Caenorhabditis elegans come sistema modello per la scoperta di composti bioattivi contro la neurotossicità mediata dalla poliglutammina

Come potente modello animale negli studi neurodegenerativi e comportamentali, C.elegans può essere usato per selezionare e valutare in modo efficiente i composti tossici contro la neurotossicità della poliglutammina usando modelli simili alla malattia di Huntington. Il vantaggio principale di questa tecnica è la profilazione e l'integrazione di fenotipi multipli in diversi modelli di C.elegans. Anche in realtà come i modelli di C.elegans sono usati in questo metodo.

Fornisce dimensioni nello screening e nella ricerca di candidati terapeutici per altri ritardi neurodegenerativi e in effetti altri ritardi. Si prega di prestare attenzione alle temperature utilizzate nella crescita di C.elegans ed eseguire il test nelle giuste fasi di sviluppo namica. A dimostrare la procedura saranno Jiang Yiyi, Xioa Yue e Wang Qiangqiang, tre studenti laureati.

Inizia trasferendo da 300 a 500 larve L1 sincronizzate di nematodi AM141 in ciascun pozzetto di una piastra da 48 pozzetti con 500 microlitri di mezzo S contenente ceppo OP50 di E.coli e cinque milligrammi per millilitro di astragalan. Sigillare la piastra con parafilm e incubare a 20 gradi Celsius e 120 rotazioni al minuto per gli intervalli di tempo desiderati. Trasferire i nematodi in una provetta sterile da microcentrifuga da 1,5 millilitri e lavare con tampone M9 tre volte mediante centrifugazione per rimuovere le cellule OP50 rimanenti.

Quindi, risospendere i nematodi AM141 nel tampone M9. Ora, trasferire da 10 a 15 nematodi in ciascun pozzetto in una piastra da 384 pozzetti, impostando 10 pozzetti replicati per ogni trattamento e aggiungere 10 microlitri di azoturo di sodio 200 millimolari a ciascun pozzetto per paralizzare i nematodi consentendo loro di depositarsi sul fondo. Posizionare la lastra in un sistema di imaging ad alto contenuto per acquisire immagini fluorescenti.

Aprire il software di acquisizione delle immagini e impostare i parametri menzionati nel manoscritto di testo. Analizzare i dati dell'immagine aprendo la finestra dei dati della piastra di revisione e selezionando la piastra di prova per l'analisi delle immagini. Fare doppio clic su un pozzetto di prova per visualizzarne l'immagine.

Quindi selezionare i nuclei di conteggio come metodo di analisi e fare clic sul pulsante configura impostazioni. Definire l'immagine sorgente dal canale FITC e selezionare l'algoritmo standard. Impostare i parametri di analisi dell'immagine come descritto nel testo manoscritto e testarli per ottimizzare il metodo di analisi.

Salvare le impostazioni ed eseguire l'analisi su tutti i pozzi. Esportare i nuclei totali come numero totale di aggregati Q40:YFP in ciascun pozzetto. Contare il numero di nematodi in ciascun pozzetto e calcolare il numero medio di aggregati Q40:YFP per nematode in ciascun gruppo.

Quindi, calcola l'indice di inibizione. Per preparare i nematodi per il test di neurotossicità polyQ, trasferire da 300 a 500 larve L1 sincronizzate di nematodi HA759 in ciascun pozzetto di una piastra a 48 pozzetti con 500 microlitri di terreno S contenente ceppo OP50 di E.coli e cinque milligrammi per millilitro di astragalan. Dopo aver sigillato le piastre, incubare, raccogliere e risospendere i nematodi nel tampone M9 come dimostrato in precedenza.

Ora, preparare in agarosio pad aggiungendo due grammi di agarosio a 100 millilitri di tampone M9 e riscaldare la soluzione in un forno a microonde fino quasi all'ebollizione. Erogare 0,5 millilitri di agarosio fuso al centro di un vetrino di microscopia di un millimetro di spessore posto tra due pezzi di lastre di vetro spesse due millimetri, coprendo con un altro vetrino verticalmente. Rimuovere delicatamente il vetrino superiore una volta che l'agarosio si raffredda e si solidifica.

Iniziare il test di sopravvivenza neuronale ASH aggiungendo una goccia di azoturo di sodio 20 millimolari sul tampone agros e quindi trasferendo da 15 a 20 nematodi HA759 nella goccia per immobilizzarli. Posizionare delicatamente una linguetta di copertura sui nematodi. Ora, tieni il vetrino sotto un microscopio a fluorescenza dotato di una fotocamera digitale.

Selezionare una lente obiettivo 40x e un filtro FITC per rilevare i neuroni ASH GFP positivi nella regione della testa dei nematodi. Selezionare più di 50 nematodi in ciascun gruppo in modo casuale per contare il numero di nematodi con neuroni ASH bilaterali marcati con GFP nella loro regione della testa, quindi calcolare il tasso di sopravvivenza dei neuroni ASH. Per il test di evitamento osmotico, dividere una piastra NGM priva di cibo in zone normali e trappola creando una linea di glicerolo a otto molari nel mezzo.

Quindi, distribuire una linea di azoturo di sodio di 200 millimolari a circa un centimetro di distanza dalla linea del glicerolo per paralizzare i nematodi che attraversano la barriera del glicerolo nella zona della trappola. Trasferire circa 200 nematodi ciascuno sulla zona normale di tre placche replicate per ciascun gruppo. Quindi, aggiungere una goccia di 1% butanedione sulla zona trappola per attirare i nematodi.

Coprire immediatamente il coperchio della capsula di Petri e incubare a 23 gradi Celsius per 90 minuti. Segna il numero di nematodi su entrambe le zone al microscopio e calcola l'indice di evitamento. Il ceppo transgenico polyQ AM141 esprime fortemente le proteine di fusione Q40:YFP nelle cellule muscolari della parete corporea, identificate da questo protocollo automatizzato di imaging e analisi, la cui quantità crescente è stata inibita dal trattamento con astragalano dimostrando il suo potenziale protettivo.

Una perdita di fluorescenza GFP e neuroni ASH bilaterali nelle regioni della testa dei nematodi indica la morte neuronale ASH. Questo test di sopravvivenza neuronale ASH può essere utilizzato per valutare visivamente l'effetto neuroprotettivo dei composti in esame sui neuroni dell'eleganza di Caenorhabditis. Il test di evitamento chemiosensoriale è stato utilizzato per esaminare i campioni di test efficaci sulla perdita funzionale dei neuroni ASH mediata dall'aggregazione polyQ.

L'indice di evitamento dei nematodi HA759 trattati con astragalano a 15 gradi Celsius per tre giorni è aumentato a più di 0,6, dimostrando un effetto neuroprotettivo del polisaccaride contro i disturbi comportamentali. Per valutare la capacità neuroprotettiva complessiva dei composti in esame, i dati dei singoli saggi sono stati integrati e presentati come un grafico radar che mostra l'area del triangolo nel gruppo di trattamento con astragalano maggiore di quella del gruppo di controllo, indicando gli effetti anti-polyQ del polisaccaride. Si prega di tenere presente che il cibo, la temperatura e l'umidità possono influenzare il loro comportamento di C.elegans.