Ibridazione in situ a fluorescenza interfase di strisci di midollo osseo di mieloma multiplo
15 aprile 2022
Qui, presentiamo un protocollo per migliorare il successo del rilevamento dell'ibridazione in situ a fluorescenza interfase su strisci di midollo osseo da pazienti con mieloma multiplo.
L'applicazione dell'ibridazione fluorescente in situ chiamata FISH alla stratificazione del rischio genetico nel mieloma multiplo è essenziale. La parte critica dei rapporti FISH non sono tutte le cellule nucleate, ma le plasmacellule clonali specificamente purificate o identificate mediante smistamento con perline magnetiche anti-CD138 o marcatura con immunoglobuline citoplasmatiche kappa o Lambda a catena leggera con test FISH chiamati cIg FISH. Interphase FISH dopo selezione delle plasmacellule o cIg FISH risulta essere significativo nella diagnosi di mieloma multiplo, a causa della percentuale relativamente più bassa di plasmacellule nel midollo osseo.
Tuttavia, questi metodi presentano alcune carenze, tra cui processi complessi, elevate richieste di campioni e alti costi sperimentali. Le plasmacellule possono essere rapidamente localizzate in uno striscio di midollo osseo. Sulla base di questo, utilizziamo lo striscio di midollo osseo FISH per il rilevamento di cellule di mieloma multiplo.
Questo studio è stato condotto secondo i principi della Dichiarazione di Helsinki e approvato dal Comitato Etico dell'Ospedale Zhongnan dell'Università di Wuhan. I campioni sono stati raccolti da un paziente con mieloma multiplo nel Dipartimento di Ematologia, Zhongnan Hospital dell'Università cinese di Wuhan. Posizionare il primo 0,2 millilitri di soluzione di midollo osseo su un vetrino monouso pulito, distribuire gli strisci di midollo osseo a spessore uniforme e code affilate rimuovendo rapidamente il midollo osseo, quindi asciugarlo naturalmente.
Coprire i film di midollo osseo con un millilitro di soluzione di Wright-Giemsa per circa 10 secondi a temperatura ambiente. Aggiungere un millilitro di tampone fosfato ai vetrini, è stata necessaria attenzione per evitare che la soluzione colorante si asciugasse o scorresse dai vetrini. Mescolare delicatamente la soluzione colorante e mantenerla per 15 minuti a temperatura ambiente.
Risciacquare i vetrini con acqua pulita e asciugarli all'aria a temperatura ambiente. Utilizzare la microscopia a luce diretta per rilevare le plasmacellule maligne, le plasmacellule devono essere ben disperse. Ora quello che vediamo sul campo sono le plasmacellule che sono abbastanza disperse.
Questa è una tipica plasmacellula nucleare Binuclear. Coprire l'area ibridata con soluzione fissativa per 10 minuti per scolorire e fissare le plasmacellule. Risciacquare il vetrino con acqua deionizzata e asciugarlo all'aria a temperatura ambiente.
Preriscaldare un barattolo contenente due volte il buffer SSC a 56 gradi Celsius a bagnomaria. Lavare lo striscio di midollo osseo preparato nel tampone SSC preriscaldato due volte per 10 minuti, seguito immergendolo in acqua deionizzata a temperatura ambiente. Disidratare lo striscio in un gradiente di etanolo 70%85% e 100% di etanolo ciascuno per un minuto.
Asciugare lo striscio all'aria per 10 minuti. Per prima cosa aggiungere TP53 sul centromero della miscela di sonda del cromosoma 17 all'area di ibridazione e coprirlo con una slitta di copertura premere delicatamente le pinzette a punta fine per rimuovere le bolle d'aria da sotto. Sigillare tutti i lati dello slittamento del coperchio con cemento di gomma per garantire una buona tenuta.
Dopo la solidificazione del cemento gommato, il vetrino è stato posizionato su una macchina automatica FISH la denaturazione è stata eseguita a 78 gradi Celsius per cinque minuti seguita dall'ibridazione a 37 gradi Celsius durante la notte. Prelevare lo scivolo dalla macchina FISH. Utilizzare una pinzetta a punta fine per rimuovere delicatamente il cemento di gomma.
Immergere la diapositiva in due volte SSC a temperatura ambiente per circa uno o due minuti per lavare via il coperchio. Lavare la diapositiva a 68 gradi Celsius tampone di preriscaldamento a bagnomaria per due minuti. Lavare le diapositive con due volte SSC in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius per un minuto.
Impostare al buio per asciugare accuratamente per 10 minuti a 10 microlitri di DAPI nell'area ibridata, coprire con un coperchio. Visualizza vetrino ibridato utilizzando un filtro adatto impostato su un microscopio a fluorescenza, usa il filtro ottico monocromatico blu fluoroforo per osservare l'intensità di fluorescenza del nucleo cellulare. Acquisire immagini del nucleo cellulare in un set di filtri DAPI.
CEP17 è stato etichettato con fluorescenza verde. Utilizzare il filtro ottico a fluoroforo verde spettro per osservare la posizione di CEP17. Prendi l'immagine dei segnali CEP17 sotto il set di filtri verdi.
Il gene TP53 è stato etichettato con fluorescenza arancione. Usa il filtro ottico al fluoroforo arancione dello spettro per osservare TP53, prendi l'immagine dei segnali TP53 sotto il set, unisci queste tre immagini in un'interezza ed esamina le anomalie numeriche. In una normale cellula interfase si osservano due segnali arancioni e due verdi all'interno di un nucleo con fluorescenza blu che indicano una coppia di cromosomi normali 17.
I risultati hanno mostrato la morfologia e la genetica del midollo osseo in un paziente con mieloma multiplo. La figura A ha mostrato che il 15% delle plasmacellule in uno striscio di midollo osseo sono risultate avere più grandi e più scure e nucleari insieme a grandi quantità di citoplasma rispetto al normale. La figura B ha mostrato un'immagine in scala di grigi di rappresentante da una plasmacellula nucleata in uno striscio di midollo osseo.
La figura C ha mostrato quattro segnali arancioni e quattro verdi in un nucleo interfase di plasmacellula suggerendo che quattro copie del cromosoma 17 erano localizzate in un nucleo. La figura D ha mostrato che il cariogramma cromosomico anormale di questo paziente ha confermato due coppie di cromosomi 17 in un nucleo. Gli strisci di midollo osseo sono molto più facili da ottenere rispetto ai campioni di midollo osseo anticoagulante perché ottenere midollo osseo anticoagulato richiede procedure complesse per ottenere il nucleo.
Di conseguenza, abbiamo stabilito un metodo convincente per lo striscio di midollo osseo FISH per il rilevamento di cellule di mieloma multiplo.
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Panoramica
Questo articolo presenta un protocollo per migliorare l'efficacia della rilevazione di ibridazione fluorescente in situ (FISH) in interfase su strisci di midollo osseo provenienti da pazienti con mieloma multiplo. Lo studio sottolinea l'importanza di identificare con precisione le cellule plasmatiche clonali per una diagnosi efficace.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Oncoologia
- Genetica
Sfondo
- L'ibridazione fluorescente in situ (FISH) è fondamentale per la stratificazione del rischio genetico nel mieloma multiplo.
- Le cellule plasmatiche clonali devono essere identificate specificamente per una corretta segnalazione della FISH.
- I metodi attuali presentano limitazioni, tra cui complessità e costi elevati.
- Strisci di midollo osseo possono facilitare un'identificazione più rapida delle cellule plasmatiche.
Scopo dello studio
- Migliorare il rilevamento delle cellule del mieloma multiplo mediante FISH su striscio di midollo osseo.
- Correggere i limiti dei metodi FISH esistenti.
- Ottimizzare il processo di identificazione delle cellule plasmatiche clonali.
Metodi Utilizzati
- Utilizzo di microsfere magnetiche anti-CD138 per il frazionamento delle cellule plasmatiche.
- Applicazione della marcatura immunocitochimica delle catene leggere kappa o lambda nel citoplasma.
- Applicazione della FISH in interfase dopo il frazionamento delle cellule plasmatiche.
- Utilizzo della FISH su striscio di midollo osseo per una rilevazione efficace.
Risultati principali
- L'analisi citogenetica su striscio di midollo osseo identifica efficacemente le cellule del mieloma multiplo.
- Maggiore accuratezza nella diagnosi del mieloma multiplo grazie al rilevamento mirato delle cellule plasmatiche.
- Riduzione della quantità di campione richiesta e dei costi sperimentali rispetto ai metodi tradizionali.
- Un protocollo migliorato consente una diagnosi e una pianificazione del trattamento più rapide.
Conclusioni
- Lo studio presenta un'alternativa praticabile per il rilevamento delle cellule del mieloma multiplo.
- La FISH su striscio di midollo osseo può superare i limiti delle tecniche FISH esistenti.
- La ricerca futura potrebbe concentrarsi sull'ulteriore ottimizzazione di questo metodo per l'uso clinico.
Domande Frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Questo metodo affronta un collo di bottiglia fondamentale nella diagnostica del mieloma multiplo, consentendo l'analisi FISH su strisci di midollo osseo facilmente disponibili, riducendo la dipendenza da prelievi aspirati freschi e eparinizzati. Supporta una stratificazione genetica del rischio più rapida e accessibile nei flussi di lavoro di ematologia oncologica, in particolare quando il reperimento del campione è difficoltoso. L'approccio migliora la continuità traslazionale aumentando la fattibilità del campione senza compromettere la specificità delle cellule plasmatiche clonali.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi di anomalie cromosomiche in cellule plasmatiche clonali direttamente da strisci, supportando la riduzione del rischio meccanicistica dei bersagli genomici.
- Valore operativo: Riduce la complessità di lavorazione del campione eliminando la necessità di separazione cellulare o arricchimento prima della FISH.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Fornisce una piattaforma standardizzata basata su strisci per la FISH in interfase, che migliora la prontezza del saggio in campioni con resa ridotta o di difficile ottenimento.
- Valore operativo: Aumenta la riproducibilità riducendo al minimo le variabili pre-analitiche associate alla manipolazione e al trattamento di prelievi freschi.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Supporta studi allineati ai biomarcatori preservando il contesto spaziale delle cellule plasmatiche nei strisci, consentendo la correlazione tra morfologia e alterazioni genetiche.
- Valore operativo: Facilita il monitoraggio longitudinale in modelli preclinici in cui l'aspirato ripetuto di midollo osseo è impraticabile.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nel continuum scoperta-traslazione fornendo un flusso di lavoro FISH realizzabile quando i campioni primari sono limitati, consentendo analisi genetiche successive senza ritardare l'identificazione dei composti promettenti o la validazione preclinica.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica di ipotesi relative ad alterazioni genomiche clonali consentendo l'ibridazione fluorescente in situ (FISH) su strisci di midollo osseo archiviati o difficili da processare.
- Screening: Migliora la standardizzazione dei saggi utilizzando strisci come substrato uniforme per l'ibridazione e la rilevazione del segnale.
- Analisi: Consente una valutazione quantitativa dei cambiamenti nel numero di copie cromosomiche (ad esempio, TP53, CEP17) nei nuclei in interfase, fornendo informazioni per la stratificazione del rischio.
- Ricerca traslazionale: Mantiene la continuità dalla fase di scoperta alla validazione preclinica, permettendo campionamenti ripetuti mediante strisci in studi longitudinali.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce un protocollo riutilizzabile per la preparazione di strisci pronti per l'analisi FISH, applicabile a diversi modelli di mieloma multiplo e tipi di campione.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Migliora la fiducia predittiva nella valutazione del rischio genomico consentendo l'ibridazione fluorescente in situ (FISH) su campioni altrimenti non adatti all'analisi.
- Valore operativo: Aumenta la produttività del laboratorio e riduce i tempi di consegna semplificando la preparazione dei campioni.
- Valore strategico: Riduce i rischi biologici e tecnici nelle fasi iniziali di decisione ampliando l'accesso a dati citogenetici fondamentali.
- Impatto sul portafoglio: Favorisce un avanzamento basato sulla valutazione del rischio rendendo praticabile la stratificazione basata sulla FISH in contesti con risorse limitate o in ambito clinico.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella progettazione delle sonde FISH, nell'ibridazione e nella microscopia a fluorescenza per un'interpretazione accurata del segnale.
- Dipende dall'accesso a strumentazione FISH standard, inclusi camere di ibridazione, tamponi di lavaggio e set di filtri per DAPI, spettro verde e spettro arancione.
- Necessita della standardizzazione delle procedure di preparazione degli strisci e di colorazione per garantire una morfologia dei plasmacellule costante e una buona conservazione.
- Deve tenere conto della variabilità della densità dei plasmacellule negli strisci al fine di determinare la profondità del campionamento e le soglie di quantificazione del segnale.
- Limitato all'analisi in interfase; non consente il cariotipaggio in metafase o il rilevamento di riarrangiamenti strutturali senza l'impiego di metodi aggiuntivi.
