Applicazione del movimento passivo della testa per generare accelerazioni definite alle teste dei roditori
21 luglio 2022
Il presente protocollo descrive un sistema di "movimento passivo della testa" progettato su misura, che riproduce le accelerazioni meccaniche alle teste dei roditori generate durante il loro tapis roulant che corre a velocità moderate. Permette di sezionare fattori/elementi meccanici dagli effetti benefici dell'esercizio fisico.
Il nostro protocollo aiuta a rispondere alle domande su come l'esercizio fisico supporta l'omeostasi dell'organismo. I sistemi ci hanno permesso di analizzare gli effetti meccanici diretti sul cervello dalle complesse conseguenze di attività fisiche come camminare e fare jogging. Per iniziare, fissare l'accelerometro sulla parte superiore della testa di un topo usando del nastro chirurgico.
Dopo il completo recupero dall'anestesia, posizionare il topo nella macchina del tapis roulant. Regolare il tapis roulant a una velocità moderata a 20 metri al minuto. Utilizzare il software applicativo per misurare l'entità delle accelerazioni verticali lungo gli assi X, Y e Z quando il topo sta correndo sul tapis roulant.
Abbinare i valori ottenuti dal software alla grandezza in frequenza dell'accelerazione verticale nel sistema PHM. Preimpostare l'ampiezza di oscillazione della piattaforma e la velocità di rotazione della camma a forma di elica. Quindi posizionare il mouse in posizione prona con la testa situata sull'oscillabile e il resto del corpo sulle piattaforme statiche.
Accendere il motore per far oscillare la piattaforma verticalmente e applicare PHM al mouse. Nella custodia in plastica trasparente, imposta la videocamera a un frame rate di 24 FPS per registrare l'intero spazio. Successivamente, somministrare per via intraperitoneale cinque idrossitriptofano a un topo.
Posizionare il mouse nella gabbia trasparente e avviare la registrazione per 30 minuti. Rivedi il video registrato a velocità 0,5x e conta manualmente le contrazioni della testa. Recupera le criosezioni del cervello del topo dalla scatola della diapositiva.
Lasciare i vetrini su salviette pulite a temperatura ambiente fino a quando i campioni non si disidratano completamente. Utilizzare una penna bloccante liquido per disegnare un cerchio attorno al tessuto criosezionato. Quindi aggiungere la soluzione TBS-T.
Sul fondo di un vassoio, posizionare salviette inumidite per creare un ambiente umido per le diapositive. Dopo una permeablizzazione con TBS-T, aggiungere il 4% di siero d'asina per bloccare e incubare a temperatura ambiente per un'ora. Risciacquare i vetrini una volta immergendoli in TBS-T per cinque minuti.
Quindi applicare 100 microlitri di anticorpi primari opportunamente diluiti e miscela dappy su ciascun vetrino. Coprire il vassoio e incubare a temperatura ambiente durante la notte. Dopo l'incubazione, risciacquare con TBS-T tre volte per cinque minuti ciascuna.
Applicare 100 microlitri di specie opportunamente diluite abbinate a anticorpi secondari fluorescenti e incubare a temperatura ambiente per un'ora. Risciacquare con TBS-T tre volte per cinque minuti ciascuna, montare le guide con il mezzo di montaggio e coprire le diapositive con i vetrini di copertura. Dopo il montaggio, visualizzare il campione al microscopio a fluorescenza.
Il sistema PHM è stato regolato per produrre picchi di accelerazione verticale a circa 1,0 volte G che era equivalente a quelli delle teste dei ratti durante la corsa sul tapis roulant. L'applicazione di PHM ai topi ha attenuato significativamente la loro risposta di contrazione della testa rispetto ai topi di controllo che rappresentano un effetto soppressivo del PHM sulla segnalazione del recettore 5-HT2A nei neuroni della corteccia prefrontale. L'esecuzione del tapis roulant in PHM ha migliorato significativamente l'internalizzazione del recettore 5-HT2A e i neuroni della corteccia prefrontale del topo.
La quantificazione delle aree positive del recettore 5-HT2A internalizzate e associate alla membrana rispetto all'area nuova e positiva ha confermato questa osservazione. L'immunocolorazione e la quantificazione dell'espressione di c-Fos nei neuroni positivi al recettore 5-HT2A hanno mostrato che il tapis roulant in esecuzione in PHM ha downregolato l'espressione di c-Fos indotta da 5-HTP. Questo è l'evento cellulare a valle dell'attivazione del recettore 5-HT2A e dei neuroni PFC del topo.
L'intervento meccanico può essere applicato alle parti del corpo diverse dalla testa per studiare gli aspetti meccanici degli effetti dell'esercizio.
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Panoramica
Questo studio analizza in che modo l'esercizio fisico, in particolare la corsa su tapis roulant, influenza l'omeostasi dell'organismo attraverso un sistema appena sviluppato di movimento passivo della testa (PHM). Simulando le accelerazioni meccaniche subite dai ratti, il protocollo isola efficacemente i fattori meccanici e i loro effetti specifici sulla funzione cerebrale.
Componenti Chiave dello Studio
Area di Ricerca
- Esercizio fisico e omeostasi
- Neuroscienze della meccanotrasduzione
- Impatto dei fattori meccanici sui percorsi di segnalazione cerebrale
Sfondo
- Il ruolo dell'attività fisica nella regolazione fisiologica
- Impatti meccanici sulle risposte neuronali
- Importanza della comprensione della risposta cerebrale all'esercizio fisico
Metodi Utilizzati
- Sistema passivo personalizzato per il movimento della testa (PHM)
- Roditori (ratti e topi) come modelli biologici
- Colorazione fluorescente e immunohistochemica per l'analisi del cervello
Risultati principali
- PHM ha notevolmente attenuato le risposte di scatto della testa nei topi
- Aumento dell'internalizzazione dei recettori 5-HT2A nei neuroni della corteccia prefrontale
- Downregolazione dell'espressione di c-Fos in seguito a intervento meccanico
Conclusioni
- Lo studio dimostra un metodo valido per esaminare gli effetti meccanici sul cervello.
- I risultati contribuiscono a una comprensione più approfondita della fisiologia dell'esercizio e della segnalazione neuronale.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Analizzare gli effetti meccanici diretti dell'esercizio sulla segnalazione cerebrale è fondamentale per ridurre i rischi associati ai target neurobiologici e chiarire le ipotesi meccanicistiche nella fase iniziale della scoperta. Il sistema di movimento passivo della testa (PHM) permette di applicare in modo controllato e riproducibile accelerazioni meccaniche definite alle teste di roditori, sostenendo la fiducia predittiva negli studi sulla meccanotrasduzione. Questa capacità contribuisce alla validazione dei target e alla continuità traslazionale nei programmi terapeutici legati a disturbi neuropsichiatrici e all'attività fisica.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Permette l'analisi dei percorsi di meccanotrasduzione implicati nell'omeostasi cerebrale indotta dall'esercizio fisico.
- Consente la validazione funzionale della segnalazione attraverso recettori della serotonina in popolazioni neuronali definite.
- Facilita la riduzione del rischio meccanicistico isolando gli effetti meccanici da quelli sistemici dell'esercizio.
- Fornisce parametri quantitativi di riferimento per l'attivazione dei percorsi e l'internalizzazione dei recettori.
Sviluppo di Screening e Saggi
- Prepara modelli validati di roditore per lo screening neurofarmacologico successivo.
- Standardizza i parametri di stimolazione meccanica per lo sviluppo di saggi riproducibili.
- Genera output quantitativi come profili di accelerazione della testa e metriche di localizzazione dei recettori.
- Consente una valutazione affidabile degli effetti dei composti sui percorsi meccanosensibili.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Allinea modelli preclinici a stimoli meccanici rilevanti per la malattia osservati nell'esercizio fisico umano.
- Permette una transizione continua dalla scoperta dei meccanismi alla validazione preclinica guidata da biomarcatori.
- Guida l' avanzamento di candidati neuropsichiatrici e simili all'esercizio fisico con valutazione del rischio.
- Fornisce una piattaforma per la valutazione di biomarcatori traslazionali della meccanotrasduzione.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il sistema PHM si integra nel percorso dalla scoperta alla fase preclinica consentendo test basati su ipotesi per il segnale meccanico in modelli di roditore, sostenendo sia la validazione del bersaglio che lo sviluppo di biomarcatori traslazionali.
- Biologia della scoperta: Supporta il test dell'ipotesi nulla per l'attivazione meccanica delle vie di segnalazione cerebrale.
- Screening: Fornisce una stimolazione meccanica quantitativa e riproducibile per la standardizzazione dei saggi.
- Analisi: Fornisce output misurabili come profili di accelerazione, internalizzazione dei recettori ed espressione di c-Fos.
- Ricerca traslazionale: Collega le scoperte meccanicistiche a modelli preclinici rilevanti per la ricerca sull'esercizio fisico e sulle malattie neuropsichiatriche.
- Riutilizzo aziendale: Offre una piattaforma riutilizzabile per diversi studi sulla meccanotrasduzione e sulla neurobiologia.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nelle ipotesi meccanicistiche e nella validazione degli obiettivi.
- Valore operativo: Consente protocolli standardizzati, scalabili e riproducibili di stimolazione meccanica.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione chiarificando gli effetti meccanici diretti sui bersagli cerebrali.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione basata sul rischio per programmi neuropsichiatrici e simili all'esercizio fisico.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nel manipolaggio di roditori, neurobiologia e imaging quantitativo.
- Necessita di strumentazione per la stimolazione meccanica controllata e per la microscopia a fluorescenza ad alta risoluzione.
- Richiede una standardizzazione condivisa tra i gruppi di ricerca dei parametri di stimolazione e degli endpoint analitici.
- L'adattamento tra diverse specie di roditori e diversi paradigmi di esercizio potrebbe richiedere un'ottimizzazione del protocollo.
- L'intervento meccanico è limitato alle regioni corporee accessibili e potrebbe non riprodurre completamente gli effetti sistemici dell'esercizio fisico.
Domande frequenti sulla biofarmaceutica
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:35
Measurement of Magnitudes of Accelerations and Adjustment of the PHM System
1:33
Quantification of Mouse Head-Twitch Response
2:03
Immunohistochemical Analysis of Prefrontal Cortex (PFC) Collected from Euthanized Mouse Brain
3:22
Results: Effect of Treadmill Running and PHM Application in Mouse PFC Neurons
4:37
Conclusion
