Costruzione manuale di un microarray di tessuti utilizzando il metodo a nastro e un microarrayer portatile

Il microarray tissutale, o TMA, è un importante strumento di ricerca che assembla piccoli pezzi esemplari di tessuto noti come nuclei di tessuto da blocchi di tessuto incorporati di paraffina fissati in formalina, denominati blocchi di donatori, in un singolo blocco di paraffina. Il metodo del nastro è un metodo di costruzione completamente manuale che inverte il processo di costruzione lanciando il blocco attorno a nuclei verticali ed è quindi compatibile con blocchi di donatori non ideali e utilizza microarrayer di tessuto portatili usa e getta poco costosi e ampiamente disponibili. Il flusso di lavoro in più fasi di questo processo sarà dimostrato da Mr.Lee Wisner e Dr.Brandon Larsen.

Uno dei concetti più importanti da ricordare quando si costruiscono blocchi di TMA è il fatto che i tessuti in blocchi di tessuto incorporato di paraffina fissati in formalina sono in realtà strutture tridimensionali. Abbiamo sviluppato un'animazione qui per aiutare a spiegare questo concetto. Quello che vedete qui è un'animazione che raffigura un blocco di tessuto incorporato di paraffina fissato alla formalina che mostra la natura tridimensionale di quel tessuto all'interno del blocco.

Puoi vedere che il tessuto è visibile nella parte superiore del blocco e quell'area è piuttosto grande. Se fossimo in grado di avere una visione a raggi X, per così dire, e vedere attraverso il blocco, potremmo vedere che il tessuto non è in realtà uniformemente modellato più in profondità all'interno di quel blocco, quasi come un iceberg nell'oceano, dove ciò che vedi sulla superficie potrebbe non rappresentare effettivamente ciò che c'è sotto. All'interno di quel blocco di tessuto ci possono essere pezzi di tessuto aggiuntivi che non sono visibili sulla superficie.

Ci possono essere aree di necrosi o morte tissutale all'interno del centro di quel tessuto più in basso. Un patologo dovrebbe effettivamente rivedere quella sezione bidimensionale dalla parte superiore di quel blocco di tessuto e quindi annotare quella diapositiva per mostrare le aree che contengono il tessuto di interesse ed escludere la necrosi o altri tipi di tessuto che non sono effettivamente di interesse. Per facilitare il corretto campionamento del nucleo del tessuto, il patologo dovrebbe fare tre cose.

In primo luogo, utilizzando una penna per la marcatura di diapositive, il patologo segnerà il tessuto di interesse sul vetrino in modo che altri tessuti possano essere evitati. In secondo luogo, se ci sono aree all'interno di quell'area di interesse che dovrebbero essere evitate, il patologo può usare la stessa penna di marcatura per cancellare quelle aree che non dovrebbero essere campionate. Infine, preferibilmente utilizzando un diverso colore di penna, il patologo dovrebbe contrassegnare quelle aree che sono ideali all'interno dell'area di interesse per il campionamento del nucleo e la costruzione TMA.

È importante tenere presente che quando questo processo è fatto che la composizione del tessuto può cambiare più in profondità all'interno di dove viene ottenuto un campione di nucleo e lo mostreremo qui nell'animazione, che la posizione del nucleo determinerà la composizione di quel nucleo, che varierà in base alla profondità del tessuto e a ciò che è presente all'interno di quel blocco. Ad esempio, qui il primo nucleo che stiamo illustrando sta catturando una porzione del tessuto nella sua metà superiore, ma più in profondità all'interno del blocco non c'è più alcun tessuto presente da cui è ottenuto quel nucleo, quindi è stata campionata solo la cera di paraffina. Il secondo nucleo che abbiamo illustrato qui ha catturato il tessuto lungo tutta la sua lunghezza perché il tessuto è presente in tutta la profondità di quel blocco in quella posizione.

Il terzo nucleo ha catturato una porzione di tessuto e poi ha catturato una porzione di cera di paraffina al centro dove non c'era tessuto presente e poi ha catturato un po 'più di tessuto nella sua estremità inferiore dove c'era tessuto nella parte inferiore di quel blocco. Una volta completata la revisione della patologia, compilare l'elenco finale dei blocchi di donatori da utilizzare nella costruzione TMA, quindi creare una mappa TMA. La mappa TMA è uno schema che delinea dove i nuclei saranno posizionati nella TMA completata e le sezioni di tessuto montate su vetrino tagliate dal TMA risultante.

Ai fini dell'orientamento, assicurarsi che la mappa TMA eviti di posizionare i nuclei in una matrice uniforme come una matrice tre per tre o quattro per quattro e includa almeno un marcatore di orientamento. Poiché il metodo del nastro inverte il processo di costruzione versando cera fusa attorno ai nuclei invertiti, ciò richiede la creazione di una seconda mappa nota come mappa di costruzione che è un'immagine speculare della mappa TMA. La mappa di costruzione mostra dove ogni nucleo deve essere posizionato durante la costruzione per apparire nella posizione corretta nel TMA completato.

Una volta create le mappe, preparare lo stampo di base TMA in metallo. Per guidare il posizionamento del nucleo utilizzare una griglia a scacchi di carta usa e getta. Tagliare la griglia a scacchi di carta a misura e apporre un pezzo di nastro biadesivo sul retro della griglia.

Posizionare la griglia e il nastro adesivo nel vassoio metallico e aggiungere un secondo pezzo di nastro biadesivo sulla parte superiore della griglia. Sovrapporre il vetrino H&E rivisto dalla patologia sul blocco di tessuto FFPE da punzonare e utilizzare i segni del patologo per identificare dove il blocco di tessuto deve essere perforato. Utilizzando un punzone manuale portatile, monouso o riutilizzabile, perforare il blocco donatore FFPE nella regione appropriata.

Se si utilizza un punzone riutilizzabile, assicurarsi che venga pulito prima e dopo ogni punzonatura del tessuto. Espellere il nucleo dal punzone del nucleo. Utilizzare un plettro ad ago per posizionare il nucleo espulso sul mirino della griglia coperta di nastro biadesivo.

Assicurarsi che il nucleo sia posizionato in modo verticale e invertito in modo tale che l'estremità del tessuto del nucleo entri in contatto con il nastro e si trovi nella posizione corretta come indicato dalla mappa di costruzione. Ripetere fino a quando tutti i blocchi donatori sono animati e i nuclei sono posizionati nelle posizioni appropriate. Una volta che tutti i nuclei sono a posto, etichettare una cassetta di plastica e posizionarla sopra la base metallica contenente i nuclei.

L'altezza delle anime non deve superare la profondità del vassoio metallico poiché le anime alte verranno inclinate o rovesciate quando la cassetta viene messa in posizione. Versare delicatamente la paraffina fusa attraverso la cassetta nel vassoio dei nuclei. Lasciare traboccare la paraffina fusa per assicurarsi che non ci siano bolle d'aria nel corpo del TMA.

Assicurarsi che la paraffina si riempia nella parte superiore della cassetta in modo tale che la cassetta sia incorporata e saldamente legata al blocco di paraffina una volta solidificata. Lasciare raffreddare il blocco a temperatura ambiente per 30 minuti e non spostare il blocco durante questo periodo. Conservare in frigorifero il blocco a quattro gradi Celsius per altri 30 minuti per solidificare completamente.

Una volta completamente impostato, separare delicatamente lo stampo di base in metallo e rimuovere il nastro biadesivo dal blocco di paraffina. Una volta costruito il TMA, utilizzare un microtomo per sezionare il nuovo TMA. Una volta che il blocco è stato affrontato in modo appropriato, raccogliere sezioni di tessuto a tutta faccia.

Trasferire le sezioni in un bagno d'acqua preriscaldato e montare a scorrimento le sezioni di tessuto. Una volta asciutto, inviare sezioni rappresentative per la colorazione H & E e qualsiasi ulteriore colorazione immunoistochimica che potrebbe essere richiesta. Inviare le sezioni TMA colorate per la revisione patologica.

Per la convalida TMA, il patologo dovrebbe rivedere il vetrino H & E dal blocco TMA e rivedere ogni punto circolare al microscopio per vedere se il tessuto di interesse è presente. Una componente critica del processo di costruzione è l'identificazione dei tessuti di interesse in un determinato blocco di donatori da cui dovrebbe essere ottenuto il nucleo TMA. La prima colonna di questa figura mostra H&E donatori esemplari con i segni del patologo.

La seconda colonna mostra l'area perforata dei tessuti colorati H & E. La terza colonna mostra il tessuto colorato H & E dei nuclei TMA che sono stati raccolti dai blocchi donatori nelle aree mostrate nelle colonne uno e due. Il patologo può visualizzare insieme il blocco del donatore abbinato e gli H&E del nucleo TMA per convalidare che l'area di interesse è stata raccolta e che la composizione tissutale è la stessa.

Esistono due metriche principali per il completamento con successo di un TMA con il metodo del nastro. Il primo è la presenza di punti di nucleo tissutale nelle posizioni previste e la distanza l'uno dall'altro, che viene valutata mediante ispezione visiva. Le immagini mostrate in A e B raffigurano due TMA con metodo a nastro completate con successo e le corrispondenti diapositive H & E.

Le ispezioni visive di questi blocchi TMA mostrano che i nuclei sono presenti e regolarmente distanziati in ciascun TMA e nelle sezioni corrispondenti. Alcuni dei principali problemi di costruzione che possono sorgere durante il processo di costruzione del metodo del nastro includono la separazione del blocco e della cassetta a causa della rimozione prematura della base metallica prima della solidificazione, come mostrato nell'immagine C.Il ribaltamento del nucleo e / o la deriva di posizionamento dei nuclei incorporati come mostrato nell'immagine D può verificarsi mentre il versamento eccessivamente turbolento della paraffina fusa, che può essere peggiorato da nastro biadesivo scarsamente adesivo. Questa figura mostra che la macchia H & E per ciascuno dei core è un TMA esemplare.

Tutti tranne uno dei punti principali sono presenti nell'H & E. La figura mostra anche che alcuni dei nuclei sono presenti come punti di tessuto circolari completi, mentre altri non sono completamente presenti. Tale perdita di tessuto non è rara e può essere dovuta a un blocco insufficiente per rivelare tutti i nuclei per intero.

In alternativa, la presenza di tessuto incompleto o totale può derivare dalla scarsa qualità tissutale di quel nucleo, che può comportare la perdita di tessuto durante il processo di colorazione. In questa figura successiva è stata eseguita l'immunoistochimica e la colorazione RNA ISH sulle sezioni TMA per convalidare ulteriormente la TMA. Come mostrato qui, è possibile utilizzare una varietà di macchie a seconda del tessuto utilizzato per costruire il TMA.

Vimentin è usato come controllo di qualità. U6 è un indicatore della qualità dell'RNA. EBER viene utilizzato per determinare lo stato EBV.

E CD20 è un marcatore di cellule B per indicare la presenza di cellule B. Queste sono alcune macchie che possono essere utilizzate per aiutare a convalidare il TMA. Dopo aver visto questo video, dovresti capire come realizzare un microarray tissutale usando il metodo del nastro e perché le TMA sono importanti strumenti di ricerca per risparmiare tempo e risorse.

Dovresti anche capire che la costruzione del TMA non è un processo ideale e che la guida e la revisione patologica continua sono componenti critici non solo durante il processo di costruzione, ma anche per gli studi immunoistochimici eseguiti su sezioni TMA al fine di garantire che il tessuto di interesse sia effettivamente presente nella sezione TMA.