Name: Ibridazione in situ a fluorescenza interfase di strisci di midollo osseo di mieloma multiplo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 53 s
Description: Impara l'ibridazione in situ a fluorescenza interfase su strisci di midollo osseo per il mieloma multiplo. Questo metodo migliora l'identificazione delle cellule plasmatiche clonali con costi ridotti.

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Questo progetto è stato sostenuto dal Fondo per l'innovazione di WNLO 2018WNLOKF023.

Questo studio è stato condotto secondo i principi della Dichiarazione di Helsinki e approvato dal Comitato Etico dell'Ospedale Zhongnan dell'Università di Wuhan (n. 2019065). I campioni sono stati raccolti da un paziente di MM nel Dipartimento di Ematologia, Zhongnan Hospital dell'Università di Wuhan (Cina).
1. Preparazione degli strisci BM
<ol><li>Posizionare i primi 0,2 ml di soluzione bm su un vetrino monouso pulito.</li>
	<li>Distribuire le strisce BM a spessore uniforme con code affilate rimuovendo rapidamente il BM. Quindi, asciugare naturalmente.</li>
	<li>Coprire i film BM con 1 mL di soluzione Wright-Giemsa per circa 10 s a temperatura ambiente.</li>
	<li>Aggiungere 1 mL di tampone fosfato ai vetrini. NOTA: Fare attenzione a evitare che la soluzione colorante si secchi o scorra via dai vetrini.</li>
	<li>Mescolare delicatamente la soluzione colorante e mantenerla per 15 minuti a temperatura ambiente.</li>
	<li>Risciacquare i vetrini con acqua pulita e asciugarli all'aria a temperatura ambiente.</li>
	<li>Utilizzare la microscopia a luce diretta per rilevare PC maligni. I PC dovrebbero essere ben dispersi.</li>
</ol>2. PRE-elaborazione FISH degli strisci BM
<ol><li>Coprire l'area ibridata con una soluzione fissativa per 10 minuti per scolorire e fissare i PC.<ol>
<li>Per preparare una soluzione fissativa fresca, mescolare metanolo con acido acetico glaciale in un rapporto di volume di 3: 1.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Risciacquare il vetrino con acqua deionizzata (dH2O) e asciugarlo all'aria a temperatura ambiente.</li>
	<li>Preriscaldare un barattolo contenente 2 tamponi SSC a 56 °C a bagnomaria. Diluire nuovamente il buffer a 20x SSC prima dell'uso.<ol>
<li>Per preparare 20x SSC, mescolare accuratamente 176 g di cloruro di sodio e 88 g di citrato di sodio con 800 mL di dH2O. Misurare il pH e regolare a pH 5,3 ± 0,2. Quindi, aggiungere dH2O per portare il volume finale a 1 L.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lavare lo striscio BM preparato nel tampone SSC 2x preriscaldato per 10 minuti, quindi immergerlo in acqua deionizzata a temperatura ambiente.</li>
	<li>Disidratare lo striscio in un gradiente di etanolo (70%, 85% e 100% di etanolo, ciascuno per 1 minuto). Asciugare all'aria lo striscio per 10 minuti.</li>
</ol>3. BM striscio FISH e lavaggio
NOTA: tutti i passaggi sono stati eseguiti in una stanza buia per evitare la tempra della fluorescenza.
<ol><li>Aggiungere la miscela di sonda TP53/centromero del cromosoma 17 (CEP17) all'area di ibridazione e coprirla con un coverslip. Premere delicatamente con una pinzetta a punta fine per rimuovere le bolle d'aria da sotto.</li>
	<li>Sigillare tutti i lati del coperchio con cemento di gomma per garantire una buona tenuta.</li>
	<li>Dopo la solidificazione del cemento di gomma, posizionare il vetrino su una macchina FISH automatica. Eseguire la denaturazione a 78 °C per 5 minuti, seguita dall'ibridazione a 37 °C durante la notte.</li>
	<li>Prelevare lo scivolo dalla macchina FISH. Utilizzare pinzette a punta fine per rimuovere delicatamente il cemento di gomma.</li>
	<li>Immergere la diapositiva in 2x SSC a temperatura ambiente per circa 1 o 2 minuti per lavare via il coperchio.</li>
	<li>Lavare il vetrino in tampone 68 °C preriscaldato 0,4x SSC/0,3% NP-40 a bagnomaria per 2 min.<ol>
<li>Preparare 0,4x SSC/0,3% NP-40 soluzione mescolando accuratamente 20 mL di 20x SSC (pH 5,3) con 950 mL di dH2O. Quindi, aggiungere 3 ml di NP-40 e mescolare accuratamente fino a completa dissoluzione. Misurare il pH e regolare a 7,0-7,5 con NaOH. Quindi, aggiungere dH2O per portare il volume finale della soluzione totale a 1 L.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lavare i vetrini con 2x SSC a bagnomaria a 37 °C per 1 min. Mettere in posizione verticale al buio per asciugare accuratamente per 10 minuti.</li>
	<li>Aggiungere 10 μL di DAPI all'area ibridata e coprire con un coverslip.</li>
</ol>4. Analisi e imaging FISH
<ol><li>Visualizza il vetrino ibridato utilizzando un filtro adatto impostato su un microscopio a fluorescenza.</li>
	<li>Utilizzare un filtro ottico monocromatico blu fluoroforo per osservare l'intensità di fluorescenza del nucleo cellulare. Acquisire immagini del nucleo cellulare in un set di filtri DAPI.</li>
	<li>Utilizzare una sonda centromerale cromosomica per mostrare quanti cromosomi contiene una cellula. Etichetta CEP17 con fluorescenza verde. Utilizzare un filtro ottico a fluoroforo verde spettro per osservare la posizione di CEP17. Scatta un'immagine dei segnali CEP17 sotto il set di filtri verdi.</li>
	<li>Etichettare il gene TP53 con fluorescenza arancione. Utilizzare un filtro ottico al fluoroforo arancione a spettro per osservare TP53. Scatta un'immagine dei segnali TP53 sotto questo set.</li>
	<li>Unisci queste tre immagini ed esaminale per verificare la presenza di anomalie numeriche. NOTA: In una normale cellula interfase, due segnali arancioni e due verdi sono osservati all'interno di un nucleo con fluorescenza blu, indicando una coppia di cromosoma 17 normale (Figura 1).</li>
</ol>

<ol><li>Sonneveld, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+of+multiple+myeloma+with+high-risk+cytogenetics%3A+a+consensus+of+the+International+Myeloma+Working+Group%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Treatment of multiple myeloma with high-risk cytogenetics: a consensus of the International Myeloma Working Group.</a> Blood. 127, 2955-2962 (2016).</li>
<li>Radbruch, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Competence+and+competition%3A+the+challenge+of+becoming+a+long-lived+plasma+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Competence and competition: the challenge of becoming a long-lived plasma cell.</a> Nature Reviews Immunology. 6, 741-750 (2006).</li>
<li>Lai, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+cytogenetics+in+multiple+myeloma%3A+a+study+of+151+patients+including+117+patients+at+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Improved cytogenetics in multiple myeloma: a study of 151 patients including 117 patients at diagnosis.</a> Blood. 85 (9), 2490-2497 (1995).</li>
<li>Hallek, M., Bergsagel, P. L., Anderson, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+myeloma%3A+increasing+evidence+for+a+multistep+transformation+process%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Multiple myeloma: increasing evidence for a multistep transformation process.</a> Blood. 91, 3-21 (1998).</li>
<li>Munsh, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Consensus+recommendations+for+risk+stratification+in+multiple+myeloma%3A+report+of+the+International+Myeloma+Workshop+Consensus+Panel+2%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Consensus recommendations for risk stratification in multiple myeloma: report of the International Myeloma Workshop Consensus Panel 2.</a> Blood. 117, 4696-4700 (2011).</li>
<li>Gole, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((cIg-FISH+On+Patients+with+Multiple+Myeloma+-+A+Modified+and+Simple+Technique+Easily+Incorporated+Into+Routine+Clinical+Service%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">cIg-FISH On Patients with Multiple Myeloma - A Modified and Simple Technique Easily Incorporated Into Routine Clinical Service.</a> Blood. 120, 4792-4792 (2012).</li>
<li>Lee, S. H., Erber, W., Porwit, A., Tomonaga, M., Peterson, L. I. C. S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematology%2C+ICSH+guidelines+for+the+standardization+of+bone+marrow+specimens+and+reports%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Laboratory+Hematology%22%5BJournal%5D)">Hematology, ICSH guidelines for the standardization of bone marrow specimens and reports.</a> International Journal of Laboratory Hematology. 30, 349-364 (2008).</li>
<li>Štifter, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+evaluation+of+bone+marrow+aspirate+and+biopsy+is+superior+in+the+prognosis+of+multiple+myeloma%5BTitle%5D)+AND+%22Diagnostic+Pathology%22%5BJournal%5D)">Combined evaluation of bone marrow aspirate and biopsy is superior in the prognosis of multiple myeloma.</a> Diagnostic Pathology. 5, 30(2010).</li>
<li>Huegel, A., Coyle, L., McNeil, R., Smith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+interphase+fluorescence+in+situ+hybridization+on+direct+hematological+bone+marrow+smears%5BTitle%5D)+AND+%22Pathology%22%5BJournal%5D)">Evaluation of interphase fluorescence in situ hybridization on direct hematological bone marrow smears.</a> Pathology. 27, 86-90 (1995).</li>
<li>Jacobsson, B., Bernell, P., Arvidsson, I., Hast, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Classical+morphology%2C+esterase+cytochemistry%2C+and+interphase+cytogenetics+of+peripheral+blood+and+bone+marrow+smears%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Classical morphology, esterase cytochemistry, and interphase cytogenetics of peripheral blood and bone marrow smears.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 44, 1303-1309 (1996).</li>
<li>Dunning, K., Safo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ultimate+Wright-Giemsa+stain%3A+60+years+in+the+making%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnic+%26+Histochemistry%22%5BJournal%5D)">The ultimate Wright-Giemsa stain: 60 years in the making.</a> Biotechnic & Histochemistry. 86, 69-75 (2011).</li>
<li>Woronzoff-Dashkoff, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+wright-giemsa+stain.+Secrets+revealed%5BTitle%5D)+AND+%22Clinics+in+Laboratory+Medicine%22%5BJournal%5D)">The wright-giemsa stain. Secrets revealed.</a> Clinics in Laboratory Medicine. 22, 15-23 (2002).</li>
<li>McPherson, R. A., Pincus, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Henry%27s+Clinical+diagnosis+and+Management+by+Laboratory+Methods+E-book%5BTitle%5D)+AND+%22Elsevier+Health+Sciences%22%5BJournal%5D)">Henry's Clinical diagnosis and Management by Laboratory Methods E-book.</a> Elsevier Health Sciences. , (2017).</li>
<li>Ross, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Report+from+the+European+Myeloma+Network+on+interphase+FISH+in+multiple+myeloma+and+related+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Haematologica%22%5BJournal%5D)">Report from the European Myeloma Network on interphase FISH in multiple myeloma and related disorders.</a> Haematologica. 97, 1272-1277 (2012).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

L'applicazione della FISH alla stratificazione del rischio genetico nel MM è essenziale. La parte critica dei rapporti FISH non sono tutte le cellule nucleate, ma i PC clonali specificamente purificati o identificati mediante smistamento con perline magnetiche anti-CD138 o marcatura con catena leggera di immunoglobuline citoplasmatiche κ o λ. Interphase FISH dopo LO SMISTAMENTO PC o cIg-FISH è risultato significativo nella diagnosi di MM a causa della percentuale relativamente inferiore di PC nel BM. Tuttavia, questi met...

Il mieloma multiplo (MM) è una malattia maligna delle plasmacellule (PC) con forte eterogeneità biologica e grandi differenze individuali nell'efficacia clinica, con periodi di sopravvivenza che vanno da mesi a decenni. Le caratteristiche citogenetiche sono importanti indicatori prognostici del MM. Il sistema di stratificazione del rischio e i trattamenti individualizzati basati su caratteristiche genetiche sono diventati argomenti di intenso interesse nella ricerca clinica sulla MM1. Le aberrazioni dei PC testati in un pannello di ibridazione fluorescente in situ (FISH) di midollo osseo (BM) includono del 13q14 (RB1), del 17p13 (TP53), t(4;14) (IGH/FGFR3), t(11;14) (IGH/MYEOV), t(14;16) (IGH/MAF), t(14:20) (IGH/MAFB), 1q21 (CKS1B) gain/amplification e 1p (CDKN2C) deletion.
La citogenetica standard delle metafasi deve essere inclusa nella valutazione iniziale dei pazienti con MM. Sebbene il cariotipo convenzionale a banda G offra il vantaggio di un'analisi dell'intero cromosoma, la bassa resa di questo metodo porta a molti risultati falsi negativi2. Tradizionalmente, i PC sono stati visti come in gran parte incapaci di scissione perché sono i prodotti allo stadio terminale della differenziazione dei linfociti B. Ciò rende difficile ottenere immagini divise. Una migliore analisi citogenetica nel MM con colture a lungo termine (6 giorni) e la stimolazione delle colture da parte delle citochine possono essere un metodo promettente per identificare le anomalie citogenetiche nei pazienti con MM di nuova diagnosi3. Anche quando il tempo di coltura è stato prolungato a 6 giorni, tuttavia, le anomalie citogenetiche sono state accuratamente riportate nel 30%-50% dei pazienti con MM4. Inoltre, il MM è caratterizzato da aberrazioni citogenetiche complesse che riflettono la sua eterogeneità prognostica. Tuttavia, la risoluzione della tradizionale tecnologia di banding cromosomico è bassa, il che può facilmente portare alla mancata rilevazione di anomalie cromosomiche nel MM.
La FISH interfase, preferibilmente dopo smistamento o marcatura con PC a base di perline magnetiche CD138-positive con catena leggera di immunoglobuline citoplasmatiche κ/λ, è indispensabile nell'analisi di MM5,6. Un campione selezionato CD138-positivo è fortemente raccomandato per la resa ottimizzata delle cellule tumorali. Tuttavia, una quantificazione accurata delle aberrazioni citogenetiche richiede almeno 4 ml di BM anticoagulato per lo smistamento del PC. Inoltre, le combinazioni di SMistamento immunomagnetico delle perline CD138 con FISH o immunoglobuline citoplasmatiche a catena leggera κ/λ con test FISH (cIg-FISH) aumentano numerosi costi sperimentali e richiedono molto tempo.
Di solito, il rapporto PC viene prima valutato dall'esame morfologico di strisci bm colorati o sezioni di biopsia BM7,8. I campioni di BM di altissima qualità (campioni di primo aspirato di midollo) vengono utilizzati per i test morfologici, mentre quelli inviati per FISH o altra rilevazione sono spesso i campioni di aspirato secondario con alti rapporti di diluizione con sangue periferico.
Già nel 1990, diversi studi hanno dimostrato che gli strisci BM possono essere utilizzati direttamente per gli esami FISH interstiziali, che ha dimostrato di essere un metodo affidabile e ripetibile9. Un elegante studio basato sulla morfologia cellulare e sulla citochimica dell'esterasi combinato con FISH di sangue periferico e strisci bm ha confermato il suo grande significato clinico per chiarire le anomalie cromosomiche in pazienti con leucemia granulocitica e linfocitica10.
Qui forniamo un nuovo metodo per migliorare il successo del rilevamento FISH interfase nei pazienti con MM.

<table><tbody><tr><td>macchina automatica per pesce</td><td>Leica&nbsp; Corporation</td><td>S500-24</td><td>FINAL Assy Thermobrite 240V</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Abbott Molecular Inc.</td><td>06J49-001</td><td>DAPI Counterstain</td></tr><tr><td>FISH Analysis Software</td><td>IMSTAR&nbsp; Software di analisi FISH per società</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IMSTAR Sonda FISH</td><td>Abbott Molecular Inc.</td><td>05N56-020</td><td>Vysis Locus Specifc Identifer TP53 / CEP 17 FISH Kit sonda</td></tr><tr><td>Pipetta a volume fisso</td><td>Eppendorf China Ltd.</td><td>M33768H</td><td>10&nbsp; microscopio</td></tr> a <tr><td>fluorescenza</td> da microlitri <td>Olympus Corporation</td><td>BX53</td><td>Microscopio a fluorescenza in avanti</td></tr><tr><td>Software per l'analisi del cariotipo</td><td>IMSTAR&nbsp; Corporation</td><td>IMSTAR</td><td>Software di analisi del cariotipo</td></tr><tr><td>Microscopio ottico</td><td>Olympus&nbsp; Corporation</td><td>BX41</td><td>Microscopio a luce diretta</td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Abbott Molecular Inc.</td><td>07J05-001</td><td>NP-40</td></tr><tr><td>Scaffale di tintura per colorazione in plastica</td><td>Guangzhou Kaixiu Trading Co., Ltd.</td><td>RSJ-501</td><td>&nbsp; 24 diapositive</td></tr><tr><td>Plastica colorazione tintura serbatoio</td><td>Guangzhou Kaixiu Trading Co., Ltd.</td><td>RSJ-516</td><td>&nbsp; 24 scivoli</td></tr><tr><td>Gomma Cemento</td><td>Marabu&nbsp; GmbH & Co. KG</td><td>FixoGum&nbsp;</td><td>Cemento di gomma</td></tr><tr><td>SSC</td><td>Abbott Molecular Inc.</td><td>02J10-032</td><td>20&volte; Fornitore verificato - SSC</td></tr><tr><td>Bagnomaria</td><td>Shanghai Boxun Medical Bio-Instrument Co., Ltd.</td><td>DK-8D</td><td>Bagnomaria a temperatura multipla</td></tr></tbody></table>

ibridazione in situ a fluorescenza interfase di strisci di midollo osseo di mieloma multiplo

Interphase Fluorescence in situ Hybridization of Bone Marrow Smears of Multiple Myeloma

Il rilevamento dell'ibridazione fluorescente in situ (FISH) è un metodo indispensabile nella stratificazione del rischio genetico nel mieloma multiplo (MM), che è una delle neoplasie ematologiche più comuni. La caratteristica identificativa del MM è l'accumulo di plasmacellule maligne nel midollo osseo. I rapporti FISH per MM si concentrano principalmente sulle plasmacellule clonali purificate o identificate, piuttosto che su tutte le cellule nucleate, ordinando con perline magnetiche anti-CD138 o marcando con catena leggera di immunoglobuline citoplasmatiche κ o λ. I nuclei interfasici del midollo osseo sono solitamente ottenuti da cellule fresche del midollo osseo. Tuttavia, un arricchimento soddisfacente dei campioni di plasmacellule richiede grandi quantità di eparina fresca anticoagulato, che non può essere ottenuta in caso di estrazione difficile del midollo osseo o di un rubinetto secco del midollo osseo. Qui, stabiliamo un nuovo metodo per migliorare il successo del rilevamento FISH su strisci di midollo osseo macchiati o non macchiati. Gli strisci di midollo osseo sono più facili da ottenere rispetto ai campioni di midollo osseo anticoagulato.

Nella valutazione morfologica iniziale di un paziente con MM di nuova diagnosi, il 15% dei PC in uno striscio di BM è risultato avere nuclei più grandi e più scuri insieme a quantità maggiori di citoplasma rispetto ai normali PC (Figura 2A). Il primo tubo di BM anticoagulato di eparina rilevato con la tecnica dell'immunofenotipo ha rivelato solo il 2,3% dei PC monoclonali aberranti. Lo smistamento immunomagnetico delle perline CD138 in combinazione con FISH o la tecnica cIg-FISH è essenziale...

Qui, presentiamo un protocollo per migliorare il successo del rilevamento dell'ibridazione in situ a fluorescenza interfase su strisci di midollo osseo da pazienti con mieloma multiplo.

Ibridazione in situ a fluorescenza interfase di strisci di midollo osseo di mieloma multiplo

Fluorescence in situ hybridization (FISH) detection is an indispensable method in genetic risk stratification in multiple myeloma (MM), which is one of ...

L'applicazione dell'ibridazione fluorescente in situ chiamata FISH alla stratificazione del rischio genetico nel mieloma multiplo è essenziale. La parte critica dei rapporti FISH non sono tutte le cellule nucleate, ma le plasmacellule clonali specificamente purificate o identificate mediante smistamento con perline magnetiche anti-CD138 o marcatura con immunoglobuline citoplasmatiche kappa o Lambda a catena leggera con test FISH chiamati cIg FISH. Interphase FISH dopo selezione delle plasmacellule o cIg FISH risulta essere significativo nella diagnosi di mieloma multiplo, a causa della percentuale relativamente più bassa di plasmacellule nel midollo osseo.Tuttavia, questi metodi presentano alcune carenze, tra cui processi complessi, elevate richieste di campioni e alti costi sperimentali. Le plasmacellule possono essere rapidamente localizzate in uno striscio di midollo osseo. Sulla base di questo, utilizziamo lo striscio di midollo osseo FISH per il rilevamento di cellule di mieloma multiplo.Questo studio è stato condotto secondo i principi della Dichiarazione di Helsinki e approvato dal Comitato Etico dell'Ospedale Zhongnan dell'Università di Wuhan. I campioni sono stati raccolti da un paziente con mieloma multiplo nel Dipartimento di Ematologia, Zhongnan Hospital dell'Università cinese di Wuhan. Posizionare il primo 0,2 millilitri di soluzione di midollo osseo su un vetrino monouso pulito, distribuire gli strisci di midollo osseo a spessore uniforme e code affilate rimuovendo rapidamente il midollo osseo, quindi asciugarlo naturalmente.Coprire i film di midollo osseo con un millilitro di soluzione di Wright-Giemsa per circa 10 secondi a temperatura ambiente. Aggiungere un millilitro di tampone fosfato ai vetrini, è stata necessaria attenzione per evitare che la soluzione colorante si asciugasse o scorresse dai vetrini. Mescolare delicatamente la soluzione colorante e mantenerla per 15 minuti a temperatura ambiente.Risciacquare i vetrini con acqua pulita e asciugarli all'aria a temperatura ambiente. Utilizzare la microscopia a luce diretta per rilevare le plasmacellule maligne, le plasmacellule devono essere ben disperse. Ora quello che vediamo sul campo sono le plasmacellule che sono abbastanza disperse.Questa è una tipica plasmacellula nucleare Binuclear. Coprire l'area ibridata con soluzione fissativa per 10 minuti per scolorire e fissare le plasmacellule. Risciacquare il vetrino con acqua deionizzata e asciugarlo all'aria a temperatura ambiente.Preriscaldare un barattolo contenente due volte il buffer SSC a 56 gradi Celsius a bagnomaria. Lavare lo striscio di midollo osseo preparato nel tampone SSC preriscaldato due volte per 10 minuti, seguito immergendolo in acqua deionizzata a temperatura ambiente. Disidratare lo striscio in un gradiente di etanolo 70%85% e 100% di etanolo ciascuno per un minuto.Asciugare lo striscio all'aria per 10 minuti. Per prima cosa aggiungere TP53 sul centromero della miscela di sonda del cromosoma 17 all'area di ibridazione e coprirlo con una slitta di copertura premere delicatamente le pinzette a punta fine per rimuovere le bolle d'aria da sotto. Sigillare tutti i lati dello slittamento del coperchio con cemento di gomma per garantire una buona tenuta.Dopo la solidificazione del cemento gommato, il vetrino è stato posizionato su una macchina automatica FISH la denaturazione è stata eseguita a 78 gradi Celsius per cinque minuti seguita dall'ibridazione a 37 gradi Celsius durante la notte. Prelevare lo scivolo dalla macchina FISH. Utilizzare una pinzetta a punta fine per rimuovere delicatamente il cemento di gomma.Immergere la diapositiva in due volte SSC a temperatura ambiente per circa uno o due minuti per lavare via il coperchio. Lavare la diapositiva a 68 gradi Celsius tampone di preriscaldamento a bagnomaria per due minuti. Lavare le diapositive con due volte SSC in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius per un minuto.Impostare al buio per asciugare accuratamente per 10 minuti a 10 microlitri di DAPI nell'area ibridata, coprire con un coperchio. Visualizza vetrino ibridato utilizzando un filtro adatto impostato su un microscopio a fluorescenza, usa il filtro ottico monocromatico blu fluoroforo per osservare l'intensità di fluorescenza del nucleo cellulare. Acquisire immagini del nucleo cellulare in un set di filtri DAPI.CEP17 è stato etichettato con fluorescenza verde. Utilizzare il filtro ottico a fluoroforo verde spettro per osservare la posizione di CEP17. Prendi l'immagine dei segnali CEP17 sotto il set di filtri verdi.Il gene TP53 è stato etichettato con fluorescenza arancione. Usa il filtro ottico al fluoroforo arancione dello spettro per osservare TP53, prendi l'immagine dei segnali TP53 sotto il set, unisci queste tre immagini in un'interezza ed esamina le anomalie numeriche. In una normale cellula interfase si osservano due segnali arancioni e due verdi all'interno di un nucleo con fluorescenza blu che indicano una coppia di cromosomi normali 17.I risultati hanno mostrato la morfologia e la genetica del midollo osseo in un paziente con mieloma multiplo. La figura A ha mostrato che il 15% delle plasmacellule in uno striscio di midollo osseo sono risultate avere più grandi e più scure e nucleari insieme a grandi quantità di citoplasma rispetto al normale. La figura B ha mostrato un'immagine in scala di grigi di rappresentante da una plasmacellula nucleata in uno striscio di midollo osseo.La figura C ha mostrato quattro segnali arancioni e quattro verdi in un nucleo interfase di plasmacellula suggerendo che quattro copie del cromosoma 17 erano localizzate in un nucleo. La figura D ha mostrato che il cariogramma cromosomico anormale di questo paziente ha confermato due coppie di cromosomi 17 in un nucleo. Gli strisci di midollo osseo sono molto più facili da ottenere rispetto ai campioni di midollo osseo anticoagulante perché ottenere midollo osseo anticoagulato richiede procedure complesse per ottenere il nucleo.Di conseguenza, abbiamo stabilito un metodo convincente per lo striscio di midollo osseo FISH per il rilevamento di cellule di mieloma multiplo.

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Microscopia di fluorescenza intravital (IVFM) del calvarium è applicata in combinazione con i modelli genetici animali per studiare l'homing e l'attecchimento di cellule ematopoietiche in nicchie del midollo osseo (BM).

La combinazione di microscopia di fluorescenza Intravital (IVFM) con modelli genetici per studiare la dinamica di attecchimento delle cellule ematopoietiche per nicchie di midollo osseo

Il presente protocollo descrive l'utilità dell'ibridazione in situ a fluorescenza multipla (mFISH) e del cariotipo spettrale (SKY) nell'identificare aberrazioni stabili intercromosomiche nelle cellule del midollo osseo dei topi dopo l'esposizione all'irradiazione corporea totale.

Rilevazione di Inter-aberrazioni cromosomiche stabili per fluorescenza multipla<em&gt; In Situ</em&gt; Ibridazione (mFISH) e spettrale cariotipo (SKY) in topi irradiati

Rilevazione della malattia residua minima o misurabile (MRD) è un biomarcatore prognostico importante per raffinazione di valutazione del rischio e la previsione di ricaduta in leucemia mieloide acuta (AML). Queste linee guida complete e consigli con le migliori pratiche di coerente e accurata individuazione e rilevazione del MRD, può essere di aiuto nel prendere le decisioni efficace trattamento di AML.

Protocollo completo del campione e del midollo osseo di processo per misurare la malattia residua misurabile e cellule staminali leucemiche nella leucemia mieloide acuta

Qui descriviamo un protocollo per multiplex immunohistochemical fluorescente di colorazione e di imaging per la localizzazione simultanea di più antigeni tumore-associati nel linfoma. Questo protocollo può essere esteso all'analisi di colocalizzazione dei biomarcatori all'interno di tutte le sezioni di tessuto.

La macchiatura di Immunohistochemical fluorescente multiplex, Imaging e analisi in campioni istologici di linfoma

Qui viene presentato un protocollo dettagliato per isolare e caratterizzare le popolazioni microambientali del midollo osseo da modelli murini di sindromi mielodisplastiche e leucemia mieloide acuta. Questa tecnica identifica i cambiamenti nella nicchia del midollo osseo non ematopoietico, comprese le cellule stromali endoteliali e mesenchimali, con progressione della malattia.

Identificazione delle popolazioni microambientali del midollo osseo nella sindrome mielodisplastica e nella leucemia mieloide acuta

Qui, viene descritto un metodo basato sulla citometria a fosfoflusso per analizzare la segnalazione a valle delle vie mTORC1, JAK/STAT5 e MAPK in cellule di leucemia mieloide umana acuta xenotrapiantate in topi e ottenute da aspirati di midollo osseo. I livelli di p-STAT5, p-4EBP1, p-RPS6 e p-ERK1/2 vengono misurati simultaneamente utilizzando un citometro a flusso spettrale di nuova generazione ad alta sensibilità.

Citometria intracellulare a fosfoflusso di pazienti con leucemia mieloide acuta Xenotrapianti derivati da pazienti

Impara l'ibridazione in situ a fluorescenza interfase su strisci di midollo osseo per il mieloma multiplo. Questo metodo migliora l'identificazione delle cellule plasmatiche clonali con costi ridotti.

Ibridazione in situ a fluorescenza interfase di strisci di midollo osseo di mieloma multiplo

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