Saggi di immunocitochimica delle cellule 3D del glioma diffuso della linea mediana pediatrica

Il glioma diffuso della linea mediana è un tumore cerebrale altamente invasivo. Questo metodo aiuta a studiare in tempo reale come le cellule DMG migrano e invadono in un contesto 3D con approfondimenti specifici sul ruolo potenziale di una molecola di adesione chiave. Utilizzando un reagente di marcatura e un anticorpo specifico anti-CD44, possiamo studiare mediante imaging cellulare vivo l'espressione di CD44 sulla membrana plasmatica sulle cellule DMG anche nella migrazione e invasione 3D.

L'applicazione di questa tecnica ha evidenziato il potenziale ruolo di CD44 nella motilità di queste cellule, suggerendo che potrebbe rappresentare un bersaglio molecolare prezioso e invasivo. Per iniziare, reidratare l'ALR aggiungendo 100 microlitri di acqua sterile e mescolare la soluzione mediante pipettaggio. Mescolare l'anticorpo con l'ALR nel mezzo TSM in una piastra multipozzetto a fondo rotondo o in un tubo ambra e proteggerlo dalla luce.

Preparare una quantità sufficiente di terreno per erogare 25 microlitri per pozzetto a tre volte la concentrazione finale del saggio e quindi incubare a temperatura ambiente per 15 minuti. Diluire BSR nel mezzo TSM a concentrazione di 1,5 millimolari per ottenere una concentrazione finale di 0,5 millimolari alla fine del test. Quindi rimuovere delicatamente e lentamente 75 microlitri del mezzo da ciascun pozzetto, evitando di toccare il fondo del pozzo dove si trova il NS e controllando visivamente la presenza del NS.

Aggiungere delicatamente 25 microlitri del complesso anticorpale BSR e ALR a ciascun pozzetto e lasciare che il complesso anticorpale ALR si mescoli con il mezzo per due o tre minuti. Utilizzando un microscopio invertito, assicurarsi che ogni NS sia posizionato centralmente sul fondo del pozzo. Evitare la formazione di bolle rimuovendole con un ago.

Mettere il piatto sul ghiaccio per cinque minuti per far raffreddare il fondo del piatto. Erogare 75 microlitri di BMM per pozzetto posizionando una punta P200 pre-raffreddata sulla parete interna del pozzetto, evitando la formazione di bolle e toccando il fondo del pozzetto. Lasciare la piastra sul ghiaccio per cinque minuti per lasciare che il BMM si mescoli con il mezzo.

Utilizzando un microscopio invertito, controllare la posizione di NS. E se non presente centralmente, centrifugare la piastra a quattro gradi Celsius a 180 volte G per cinque minuti. Quindi trasferire la piastra nello strumento di analisi delle cellule vive posto all'interno dell'incubatore impostato a 37 gradi Celsius, 5% di anidride carbonica e 95% di umidità. Una volta che i pozzetti sono rivestiti con BMM, tagliare una punta P200.

Prendi 50 microlitri del mezzo cellulare e NS da ciascun pozzetto selezionato e trasferiscilo in un pozzetto a fondo piatto rivestito. Controllare visivamente la presenza e la posizione del NS in ciascun pozzetto. Aggiungere delicatamente 50 microlitri di anticorpi BSR e ALR diluiti a ciascun pozzetto, aspettando due o tre minuti per lasciare che i reagenti si mescolino.

E usando un microscopio invertito, assicurati che la maggior parte dei NS replicati siano situati centralmente nel pozzo. Dopo aver verificato l'assenza di bolle, trasferire delicatamente la piastra nello strumento di analisi delle cellule vive come dimostrato in precedenza. Sul software dello strumento di analisi delle cellule vive, selezionare l'opzione di pianificazione da acquisire, quindi fare clic sulla scheda più e selezionare scansione in programma per scansionare le lastre con intervalli come indicato nel manoscritto di testo.

Nella finestra del software, creare o ripristinare la nave e quindi fare clic sull'opzione Nuovo. Selezionare il tipo di scansione sferoide, la fase più il campo luminoso, i canali di immagine verde per il test di invasione e l'obiettivo 4X. Selezionare la scansione di clonazione della diluizione, digitare 4X obiettivo e fase e verde per il test di migrazione.

Selezionare il tipo di piastra e definire i pozzetti da scansionare evidenziandoli sulla mappa della piastra, quindi impostare la frequenza di scansione. Fare clic su Aggiungi a programma e avviare la scansione. Selezionare la scheda Crea nuova definizione di analisi.

Quindi selezionare invasione sferoide o applicazione analizzatore di base per invasione e migrazione rispettivamente nella scheda. Selezionare i canali appropriati per l'invasione e la migrazione nel canale immagine. Selezionate alcune immagini rappresentative da tre a quattro pozzetti per visualizzare in anteprima e perfezionare l'impostazione di analisi.

Per il saggio di invasione, nella scheda di definizione dell'analisi, regolare le impostazioni dell'applicazione nei canali brightfield e green con le impostazioni menzionate nel manoscritto di testo per generare una segmentazione precisa tra le cellule sferoidi e invasori. Per il test di migrazione, regolare le impostazioni dell'applicazione come indicato nel manoscritto di testo nei canali fase e verde per generare una segmentazione precisa tra la confluenza e le celle verdi. Verificare che le impostazioni di analisi siano corrette per il NS facendo clic in modo casuale su diversi pozzi.

Selezionare i pozzi e i punti temporali da analizzare. Salvate la definizione dell'analisi e fate clic su Fine (Finish). Le immagini confocali immunofluorescenti rappresentative dell'espressione di CD44 in cellule derivate da pazienti DMG primari hanno dimostrato il ruolo di CD44 nella migrazione e nell'invasione cellulare.

L'immunochimica delle cellule 3D dal vivo consente di visualizzare l'espressione di CD44. I fotogrammi rappresentativi del time lapse sia per la migrazione che per l'invasione mostrano la presenza e l'assenza del segnale fluorescente verde sulla stessa cellula osservata nel tempo, suggerendo che l'espressione di CD44 è accesa e spenta mentre le cellule migrano e invadono. I processi di migrazione e invasione sono seguiti per 96 ore, mostrando cellule QCTB-R059 con un alto livello di CD44.

La quantificazione dell'espressione di CD44 e il suo aumento nel tempo è stata misurata dal segnale complessivo di fluorescenza verde associato all'ALR sia per la migrazione che per l'invasione. Quando l'anticorpo anti-CD44 viene utilizzato su cellule vive, influenza la morfologia cellulare, inducendo una transizione dall'invasione mesenchimale a quella ameboide e una riduzione della capacità invasiva e migratoria di queste cellule. Le fasi più critiche del metodo sono la miscelazione del reagente di etichettatura con un anticorpo, l'aggiunta della miscela al Matrigel e del mezzo e l'accesso allo strumento di imaging delle cellule vive.

Questo metodo può essere ulteriormente implementato mediante l'uso di due o più reagenti e anticorpi marcatori distintivi per studiare l'interazione delle cellule DMG mediata da cellule dirette e contatto. Il nostro metodo offre nuovi strumenti per studiare in 3D i meccanismi cellulari e molecolari della migrazione e dell'invasione del DMG, fornendo nuove direzioni per inibire il loro fenotipo infiltrativo.