Name: In vivo Controllo optogenetico wireless del comportamento motorio qualificato (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-11-22T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 52 s
Description: Scopri il controllo optogenetico wireless del comportamento motorio qualificato nei topi. Questo metodo combina videografia ad alta velocità per analizzare i circuiti neurali coinvolti nel controllo motorio fine.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Questo lavoro è stato sostenuto dal progetto UNAM-PAPIIT IA203520. Ringraziamo la struttura per animali IFC per il loro aiuto nella manutenzione delle colonie di topi e l'unità computazionale per il supporto IT, in particolare a Francisco Perez-Eugenio.

Le procedure che coinvolgono l'uso degli animali sono state condotte seguendo le linee guida locali e nazionali e approvate dal corrispondente Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali (Istituto di fisiologia cellulare protocollo IACUC VLH151-19). Nel protocollo corrente sono stati utilizzati topi maschi transgenici Drd1-Cre27, 35-40 giorni postnatali con background C57BL/6. I topi sono stati tenuti nelle seguenti condizioni: temperatura 22±1 °C; umidità 55%; orario luci 12/12 h con luci spente alle 19:00 e sono stati svezzati al giorno postnatale 21. I cuccioli svezzati erano ospitati in gruppi dello stesso sesso di 2-5. Gli animali sono stati alloggiati in alloggi statici con piani di micro-barriera. La biancheria da letto consisteva in trucioli di pioppo sterile. I pellet di roditori e l'acqua purificata da RO sono stati forniti ad libitum, tranne quando indicato.
1. Procedure chirurgiche
<ol><li>Preparare una cannula LED alla lunghezza desiderata secondo le coordinate dorsoventrali della struttura di interesse (idealmente 0,5 mm in più per tenere conto dello spessore del cranio, per lo striato dorsolaterale 3,5 mm) (Figura 1).<ol>
<li>Tagliare la fibra di vetro a una lunghezza superiore alla dimensione finale desiderata, macinare la punta della fibra alla lunghezza target con carta vetrata ruvida e, infine, lucidare la punta della fibra con carta vetrata fine. NOTA: La cannula LED è una fibra ottica di vetro di 250 μm di diametro collegata ad un ricevitore a infrarossi (vedi Tabella dei Materiali).</li>
	</ol></li>
	<li>Tirare le pipette di vetro (diametro esterno di 1,14 mm, diametro interno di 0,53 mm e lunghezza di 3,5 mm) per il nanoiniettore con un estrattore orizzontale (vedere Tabella dei materiali) e conservarle per dopo. Programmare l'estrattore in un unico anello per ottenere un diametro della punta di 15-20 μm con un lungo cono di pendenza graduale (4-5 mm).</li>
	<li>Preparare l'area chirurgica disinfettando accuratamente l'apparato stereotassico, il cappuccio, il microiniettore (vedi Tabella dei materiali) e le superfici circostanti con etanolo al 70%. NOTA: Un apparato stereotassico del mouse è essenziale per iniettare con precisione Adeno Associated Virus (AAV) e posizionare la cannula LED nella regione di interesse.</li>
	<li>Indossare i dispositivi di protezione individuale appropriati per la procedura, tra cui un cappotto da laboratorio pulito o un camice chirurgico monouso, guanti sterili, maschera facciale e copricapo monouso.</li>
	<li>Posizionare l'attrezzatura necessaria vicino all'area chirurgica, come strumenti chirurgici sterili, punte di cotone, soluzioni, micropipette, punte di pipette, capillari, micro-riempimento con olio minerale e pennarello.</li>
	<li>Riempire una pipetta per microiniezioni con olio minerale e posizionarla nel microiniettore. Assicurarsi che il microiniettore funzioni correttamente espellendo un po 'di olio minerale. NOTA: Tutti gli strumenti utilizzati durante l'intervento devono essere autoclavati e sterili. Dovrebbe essere usata la tecnica asettica.</li>
	<li>Anestetizzare gli animali con isoflurano gassoso 4-5% per indurre anestesia e 1,2% durante l'intervento chirurgico con 0,5-1 L/min di ossigeno puro. L'intervento inizia solo dopo che l'animale ha raggiunto un punto di anestesia profonda, valutato dall'assenza di ritiro della zampa dopo un leggero pizzico.<ol>
<li>Monitorare continuamente la frequenza respiratoria e la temperatura dell'animale. Mantenere la temperatura corporea con una piastra riscaldante impostata a 34 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Applicare un unguento oftalmico. Rimuovere i peli dal cuoio capelluto con un trimero e una crema per la depilazione. Pulire il cuoio capelluto con tamponi di cotone con l'8% di povidone-iodio (vedi Tabella dei materiali) e il 70% di etanolo alternati tre volte ciascuno.</li>
	<li>Posizionare il mouse nell'apparato stereotassico e fissare la testa, assicurandosi che il cranio sia livellato negli assi mediolaterale e anteriore-posteriore.</li>
	<li>Fai un'incisione di 1 cm con un bisturi attraverso il cuoio capelluto a livello degli occhi lungo l'asse sagittale. Ritrarre la pelle per esporre il cranio e pulire il periostio con tamponi di cotone.</li>
	<li>Pulire la superficie del cranio con soluzione salina e tamponi di cotone sterili. Risolvere eventuali emorragie in superficie utilizzando lance oculari assorbenti sterili (vedere Tabella dei materiali) o materiale assorbente sterile simile.</li>
	<li>Applicare una goccia di perossido di idrogeno al 2,5% con un batuffolo di cotone e lasciarlo agire per alcuni secondi per rendere visibili le suture del cranio e avere un riferimento migliore. Dopo alcuni secondi, pulire accuratamente con un batuffolo di cotone pulito.</li>
	<li>Con la pipetta di vetro (diametro finale della punta di 15 μm), individuare bregma e lambda per verificare che il cranio sia livellato nell'asse anteriore-posteriore. NOTA: Si consiglia di avere un microscopio stereoscopico o un microscopio USB per vedere la punta della pipetta di vetro. Nel caso in cui sia necessario, regolare l'altezza del supporto della bocca per livellare il cranio.</li>
	<li>Spostare il capillare verso le coordinate anteriore-posteriore (AP) e mediale-laterale (ML) selezionate (striato dorsolaterale AP 1,2 mm, ML 2,28 mm). Dipingete un punto di riferimento nel cuoio capelluto sopra le coordinate selezionate con un marcatore sterile.</li>
	<li>Nel punto di riferimento, eseguire una craniotomia di circa 1 mm di diametro applicando una leggera pressione al cranio con un utensile rotante sterile o un trapano dentale a velocità medio-bassa con una piccola punta da trapano dentale rotonda (vedere Tabella dei materiali).</li>
	<li>Caricare il capillare con 300-400 nL di virus adeno-associato credipendente (AAV) come AAV1-dflox-hChR-2-mCherry per esprimere Channelrhodopsin o un AAV per esprimere solo la proteina reporter (ad esempio, mCherry) come controllo nella regione di interesse (vedere Tabella dei materiali). Verificare che la punta non sia intasata, quindi introdurre la pipetta di vetro nel cervello alle coordinate dorso-ventrali (DV) desiderate (striato dorsolaterale DV -3,35 mm).<ol>
<li>Iniettare 200 nL utilizzando un iniettore automatico ad una velocità di 23 nL/s. Attendere 10 minuti dopo aver terminato l'iniezione, prelevare lentamente la pipetta di vetro per evitare fuoriuscite. NOTA: È possibile utilizzare un ago da 30 G per iniettare con l'apposito microiniettore.</li>
	</ol></li>
	<li>Pulire e asciugare eventuali residui con tamponi di cotone.</li>
	<li>Collegare la cannula LED in vetro sterile al braccio stereotassico e calibrare le coordinate utilizzando bregma come riferimento. Inserire la cannula molto lentamente (300 μm/min) per evitare danni ai tessuti e posizionarla a 100 μm sopra il sito di iniezione.</li>
	<li>Una volta che la cannula LED è in posizione, aggiungere una goccia (100 μL) di adesivo tissutale sul bordo della craniotomia.</li>
	<li>Preparare la miscela di cemento dentale (vedere Tabella dei materiali) seguendo le istruzioni del produttore per fissare la fibra al cranio. NOTA: Brevemente, utilizzare un piatto di porcellana refrigerato per avere più tempo di lavoro prima dei set di cemento. Aggiungere 2 misurini di polvere trasparente di resina al piatto di porcellana, aggiungere 4 gocce di base rapida e 1 goccia di catalizzatore, quindi mescolare bene. Il rapporto polvere/liquido può essere regolato se è necessaria una viscosità più sottile o più spessa.</li>
	<li>Usando un pennello sterile, applicare la miscela di cemento dentale attorno al connettore della cannula a poco a poco, costruendo strati fino a quando il cranio è coperto e il connettore è fissato saldamente al cranio, lasciando i perni completamente liberi. Evitare di ottenere cemento dentale sulla pelle del mouse.</li>
	<li>Lasciare asciugare completamente.</li>
	<li>Chiudere la pelle intorno all'impianto utilizzando adesivo tissutale (vedere Tabella dei materiali).</li>
	<li>Posizionare il mouse in una gabbia di recupero sopra una piastra riscaldante a 33 ° C. Monitorare la presenza di uno o più dei seguenti segni di dolore / disagio: 1) Curvo, mancanza o riduzione dell'attività motoria, 2) Mancata toelettatura riflessa in un cappotto sporco non tenuto, 3) Eccessiva leccatura o graffio, arrossamento nel sito di incisione, 4) comportamento aggressivo, 5) anoressia o disidratazione e 6) Mancanza di formazione del nido. NOTA: Tenere il mouse ingabbiato singolarmente durante tutte le procedure per evitare il distacco dell'impianto. In caso di distacco della cannula, eseguire l'eutanasia iniettando 150 mg/kg di pentobarbital di sodio seguito da decapitazione dopo il raggiungimento dell'anestesia profonda.</li>
	<li>Iniettare per via sottocutanea (SC) meloxicam 1 mg/kg una volta al giorno per tre giorni dopo l'intervento chirurgico per fornire analgesia.</li>
	<li>Attendere almeno 7 giorni per il recupero completo e 14 giorni per l'espressione di opsin prima di ulteriori procedure. NOTA: Eseguire un follow-up postoperatorio ogni 12 ore per tre giorni, quindi controllare gli animali ogni giorno fino al giorno dell'eutanasia alla fine dell'esperimento.</li>
</ol>
2. Formazione reach-to-grasp
<ol><li>Il giorno 7 post-operatorio, iniziare il protocollo di deprivazione alimentare28. Pesare i topi per tre giorni consecutivi per determinare il loro peso corporeo medio ad libitum. Quindi, programmare le restrizioni alimentari in modo che gli animali ricevano abbastanza nutrienti per mantenere circa il 90% e non meno dell'85% del peso corporeo. NOTA: Questo si ottiene fornendo 2,5-3 g di cibo al giorno. Monitora quotidianamente il peso degli animali e segna il benessere generale osservando il comportamento e l'aspetto degli animali, ad esempio l'aspetto del mantello e degli occhi. Utilizzare il sistema di punteggio delle condizioni corporee del riferimento29.</li>
	<li>Durante i periodi di pre-allenamento, formazione e test, fornire a ciascun topo 20 pellet (20 mg di pellet al gusto di cioccolato senza polvere) al giorno (vedi Tabella dei materiali) (mangiati durante l'attività o dopo) oltre ai pellet alimentari standard.</li>
	<li>Tre giorni prima dell'assuefazione, spargere 0,4 g / animale / giorno 20 mg di pellet al gusto di cioccolato senza polvere nelle loro gabbie domestiche, in modo che i topi facciano conoscenza con i pellet che servono come ricompensa durante il compito di raggiungere la presa.</li>
	<li>Abituare i topi mettendoli 10 minuti nella camera di prova un giorno prima del pre-allenamento con pellet sparsi sul pavimento della camera (Figura 1A).</li>
	<li>Lasciare il cibo ogni giorno dopo l'allenamento e il test. Mantieni un programma simile ogni giorno.</li>
	<li>Il primo giorno di pre-addestramento, posiziona i topi nella camera di presa e osserva dalla parte anteriore. Posizionare i pellet davanti alla camera vicino all'apertura in modo che inizino a consumare i pellet. In questa fase, i topi sono autorizzati ad afferrare i pellet in qualsiasi forma.</li>
	<li>Il secondo giorno di pre-allenamento, posizionare i pellet sempre più lontano dall'apertura fino a portarli alla rientranza (1 cm dall'apertura) in modo che i topi possano modellare il loro movimento di presa (Figura 1C).</li>
	<li>Addestra i topi a correre verso la parte posteriore della gabbia e tornare all'apertura della gabbia per ricevere il prossimo pellet di cibo come strategia per individualizzare le prove. NOTA: questo può essere ottenuto aspettando che il mouse si trovi nella parte posteriore della gabbia prima di posizionare un pellet nella rientranza per ogni prova.</li>
	<li>Posiziona i pellet per essere afferrati dalla zampa destra o sinistra. NOTA: I topi iniziano a usare preferenzialmente una zampa da afferrare, che verrà utilizzata nei giorni successivi di allenamento e test.</li>
	<li>Addestrare gli animali per 6 giorni in sessioni giornaliere della durata di 20 prove o fino a un massimo di 10 minuti. Dal giorno 2 di allenamento, metti il ricevitore simulato (dimensioni 12 x 18 x 7 mm, 1 g, vedi Tabella dei materiali), in modo che i topi si abituino al peso durante l'esecuzione del compito (Figura 1B). Ogni giorno segna il numero di prove hit e missed.</li>
	<li>Registra il comportamento con una normale fotocamera e cattura 30-60 fotogrammi / s dalla parte anteriore della camera. Inoltre, è possibile posizionare uno specchio sotto la camera di addestramento con un angolo di 45 ° per monitorare la postura degli animali (Figura 1D, E).</li>
	<li>Per l'analisi cinematica post-hoc (Figura 2), montare una telecamera ad alta velocità (vedi Tabella dei materiali) con un angolo di 45° per registrare dal lato della gabbia. Se è necessaria un'analisi 3D, posizionare una seconda telecamera ad alta velocità per registrare con un angolo di 35 ° dalla parte anteriore della camera; entrambe le telecamere devono essere posizionate sul lato destro o sinistro della gabbia a seconda della sidedness degli animali e devono catturare allo stesso frame rate ed essere sincronizzate7 (Figura 3D, E).</li>
	<li>Impostare le telecamere ad alta velocità su 100 fotogrammi/s con una risoluzione di 376 x 252 pixel o più, se possibile. Posizionare le pareti di polistirolo bianco dietro i lati e il retro della camera per ridurre lo sfondo e aumentare il contrasto (Figura 1E).</li>
	<li>Il giorno del test, sostituire l'unità fittizia con un ricevitore a infrarossi per la stimolazione optogenetica wireless (Figura 1B, C).</li>
	<li>Quando i topi iniziano a raggiungere, ruotare manualmente la cannula LED con il telecomando per avere una stimolazione continua per il tempo in cui viene eseguito il comportamento e per non più di 2 s. È preferibile programmare un paradigma di stimolazione automatica. Il dispositivo di stimolazione attiva un LED di 470 nm (luce blu) con intensità sulla punta di 1,0 mW/mm2.</li>
	<li>Raccogli i video per un ulteriore esame, incluso il punteggio e l'analisi cinematica.</li>
</ol>3. Conferma istologica post-hoc
<ol><li>Al termine di un esperimento, confermare l'espressione virale e il posizionamento della cannula LED. Anestetizzare l'animale con un cocktail di ketamina 100 mg/kg e xilazina 10 mg/kg. Una volta che il topo presenta segni di anestesia profonda (fase 1.7), perfondere con soluzione salina tamponata con fosfato ghiacciato (PBS) seguita da PFA al 4%.</li>
	<li>Rimuovere accuratamente la cannula impiantata afferrando saldamente il connettore con una pinza e tirando delicatamente verso l'alto.</li>
	<li>Estrarre e post-fissare il cervello per 24 ore in 4% PFA23.</li>
	<li>Eseguire lavaggi di 3-10 minuti con PBS.</li>
	<li>Tagliare il cervello in sezioni da 50 μm usando un microtomo (vedi Tabella dei materiali).</li>
	<li>Montare le sezioni in guide con supporti di montaggio rigidi con DAPI per macchiare nuclei e coprire diapositive.</li>
	<li>Dopo l'essiccazione, osservare le sezioni al microscopio confocale e verificare la posizione della cannula impiantata e l'espressione di Ch2R fusa con qualsiasi proteina fluorescente.</li>
</ol>

<ol><li>Balbinot, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-stroke+kinematic+analysis+in+rats+reveals+similar+reaching+abnormalities+as+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Report%22%5BJournal%5D)">Post-stroke kinematic analysis in rats reveals similar reaching abnormalities as humans.</a> Scientific Report. 8 (1), 8738(2018).</li>
<li>Klein, A., Sacrey, L. A., Whishaw, I. Q., Dunnett, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+rodent+skilled+reaching+as+a+translational+model+for+investigating+brain+damage+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+%26+Biobehavioral+Reviews%22%5BJournal%5D)">The use of rodent skilled reaching as a translational model for investigating brain damage and disease.</a> Neuroscience & Biobehavioral Reviews. 36 (3), 1030-1042 (2012).</li>
<li>MacLellan, C. L., Gyawali, S., Colbourne, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skilled+reaching+impairments+follow+intrastriatal+hemorrhagic+stroke+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Behavioural+Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Skilled reaching impairments follow intrastriatal hemorrhagic stroke in rats.</a> Behavioural Brain Research. 175 (1), 82-89 (2006).</li>
<li>Evenden, J. L., Robbins, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+unilateral+6-hydroxydopamine+lesions+of+the+caudate-putamen+on+skilled+forepaw+use+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Behavioural+Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Effects of unilateral 6-hydroxydopamine lesions of the caudate-putamen on skilled forepaw use in the rat.</a> Behavioural Brain Research. 14 (1), 61-68 (1984).</li>
<li>Rodgers, R. A., Travers, B. G., Mason, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bimanual+reach+to+grasp+movements+in+youth+with+and+without+autism+spectrum+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Psychology%22%5BJournal%5D)">Bimanual reach to grasp movements in youth with and without autism spectrum disorder.</a> Frontiers in Psychology. 9, 2720(2019).</li>
<li>Sacrey, L. A. -O., Zwaigenbaum, L., Bryson, S., Brian, J., Smith, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+reach-to-grasp+movement+in+infants+later+diagnosed+with+autism+spectrum+disorder%3A+a+high-risk+sibling+cohort+study%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurodevelopmental+Disorders%22%5BJournal%5D)">The reach-to-grasp movement in infants later diagnosed with autism spectrum disorder: a high-risk sibling cohort study.</a> Journal of Neurodevelopmental Disorders. 10 (1), 41(2018).</li>
<li>Azim, E., Jiang, J., Alstermark, B., Jessell, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skilled+reaching+relies+on+a+V2a+propriospinal+internal+copy+circuit%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Skilled reaching relies on a V2a propriospinal internal copy circuit.</a> Nature. 508 (7496), 357-363 (2014).</li>
<li>Marques, J. M., Olsson, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Performance+of+juvenile+mice+in+a+reach-to-grasp+task%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Performance of juvenile mice in a reach-to-grasp task.</a> Journal of Neuroscience Methods. 193 (1), 82-85 (2010).</li>
<li>Miklyaeva, E. I., Castaneda, E., Whishaw, I. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skilled+reaching+deficits+in+unilateral+dopamine-depleted+rats%3A+Impairments+in+movement+and+posture+and+compensatory+adjustments%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Skilled reaching deficits in unilateral dopamine-depleted rats: Impairments in movement and posture and compensatory adjustments.</a> The Journal of Neuroscience. 14 (11), Pt 2 7148-7158 (1994).</li>
<li>Vaidya, M., Kording, K., Saleh, M., Takahashi, K., Hatsopoulos, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+coordination+during+reach-to-grasp%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Neural coordination during reach-to-grasp.</a> Journal of Neurophysiology. 114 (3), 1827-1836 (2015).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deconstruction+of+corticospinal+circuits+for+goal-directed+motor+skills%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Deconstruction of corticospinal circuits for goal-directed motor skills.</a> Cell. 171 (2), 440-455 (2017).</li>
<li>Xu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+formation+and+selective+stabilization+of+synapses+for+enduring+motor+memories%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Rapid formation and selective stabilization of synapses for enduring motor memories.</a> Nature. 462 (7275), 915-919 (2009).</li>
<li>Ian, Q. W., Sergio, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+of+skilled+forelimb+reaching+in+the+rat%3A+A+proximally+driven+movement+with+a+single+distal+rotatory+component%5BTitle%5D)+AND+%22Behavioural+Brain+Research%22%5BJournal%5D)">The structure of skilled forelimb reaching in the rat: A proximally driven movement with a single distal rotatory component.</a> Behavioural Brain Research. 41 (1), 49-59 (1990).</li>
<li>Proske, U., Gandevia, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+proprioceptive+senses%3A+their+roles+in+signaling+body+shape%2C+body+position+and+movement%2C+and+muscle+force%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">The proprioceptive senses: their roles in signaling body shape, body position and movement, and muscle force.</a> Physiological Reviews. 92 (4), 1651-1697 (2012).</li>
<li>Yttri, E. A., Dudman, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opponent+and+bidirectional+control+of+movement+velocity+in+the+basal+ganglia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Opponent and bidirectional control of movement velocity in the basal ganglia.</a> Nature. 533 (7603), 402-406 (2016).</li>
<li>Donchin, O., Gribova, A., Steinberg, O., Bergman, H., Vaadia, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+motor+cortex+is+involved+in+bimanual+coordination%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Primary motor cortex is involved in bimanual coordination.</a> Nature. 395 (6699), 274-278 (1998).</li>
<li>Brus-Ramer, M., Carmel, J. B., Martin, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor+cortex+bilateral+motor+representation+depends+on+subcortical+and+interhemispheric+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Motor cortex bilateral motor representation depends on subcortical and interhemispheric interactions.</a> The Journal of Neuroscience. 29 (19), 6196-6206 (2009).</li>
<li>d'Avella, A., Saltiel, P., Bizzi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinations+of+muscle+synergies+in+the+construction+of+a+natural+motor+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Combinations of muscle synergies in the construction of a natural motor behavior.</a> Nature Neuroscience. 6 (3), 300-308 (2003).</li>
<li>Fattori, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hand+orientation+during+reach-to-grasp+movements+modulates+neuronal+activity+in+the+medial+posterior+parietal+area+V6A%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Hand orientation during reach-to-grasp movements modulates neuronal activity in the medial posterior parietal area V6A.</a> The Journal of Neuroscience. 29 (6), 1928-1936 (2009).</li>
<li>vanden Berg, F. E., Swinnen, S. P., Wenderoth, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excitability+of+the+motor+cortex+ipsilateral+to+the+moving+body+side+depends+on+spatio-temporal+task+complexity+and+hemispheric+specialization%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Excitability of the motor cortex ipsilateral to the moving body side depends on spatio-temporal task complexity and hemispheric specialization.</a> PLoS One. 6 (3), 17742(2011).</li>
<li>vanden Berg, F. E., Swinnen, S. P., Wenderoth, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+the+primary+motor+cortex+in+controlling+movements+executed+with+the+ipsilateral+hand+differs+between+left-+and+right-handers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cognitive+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Involvement of the primary motor cortex in controlling movements executed with the ipsilateral hand differs between left- and right-handers.</a> Journal of Cognitive Neuroscience. 23 (11), 3456-3469 (2011).</li>
<li>Verstynen, T., Diedrichsen, J., Albert, N., Aparicio, P., Ivry, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ipsilateral+motor+cortex+activity+during+unimanual+hand+movements+relates+to+task+complexity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Ipsilateral motor cortex activity during unimanual hand movements relates to task complexity.</a> Journal of Neurophysiology. 93 (3), 1209-1222 (2005).</li>
<li>Lopez-Huerta, V. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Striatal+bilateral+control+of+skilled+forelimb+movement%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Striatal bilateral control of skilled forelimb movement.</a> Cell Reports. 34 (3), 108651(2021).</li>
<li>Lopez-Huerta, V. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neostriatum%3A+two+entities%2C+one+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Structure+and+Function%22%5BJournal%5D)">The neostriatum: two entities, one structure.</a> Brain Structure and Function. 221 (3), 1737-1749 (2016).</li>
<li>Becker, M. I., Calame, D. J., Wrobel, J., Person, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Online+control+of+reach+accuracy+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Online control of reach accuracy in mice.</a> Journal of Neurophysiology. 124 (6), 1637-1655 (2020).</li>
<li>Jaidar, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synchronized+activation+of+striatal+direct+and+indirect+pathways+underlies+the+behavior+in+unilateral+dopamine-depleted+mice%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Synchronized activation of striatal direct and indirect pathways underlies the behavior in unilateral dopamine-depleted mice.</a> European Journal of Neuroscience. 49 (11), 1512-1528 (2019).</li>
<li>Gong, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+Cre+recombinase+to+specific+neuron+populations+with+bacterial+artificial+chromosome+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Targeting Cre recombinase to specific neuron populations with bacterial artificial chromosome constructs.</a> The Journal of Neuroscience. 27 (37), 9817-9823 (2007).</li>
<li>Rowland, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Food+or+fluid+restriction+in+common+laboratory+animals%3A+balancing+welfare+considerations+with+scientific+inquiry%5BTitle%5D)+AND+%22Comparative+Medicine%22%5BJournal%5D)">Food or fluid restriction in common laboratory animals: balancing welfare considerations with scientific inquiry.</a> Comparative Medicine. 57 (2), 149-160 (2007).</li>
<li>Ullman-Culleré, M. H., Foltz, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Body+condition+scoring%3A+a+rapid+and+accurate+method+for+assessing+health+status+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Animal+Science%22%5BJournal%5D)">Body condition scoring: a rapid and accurate method for assessing health status in mice.</a> Laboratory Animal Science. 49 (3), 319-323 (1999).</li>
<li>Chen, C. C., Gilmore, A., Zuo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Study+motor+skill+learning+by+single-pellet+reaching+tasks+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Study motor skill learning by single-pellet reaching tasks in mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (85), e51238(2014).</li>
<li>Fink, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presynaptic+inhibition+of+spinal+sensory+feedback+ensures+smooth+movement%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Presynaptic inhibition of spinal sensory feedback ensures smooth movement.</a> Nature. 509 (7498), 43-48 (2014).</li>
<li>Li, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Refinement+of+learned+skilled+movement+representation+in+motor+cortex+deep+output+layer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">Refinement of learned skilled movement representation in motor cortex deep output layer.</a> Nature Communication. 8, 15834(2017).</li>
<li>Overduin, S. A., d'Avella, A., Carmena, J. M., Bizzi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microstimulation+activates+a+handful+of+muscle+synergies%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Microstimulation activates a handful of muscle synergies.</a> Neuron. 76 (6), 1071-1077 (2012).</li>
<li>Miyazaki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+Timescale+interrogation+of+neuronal+function+by+fiberless+optogenetics+using+lanthanide+micro-particles%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Large Timescale interrogation of neuronal function by fiberless optogenetics using lanthanide micro-particles.</a> Cell Reports. 26 (4), 1033-1043 (2019).</li>
<li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wireless+multilateral+devices+for+optogenetic+studies+of+individual+and+social+behaviors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Wireless multilateral devices for optogenetic studies of individual and social behaviors.</a> Nature Neuroscience. 24 (7), 1035-1045 (2021).</li>
<li>Kampasi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiberless+multicolor+neural+optoelectrode+for+in+vivo+circuit+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Fiberless multicolor neural optoelectrode for in vivo circuit analysis.</a> Scientific Reports. 6, 30961(2016).</li>
<li>Allen, B. D., Singer, A. C., Boyden, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+designing+interpretable+optogenetic+behavior+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Learning+%26+Memory%22%5BJournal%5D)">Principles of designing interpretable optogenetic behavior experiments.</a> Learning & Memory. 22 (4), 232-238 (2015).</li>
<li>Packer, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPacker%2C+AM+%22Nature+Methods%22">Nature Methods</a>. 9, 1202-1205 (2012).</li>
</ol>

Gli autori non dichiarano alcuna divulgazione.

L'uso della manipolazione optogenetica delle popolazioni neuronali in paradigmi comportamentali ben definiti sta facendo progredire le nostre conoscenze sui meccanismi alla base del controllo motorio 7,23. I metodi wireless sono particolarmente adatti per compiti che richiedono test su più animali o la libera circolazione34,35. Tuttavia, poiché le tecniche e i dispositivi sono perfezionati, dovrebbe esser...

Il comportamento motorio qualificato è presente durante la maggior parte dei movimenti eseguiti da noi ed è noto per essere influenzato in diversi disturbi cerebrali 1,2,3,4,5,6. L'implementazione di compiti che consentano di studiare lo sviluppo, l'apprendimento e le prestazioni di movimenti qualificati è fondamentale per comprendere le basi neurobiologiche della funzione motoria, specialmente nei modelli di lesioni cerebrali, disturbi neurodegenerativi e dello sviluppo neurologico 2,7,8,9,10,11,12,13 . Raggiungere e recuperare oggetti viene fatto di routine nelle azioni della vita di tutti i giorni, ed è una delle prime abilità motorie acquisite durante lo sviluppo precoce e poi perfezionate negli anni 5,6. Comprende un comportamento complesso che richiede processi senso-motori come la percezione delle caratteristiche dell'oggetto, la pianificazione del movimento, la selezione dell'azione, l'esecuzione del movimento, la coordinazione del corpo e la modulazione della velocità 7,14,15,16. Pertanto, i compiti unimanuali ad alta destrezza richiedono la partecipazione di molte strutture cerebrali di entrambi gli emisferi 16,17,18,19,20,21,22. Nei topi, il singolo compito di reach-to-grasp del pellet è caratterizzato per diverse fasi che possono essere controllate e analizzate separatamente 7,13,23. Questa caratteristica permette di studiare il contributo di specifiche sottopopolazioni neuronali a diversi stadi di acquisizione e prestazioni comportamentali e fornisce una piattaforma per studi dettagliati dei sistemi motori 13,23,24. Il movimento avviene in un paio di secondi; pertanto, la videografia ad alta velocità dovrebbe essere utilizzata per l'analisi cinematica in fasi distinte della traiettoria motoria qualificata 7,25. Diversi parametri possono essere estratti dai video, tra cui la postura del corpo, la traiettoria, la velocità e il tipo di errori25. L'analisi cinematica può essere utilizzata per rilevare sottili cambiamenti durante la manipolazione optogenetica wireless 7,23.
L'utilizzo di diodi miniaturizzati a emissione di luce (LED) per fornire luce tramite un sistema wireless montato sulla testa consente di avere un controllo optogenetico remoto mentre l'animale esegue il compito. Il controller optogenetico wireless accetta comandi di trigger a impulso singolo o continuo da uno stimolatore e invia segnali a infrarossi (IR) a un ricevitore collegato al LED miniaturizzato23,26. L'attuale protocollo combina questo approccio optogenetico wireless con la videografia ad alta velocità di un compito di destrezza per sezionare il ruolo di specifiche popolazioni neuronali durante l'esecuzione del comportamento motorio fine23. Poiché si tratta di un compito unimanuale, consente di valutare la partecipazione delle strutture in entrambi gli emisferi. Tradizionalmente, il cervello controlla il movimento del corpo in modo altamente asimmetrico; tuttavia, i compiti ad alta destrezza richiedono un'attenta coordinazione e controllo da parte di molte strutture cerebrali, compresi i nuclei ipsilaterali e il contributo differenziale delle sottopopolazioni neuronali all'interno dei nuclei 10,20,21,22,23. Questo protocollo mostra che le strutture sottocorticali di entrambi gli emisferi controllano la traiettoria dell'artoanteriore 23. Questo paradigma può essere adatto per studiare altre regioni del cervello e modelli di malattie cerebrali.

<table><tbody><tr><td>Macchina per anestesia</td><td>RWD</td><td>R583S</td><td>Vaporizzatore di isoflurano</td></tr><tr><td>Anesket</td><td>PiSA</td><td></td><td>Ketamina</td></tr><tr><td>Breadboard</td><td>Thorlabs</td><td>MB3090 / M</td><td>Breadboard ottico in alluminio solido</td></tr><tr><td>Obiettivo della fotocamera</td><td>Canon</td><td></td><td>50mmf / 1.4 obiettivi con messa a fuoco manuale (c-mount)</td></tr><tr><td>Sistema di telecamere</td><td>BrainVision</td><td>MiCAM02</td><td>Controller della fotocamera e sincronizzatore</td></tr><tr><td>Tamponi di</td><td></td><td></td><td></td>cotone</tr><tr><td>Soluzione CS</td><td>PiSA</td><td></td><td>Soluzione di cloruro di sodio 9%</td></tr><tr><td>Camera di allenamento personalizzata</td><td>In casa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Punta da trapano #105</td><td>Dremel</td><td>2 615 010 5AE</td><td>Taglierina per incisione</td></tr><tr><td>Pellet di cioccolato di precisione senza polvere Bio-Serv</td><td></td><td>F05301</td><td></td></tr><tr><td>Alcool etilico</td><td>J. T. Baker</td><td>9000-02</td><td>Etanolo</td></tr><tr><td>Eyespears</td><td></td><td>Ultracell 40400-8</td><td>Eyespears di materiale PVA assorbente</td></tr><tr><td>Fluriso</td><td>VetOne</td><td>V1 502017-250</td><td>Isoflurano</td></tr><tr><td>Capillari in vetro</td><td>Drumond Scientific</td><td>3-000-203-G/X</td><td>Pipette per NanoJect II</td></tr><tr><td>Perossido di idrogeno</td><td>Farmacom</td><td></td><td>Antisettico</td></tr><tr><td>Telecamera ad alta velocità</td><td>BrainVision</td><td>MiCAM02-CMOS</td><td>Telecamere monocromatiche ad alta velocità</td></tr><tr><td>Emitore a infrarossi</td><td>Teleopto</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Siringa</td><td></td><td></td><td></td>per insulina</tr><tr><td>Cannula LED</td><td>Teleopto</td><td>TelC-c-l-d</td><td>Cannula LED 250um 487nm luce</td></tr><tr><td>Micropipetta 10 uL</td><td>Eppendorf</td><td>Z740436</td><td></td></tr><tr><td>Estrattore per micropipette</td><td>Sutter</td><td>P-87</td><td>Estrattore orizzontale</td></tr><tr><td>Microscopio LSM780</td><td>Zeiss</td><td>Microscopio confocale</td><td></td></tr><tr><td>Microtomo</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mock receiver</td><td>Teleopto</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NanoJect II</td><td>Drumond Scientific</td><td>3-000-204</td><td>Micro iniettore</td></tr><tr><td>Serbatoio di ossigeno</td><td>Infra</td><td>na</td><td></td></tr><tr><td>pAAV-EF1a-double.floxed-hChR2(H134R)-mCherry-WPRE- HGHpA</td><td>Addgene</td><td>20297</td><td>Vettore virale per l'espressione di ChR-2</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeide</td><td>Sigma</td><td>P-6148</td><td></td></tr><tr><td>Tampone salino fosfato</td><td>Sigma</td><td>P-4417</td><td>Compresse tampone salino fosfato</td></tr><tr><td>Puntali per pipette 10 uL</td><td>ThermoFisher</td><td>AM12635</td><td>0,5-10 uL&nbsp; volume</td></tr><tr><td>Pisabental</td><td>PiSA</td><td></td><td>Pentobarbital di sodio</td></tr><tr><td>Plexiglass</td><td>commerciale</td><td></td><td>Lastra acrilica</td></tr><tr><td>Povidone iodio</td><td>Farmacom</td><td></td><td>Antisettico</td></tr><tr><td>Procin</td><td>PiSA</td><td></td><td>Xilacino</td></tr><tr><td>Puralube</td><td>Perrigo pharma</td><td>1228112</td><td>Lubrificante per gli occhi 15% olio minerale/85% petrolato</td></tr><tr><td>Utensile rotante</td><td>Kmoon</td><td>Mini grinder</td><td>Standard</td></tr><tr><td>Bisturi</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lama per</td><td></td><td></td><td></td>bisturi</tr><tr><td>Apparecchio stereotassico</td><td>Stoelting</td><td>51730D</td><td>Apparecchio digitale</td></tr><tr><td>Super-Bond C& B</td><td>Sun Medical</td><td></td><td>Cemento dentale</td></tr><tr><td>Tappo chirurgico monouso Teleopto</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>telecomando Teleopto</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tg Drd1-Cre linea di topi</td><td>Gensat</td><td>036916-UCD</td><td>Inserimento transgene FK150Gsat</td></tr><tr><td>Adesivo tissutale</td><td>3M Vetbond</td><td>1469SB</td><td></td></tr><tr><td>TPI Vibratome 1000 plus</td><td>Peico</td><td></td><td>Microtomo</td></tr><tr><td>Vectashield supporti di montaggio con DAPI</td><td>Vector laboratories</td><td>H-1200</td><td>Supporti di montaggio</td></tr><tr><td>Ricevitore wireless</td><td>Teleopto</td><td>TELER-1-P</td><td></td></tr></tbody></table>

in vivo controllo optogenetico wireless del comportamento motorio qualificato

In Vivo Wireless Optogenetic Control of Skilled Motor Behavior

Le capacità motorie sono essenziali nella vita di tutti i giorni e possono essere compromesse in diversi disturbi del sistema nervoso. L'acquisizione e l'esecuzione di questi compiti richiedono l'integrazione senso-motoria e comportano un controllo preciso dei circuiti cerebrali bilaterali. L'implementazione di paradigmi comportamentali unimanuali in modelli animali migliorerà la comprensione del contributo delle strutture cerebrali, come lo striato, al comportamento motorio complesso in quanto consente la manipolazione e la registrazione dell'attività neurale di nuclei specifici in condizioni di controllo e malattia durante l'esecuzione del compito. 
Fin dalla sua creazione, l'optogenetica è stata uno strumento dominante per interrogare il cervello consentendo l'attivazione o l'inibizione selettiva e mirata delle popolazioni neuronali. La combinazione di optogenetica con saggi comportamentali fa luce sui meccanismi alla base di specifiche funzioni cerebrali. I sistemi wireless montati sulla testa con diodi a emissione di luce miniaturizzati (LED) consentono il controllo optogenetico remoto in un animale completamente libero. Ciò evita che le limitazioni di un sistema cablato siano meno restrittive per il comportamento degli animali senza compromettere l'efficienza dell'emissione luminosa. L'attuale protocollo combina un approccio optogenetico wireless con la videografia ad alta velocità in un compito di destrezza unimanuale per sezionare il contributo di specifiche popolazioni neuronali al comportamento motorio fine.

Il compito reach-to-grasp è un paradigma ampiamente utilizzato per studiare la modellazione, l'apprendimento, le prestazioni e la cinematica del movimento delle abilità fini sotto diverse manipolazioni sperimentali. I topi imparano a eseguire l'attività in un paio di giorni e raggiungono una precisione superiore al 55% raggiungendo un plateau dopo 5 giorni di allenamento (Figura 2A, B). Analogamente a quanto riportato in precedenza, una percentuale di animali non svolge il c...

Il presente protocollo descrive come utilizzare l'optogenetica wireless combinata con la videografia ad alta velocità in un singolo compito di reach-to-grasp del pellet per caratterizzare i circuiti neurali coinvolti nell'esecuzione del comportamento motorio qualificato nei topi che si muovono liberamente.

In vivo Controllo optogenetico wireless del comportamento motorio qualificato

Fine motor skills are essential in everyday life and can be compromised in several nervous system disorders. The acquisition and performance of these ...

L'attuale protocollo contribuisce allo studio dei meccanismi cerebrali alla base del comportamento motorio qualificato. L'optogenetica wireless consente la manipolazione di neuroni specifici mentre i soggetti svolgono un compito in libera circolazione. In combinazione con la videografia ad alta velocità, è possibile avere un'analisi dettagliata del comportamento motorio fine.Il metodo potrebbe aiutare a comprendere i problemi motori nei disturbi dello sviluppo neurologico e neurodegenerativo. Queste tecniche possono essere utilizzate per studiare la funzione cerebrale anche in altri paradigmi comportamentali. Diana Rodriguez-Munoz, una studentessa universitaria del mio laboratorio, assisterà con l'esperimento.Per le procedure chirurgiche, iniziare preparando una cannula LED della lunghezza desiderata secondo le coordinate dorso-ventrali della struttura di interesse. Per fare ciò, tagliare la fibra di vetro a una lunghezza superiore alla dimensione finale desiderata e macinare la punta della fibra alla lunghezza target con carta vetrata ruvida. Quindi, lucidare la punta della fibra con carta vetrata fine.Per le microiniezioni, riempire una pipetta con l'olio minerale e posizionare la pipetta nel microiniettore. Assicurarsi che il microiniettore funzioni correttamente iniettando un po 'di olio minerale. Quindi, preparare il topo anestetizzato per l'intervento chirurgico applicando un unguento oftalmico e rimuovendo i peli dal cuoio capelluto con un trimmer e una crema per la depilazione.Quindi, pulire il cuoio capelluto con tamponi di cotone con 8% di iodio povidone e 70% di etanolo alternati tre volte ciascuno. Dopo la sanificazione, posizionare il mouse nell'apparato stereotassico e fissare la testa, assicurandosi che il cranio sia livellato negli assi mediale-laterale e anteriore-posteriore. Utilizzare un bisturi per fare un'incisione di un centimetro attraverso il cuoio capelluto a livello degli occhi lungo l'asse sagittale.Quindi, ritrarre la pelle per esporre il cranio e pulire il periostio con tamponi di cotone. Pulire la superficie del cranio con soluzione salina e tamponi di cotone e risolvere eventuali emorragie in superficie utilizzando lance oculari assorbenti sterili. Quindi, applicare una goccia di perossido di idrogeno al 2,5% con un batuffolo di cotone e lasciarlo agire per alcuni secondi per rendere visibili le suture del cranio e avere un riferimento migliore.Dopo alcuni secondi, pulire accuratamente l'area con un batuffolo di cotone pulito. Con una pipetta di vetro del diametro finale della punta di 15 micron, individuare bregma e lambda per verificare che il cranio sia livellato nell'asse anteriore-posteriore. Quindi, dipingere un punto di riferimento nel cuoio capelluto sopra le coordinate selezionate con un pennarello.Nel punto di riferimento, eseguire una craniotomia di un millimetro di diametro applicando una leggera pressione al cranio con uno strumento rotante a velocità medio-bassa con una piccola punta da trapano dentale rotonda. Una volta fatto, spostare il capillare verso le coordinate anteriore-posteriore, o AP, e mediale-laterale, o ML, selezionate. Caricare il capillare con 300-400 nanolitri del virus adeno-associato CreE-dipendente, o AAV, come AAV1, D-flox channelrhodopsin mCherry per esprimere channelrhodopsin nella regione di interesse.Un AAV può essere utilizzato come controllo per esprimere la proteina reporter. Dopo essersi assicurati che la punta non sia intasata, introdurre la pipetta di vetro nel cervello alle coordinate dorso-ventrali meno 3,35 millimetri nello striato dorsale-laterale e iniettare 200 nanolitri del virus utilizzando un iniettore automatico ad una velocità di 23 nanolitri al secondo. Attendere 10 minuti dopo l'iniezione prima di ritirare lentamente la pipetta di vetro per evitare fuoriuscite.Quindi, pulire e asciugare eventuali residui con tamponi di cotone. Quindi, collegare la cannula LED di vetro al braccio stereotassico e calibrare le coordinate utilizzando bregma come riferimento. Quindi, inserire lentamente la cannula per evitare danni ai tessuti e posizionarla a 100 micrometri sopra il sito di iniezione.Una volta che la cannula LED è in posizione, aggiungere una goccia di 100 microlitri di adesivo tissutale sul bordo della craniotomia. Utilizzare un pennello sterile per applicare una miscela di cemento dentale appena preparata attorno al connettore della cannula a poco a poco, costruendo strati fino a quando il cranio è coperto e il connettore è fissato saldamente al cranio, lasciando i perni completamente liberi. Quando il cemento si asciuga completamente, chiudere la pelle intorno all'impianto usando l'adesivo tissutale.Quindi, posizionare il mouse in una gabbia di recupero su una piastra riscaldante a 33 gradi Celsius durante il monitoraggio dei segni di disagio o dolore. Registra il comportamento dell'animale con una normale fotocamera e cattura da 30 a 60 fotogrammi al secondo dalla parte anteriore della camera. Uno specchio può essere posizionato sotto la camera di allenamento con un angolo di 45 gradi per monitorare la postura dell'animale.Quando i topi iniziano a raggiungere il pellet, ruotare manualmente la cannula LED con il telecomando per avere una stimolazione continua per il tempo in cui il comportamento viene eseguito per non più di due secondi. Il dispositivo di stimolazione attiva un LED di 470 nanometri con intensità alla punta di un milliwatt per millimetro quadrato. Il comportamento motorio fine dell'animale sotto manipolazioni optogenetiche è stato studiato con il compito di raggiungere la presa.I topi hanno imparato a eseguire il compito in un paio di giorni e hanno raggiunto una precisione superiore al 55%, raggiungendo un plateau dopo cinque giorni di allenamento. La traiettoria dei movimenti è stata tracciata con la videografia ad alta velocità, rendendo possibile l'analisi della cinematica. È stata eseguita la valutazione quantificabile di parametri come distanza percorsa, velocità, accelerazione, endpoint e traiettoria.Nelle prove mancate, i topi hanno iniziato il movimento di presa più lontano dal pellet rispetto alle prove colpite. Inoltre, gli errori sono stati significativamente associati alla postura del mouse, mostrati dalle differenze nell'angolo del corpo durante le prove colpite e mancate. L'attivazione controlaterale della dopamina D1 che esprime i neuroni di proiezione spinosa, o SPN, ha ridotto il successo di presa rispetto alle condizioni di controllo.Durante una stimolazione optogenetica, la traiettoria della zampa aumentava nella distanza di viaggio, portando all'incapacità di colpire il pellet e ad un aumento del tipo di errore iniziale uno. L'analisi dei componenti principali, o PCA, ha mostrato che tutte le traiettorie di prova durante l'attivazione degli SPN D1 controlaterali si sono separate in un cluster con quasi nessuna sovrapposizione con il cluster di controllo, indicando una bassa somiglianza. L'attivazione dei DSPN sul lato ipsilaterale ha portato ad un aumento della dispersione della traiettoria mostrata dall'analisi PCA.Quindi, l'attivazione ipsilaterale degli SPN D1 ha modificato la traiettoria di raggiungimento senza modificare il risultato comportamentale. Quando si esegue questo protocollo, fare attenzione a posizionare correttamente la cannula in modo che non si stacchi durante le sessioni di allenamento. Questo metodo può essere utilizzato in altri paradigmi comportamentali per studiare il comportamento motorio, l'elaborazione sensoriale, l'apprendimento e la memoria.L'optogenetica wireless permetterà di studiare il comportamento naturalistico e le sue basi neurobiologiche in soggetti veramente liberi.

in-vivo-wireless-optogenetic-control-of-skilled-motor-behavior

Research

Ricerca

JoVE Journal

Neuroscience

Neuroscienze

Fonte: Kodani, S., et.al. Manipolazione optogenetica dei circuiti neurali durante il monitoraggio degli stati di sonno/veglia nei topi. J. Vis. Exp. (2019)Questo video dimostra la manipolazione optogenetica dei circuiti neurali coinvolti nella transizione dal sonno alla veglia nei topi. La procedura prevede l'impianto chirurgico di una fibra ottica ed elettrodi nel cervello e nei muscoli per consentire la stimolazione luminosa e la registrazione elettrofisiologica. Fornendo luce per attivare i...

Manipolazione optogenetica dei circuiti neurali per la transizione dal sonno alla veglia nei topi

Lo sviluppo di optogenetics ora fornisce i mezzi per stimolare i neuroni geneticamente definiti con precisione e circuiti,...

Fibra ottica Impianto per la Stimolazione Optogenetic cronica del tessuto cerebrale

Il recente sviluppo di strumenti neuroscienza che combinano genetica e ottica, definito "optogenetics", consente il controllo sulle attività del circuito neurale con un livello senza precedenti di risoluzione spaziale e temporale. Qui forniamo un protocollo per l'integrazione nella registrazione vivo con la manipolazione optogenetic di sottoinsiemi geneticamente definiti di neuroni piramidali corticali prefrontali e subicular.

Un metodo per High Fidelity optogenetic controllo dei singoli Piramidale neuroni<em&gt; In vivo</em

Qui si descrive un protocollo per optogenetic manipolazione delle attività dei motoneuroni, mentre il monitoraggio dei cambiamenti in uscita del motore (contrazione muscolare) in...

Optogenetic Perturbazione di attività neurale con illuminazione laser in semi-intatte<em&gt; Drosophila</em&gt; Larve in Motion

L'optogenetica è diventata un potente strumento da utilizzare negli esperimenti di neuroscienze comportamentali. Questo protocollo offre una guida passo passo alla progettazione e all'impostazione di sistemi laser e fornisce un protocollo completo per l'esecuzione di stimolazioni optogenetiche in vivo multiple e simultanee compatibili con la maggior parte dei paradigmi di test comportamentali dei roditori.

In vivo optogenetic stimolazione del sistema nervoso centrale Roditore

Una connessione wireless, sistema bidirezionale per registrazioni neurale multicanale e stimolazione a comportarsi liberamente ratti è stato introdotto. Il sistema è leggero e compatto, avendo così un impatto minimo sul repertorio del comportamento umano. Inoltre, questo sistema bidirezionale fornisce un sofisticato strumento per valutare le relazioni causali tra pattern di attivazione del cervello e comportamento.

Una connessione Wireless, interfaccia bidirezionale per registrazione In Vivo e la stimolazione dell'attività neurale a comportarsi liberamente ratti

Qui, descriviamo i metodi di manipolazione optogenetica di particolari tipi di neuroni durante il monitoraggio degli stati di sonno/veglia nei topi, presentando il nostro recente lavoro sul nucleo del letto della stria terminale come esempio.

Manipolazione optogenetica dei circuiti neurali durante il monitoraggio degli stati di sonno/veglia nei topi

Qui, presentiamo un metodo per la distribuzione di vettori di espressione virale nel cervello utilizzando seta fibroin film. Questo metodo consente la somministrazione mirata di vettori di espressione utilizzando fibre ottiche rivestite di seta/AAV, fibre ottiche coniche e windows cranica.

In Vivo Mirati espressione delle proteine di optogenetica utilizzando seta/AAV film

Con la manipolazione optogenetica di specifiche popolazioni neuronali o regioni cerebrali, il comportamento può essere modificato con alta risoluzione temporale e spaziale in animali in movimento libero. Utilizzando diversi strumenti optogenetici in combinazione con fibre ottiche cronicamente impiantate, è possibile eseguire una varietà di modulazioni neuronali e test comportamentali.

Manipolazione optogenetica dell'attività neuronale per modulare il comportamento nei topi in movimento libero

Qui presentiamo un protocollo che descrive la trasduzione virale di regioni cerebrali discrete con costrutti optogenetici per consentire la caratterizzazione elettrofisiologica sinaptico-specifica in fette acute di cervello di roditori.

Ex Vivo Interrogazione optogenetica della trasmissione sinaptica a lungo raggio e della plasticità dalla corteccia prefrontale mediale alla corteccia entorinale laterale

Abbiamo sviluppato un approccio semplificato ed economico per la fabbricazione di elettrodi e condotto registrazioni di segnali su più regioni in topi che si muovono liberamente. L'utilizzo dell'optogenetica, insieme all'elettrofisiologia multiregionale e alla registrazione del segnale del calcio, ha permesso la rivelazione delle attività neuronali in tutte le regioni nel modello di accensione delle crisi.

Un metodo integrato per la creazione di optrodi elettrofisiologici flessibili e convenienti per la registrazione in vivo multi-regione

Scopri il controllo optogenetico wireless del comportamento motorio qualificato nei topi. Questo metodo combina videografia ad alta velocità per analizzare i circuiti neurali coinvolti nel controllo motorio fine.

In vivo Controllo optogenetico wireless del comportamento motorio qualificato

Esplora altri video