perfuso o muscoli scheletrici in animale vivo. Monitoraggio in tempo reale dei processi mitocondriali singoli, come vampate di superossido e di membrana potenziali fluttuazioni consente la valutazione della funzione mitocondriale in un contesto fisiologicamente rilevanti e durante le perturbazioni patologiche.

Imaging confocale delle singole mitocondriali superossido illumina di cuore intatto o In Vivo

Il trasporto mitocondriale alterato e la morfologia sono coinvolti in varie malattie neurodegenerative. Il protocollo presentato utilizza neuroni del prosencefalo derivati da cellule staminali pluripotenti indotte per valutare il trasporto mitocondriale e la morfologia nella paraplegia spastica ereditaria. Questo protocollo consente la caratterizzazione del traffico mitocondriale lungo gli assoni e l'analisi della loro morfologia, che faciliterà lo studio delle malattie neurodegenerative.

Analisi del trasporto mitocondriale e della morfologia nei neuroni derivati dalle cellule staminali indotte dall'uomo in paraplegia ereditaria

Questo proctocollo mira a fornire un metodo per l'imaging mitocondriale In vitro e in vivo Ca2+ in astrociti e neuroni.

Imaging Dell'assorbimento mitocondriale di Ca2+ in astrociti e neuroni utilizzando indicatori Ca2+ geneticamente codificati (GECI)

Questo articolo descrive il metodo per l'imaging time-lapse mitocondriale di colture di astrociti dotate di biosensore MitoTimer e la conseguente analisi multiparametrica della dinamica mitocondriale, della mobilità, della morfologia, della biogenesi, dello stato redox e del turnover.

Live-imaging del sistema mitocondriale in astrociti in coltura

Questa tecnica descrive un flusso di lavoro efficace per visualizzare e misurare quantitativamente il potenziale della membrana mitocondriale e i livelli di superossido all'interno delle cellule HeLa utilizzando l'imaging dal vivo basato sulla fluorescenza.

Quantificazione basata sulla fluorescenza del potenziale di membrana mitocondriale e dei livelli di superossido utilizzando l'imaging dal vivo nelle cellule HeLa

In questo video, dimostriamo la visualizzazione di traslocazione della PKC nelle cellule viventi utilizzando PKCS fluorescente tag.

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Impara a valutare lo stato redox mitocondriale in tempo reale nei neuroni primari ippocampali e corticali utilizzando la microscopia confocale. Questo protocollo permette di studiare le risposte a perturbazioni acute e strategie terapeutiche.

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