Trapianto intracerebrale e monitoraggio della bioluminescenza in vivo delle cellule progenitrici neurali umane nel cervello del topo

Descriviamo il trapianto intraparenchimale di cellule progenitrici neurali umane trasdotte con un doppio vettore reporter che esprime la proteina fluorescente verde luciferasi (GFP) nel cervello del topo. Dopo il trapianto, il segnale della luciferasi viene ripetutamente misurato utilizzando bioluminescenza in vivo e cellule innestate che esprimono GFP identificate in sezioni cerebrali utilizzando la microscopia a fluorescenza.

La terapia cellulare ha un enorme potenziale per la rigenerazione del cervello. Il protocollo che dimostriamo qui è prezioso, in quanto consente l'imaging longitudinale in vivo di cellule trapiantate nel cervello del topo. Questo protocollo è particolarmente utile per ottenere informazioni sulla migrazione e la sopravvivenza dell'innesto nello stesso animale per un periodo di tempo.

Questa procedura può essere applicata a qualsiasi linea cellulare che esprime luciferasi trapiantata nel cervello del topo. Tuttavia, la potenza del segnale può variare a seconda della profondità del trapianto o dell'espressione della luciferasi nella rispettiva linea cellulare. A dimostrare la procedura sarà Rebecca Weber, un'eccellente dottoranda nel nostro laboratorio.

Inizia raccogliendo una fiala di cellule da meno 150 gradi Celsius e trasferiscila in laboratorio. Trasferire rapidamente il flaconcino a bagnomaria temperato a 37 gradi Celsius per due o tre minuti fino a quando i cristalli di ghiaccio si dissolvono. Quindi, trasferire la fiala nell'armadio di biosicurezza e pipettare l'intero contenuto in un tubo conico sterile da 15 millilitri.

Aggiungere nove millilitri di PBS sterile e centrifugare a 300 G per cinque minuti a temperatura ambiente. Rimuovere il surnatante per aspirazione senza disturbare il pellet e contare le cellule prima della rotazione finale utilizzando un contatore di celle automatizzato. Trasportare l'animale dalla camera di induzione al telaio stereotassico, mantenendo l'anestesia utilizzando una maschera facciale.

Applicare lubrificante oftalmico per evitare che gli occhi si secchino. Rasare il cuoio capelluto del topo con un rasoio elettrico e disinfettare la pelle con una soluzione di betadina al 5% usando tamponi di cotone. Fissare la testa del mouse e inserire le barre auricolari nel meato esterno.

Praticare un foro con un diametro di due o tre millimetri attraverso il cranio con un trapano dentale chirurgico. Risospesso le cellule preparate nel tubo e aspirare due microlitri di sospensione cellulare in una siringa. Posizionare la siringa sopra il sito bersaglio e spostare lentamente l'ago sulla superficie della dura e calcolare le coordinate di profondità.

Fare doppio clic sull'icona del software Living Image e selezionare un ID utente dall'elenco a discesa. Quindi, fare clic su Inizializza nel Pannello di controllo visualizzato. Nel software Living Image, selezionare le caselle Luminescente e Fotografia nel Pannello di controllo e selezionare Esposizione automatica.

Selezionare un campo visivo. Immettere l'altezza del soggetto e selezionare l'opzione Usa messa a fuoco altezza soggetto. Impostare manualmente i parametri di filtraggio, tra cui Binning di grandi dimensioni, F/Stop, filtro di eccitazione bloccato e filtro di emissione aperto.

Iniettare la luciferina per via intraperitoneale e, dopo cinque minuti, anestetizzare gli animali con un continuo apporto di isoflurano. Rasare gli animali sedati sulla regione della testa usando un rasoio per capelli convenzionale. Posizionare l'animale nella camera di imaging e iniziare l'imaging 15 minuti dopo l'iniezione di luciferina facendo clic su Acquisisci nel pannello di controllo.

Prima di trapiantare cellule progenitrici neurali nel cervello del topo, le cellule sono state testate per una trasduzione di successo mediante espressione di EGFP in vitro. Il successo del trapianto è stato confermato dalla presenza del segnale rosso Firefly luciferase. Dopo il trapianto di 6.000-180.000 cellule nella corteccia motoria sensoriale destra del topo, il segnale di bioluminescenza era rilevabile a tutte le concentrazioni.

Le cellule sono sopravvissute per almeno cinque settimane dopo il trapianto. Le cellule trapiantate sono state rilevate con successo ex vivo in una successiva analisi istologica attraverso il reporter EGFP e immunocolorante con nuclei anti-umani. È molto importante calcolare attentamente le coordinate di iniezione per evitare di perdere il sito di destinazione.

Inoltre, lasciare la siringa in posizione per almeno cinque minuti dopo il trapianto per evitare qualsiasi reflusso. Dopo l'imaging bioluminescente in vivo, il tessuto cerebrale può essere preparato per l'analisi istologica o le cellule trapiantate possono essere isolate utilizzando FACS e caratterizzate con tecnologie diverse o miste. Nel complesso, questa tecnica fornisce un monitoraggio quantitativo e continuo delle cellule trapiantate nel cervello e può essere applicata a un numero enorme di malattie neurologiche tra cui ictus e lesioni cerebrali traumatiche.