Name: Trapianto intracerebrale e monitoraggio della bioluminescenza in vivo delle cellule progenitrici neurali umane nel cervello del topo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-01-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 12 s
Description: Impara il trapianto intracerebrale di cellule progenitrici neurali umane nel topo con imaging bioluminescente in vivo. Questo protocollo consente il monitoraggio longitudinale della migrazione e della sopravvivenza cellulare per studiare la rigenerazione cerebrale.

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Gli autori RR e CT riconoscono il sostegno della Fondazione Mäxi e del Centro di competenza 3R.

<ol><li>Rust, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nogo-A+targeted+therapy+promotes+vascular+repair+and+functional+recovery+following+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Nogo-A targeted therapy promotes vascular repair and functional recovery following stroke.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (28), 14270-14279 (2019).</li>
<li>Rust, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-Nogo-A+antibodies+prevent+vascular+leakage+and+act+as+pro-angiogenic+factors+following+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Anti-Nogo-A antibodies prevent vascular leakage and act as pro-angiogenic factors following stroke.</a> Scientific Reports. 9 (1), 20040(2019).</li>
<li>Weber, R. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+blood+brain+barrier+disruption+in+the+photothrombotic+stroke+model%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Characterization of the blood brain barrier disruption in the photothrombotic stroke model.</a> Frontiers in Physiology. 11, 58226(2020).</li>
<li>Sweeney, M. D., Sagare, A. P., Zlokovic, B. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood-brain+barrier+breakdown+in+Alzheimer%27s+disease+and+other+neurodegenerative+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Neurology%22%5BJournal%5D)">Blood-brain barrier breakdown in Alzheimer's disease and other neurodegenerative disorders.</a> Nature Reviews. Neurology. 14 (3), 133-150 (2018).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3K3A-APC+stimulates+post-ischemic+neuronal+repair+by+human+neural+stem+cells+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">3K3A-APC stimulates post-ischemic neuronal repair by human neural stem cells in mice.</a> Nature Medicine. 22 (9), 1050-1055 (2016).</li>
<li>Llorente, I. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+glial+enriched+progenitors+repair+functional+deficits+due+to+white+matter+stroke+and+vascular+dementia+in+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Patient-derived glial enriched progenitors repair functional deficits due to white matter stroke and vascular dementia in rodents.</a> Science Translational Medicine. 13 (590), (2021).</li>
<li>Kokaia, Z., Llorente, I. L., Carmichael, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Customized+brain+cells+for+stroke+patients+using+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Customized brain cells for stroke patients using pluripotent stem cells.</a> Stroke. 49 (5), 1091-1098 (2018).</li>
<li>Parmar, M., Grealish, S., Henchcliffe, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+future+of+stem+cell+therapies+for+Parkinson+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The future of stem cell therapies for Parkinson disease.</a> Nature Reviews Neuroscience. 21 (2), 103-115 (2020).</li>
<li>Galgano, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traumatic+brain+injury%3A+current+treatment+strategies+and+future+endeavors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Traumatic brain injury: current treatment strategies and future endeavors.</a> Cell Transplantation. 26 (7), 1118-1130 (2017).</li>
<li>Schweitzer, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Personalized+iPSC-derived+dopamine+progenitor+cells+for+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Personalized iPSC-derived dopamine progenitor cells for Parkinson's disease.</a> The New England Journal of Medicine. 382 (20), 1926-1932 (2020).</li>
<li>Muir, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracerebral+implantation+of+human+neural+stem+cells+and+motor+recovery+after+stroke%3A+multicentre+prospective+single-arm+study+%28PISCES-2%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurology%2C+Neurosurgery+%26+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Intracerebral implantation of human neural stem cells and motor recovery after stroke: multicentre prospective single-arm study (PISCES-2).</a> Journal of Neurology, Neurosurgery & Psychiatry. 91 (4), 396-401 (2020).</li>
<li>Kawabori, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+therapy+for+chronic+TBI%3A+interim+analysis+of+the+randomized+controlled+STEMTRA+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Cell therapy for chronic TBI: interim analysis of the randomized controlled STEMTRA trial.</a> Neurology. 96 (8), 1202-1214 (2021).</li>
<li>George, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+stem+cell+mimics+to+enhance+stroke+recovery%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Engineered stem cell mimics to enhance stroke recovery.</a> Biomaterials. 178, 63-72 (2018).</li>
<li>Sancho-Martinez, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+human+iPSC-based+models+for+the+study+and+targeting+of+glioma+initiating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Establishment of human iPSC-based models for the study and targeting of glioma initiating cells.</a> Nature Communications. 7 (1), 1-14 (2016).</li>
<li>Rust, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xeno-free+induced+pluripotent+stem+cell-derived+neural+progenitor+cells+for+in+vivo+applications%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Xeno-free induced pluripotent stem cell-derived neural progenitor cells for in vivo applications.</a> bioRxiv. , (2022).</li>
<li>Franklin, K., Paxinos, G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFranklin%2C+K+%22Paxinos+and+Franklin%27s+the+Mouse+brain+in+stereotaxic+coordinates%2C+compact%3A+The+coronal+plates+and+diagrams%22">Paxinos and Franklin's the Mouse brain in stereotaxic coordinates, compact: The coronal plates and diagrams</a>. , Academic Press. (2019).</li>
<li>Baker, S., Götz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+local+insult+of+okadaic+acid+in+wild-type+mice+induces+tau+phosphorylation+and+protein+aggregation+in+anatomically+distinct+brain+regions%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica+Communications%22%5BJournal%5D)">A local insult of okadaic acid in wild-type mice induces tau phosphorylation and protein aggregation in anatomically distinct brain regions.</a> Acta Neuropathologica Communications. 4, 32(2016).</li>
<li>Cao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+optical+imaging+of+myelination+events+in+a+myelin+basic+protein+promoter-driven+luciferase+transgenic+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22ASN+Neuro%22%5BJournal%5D)">In vivo optical imaging of myelination events in a myelin basic protein promoter-driven luciferase transgenic mouse model.</a> ASN Neuro. 10, (2018).</li>
<li>Aswendt, M., Adamczak, J., Couillard-Despres, S., Hoehn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Boosting+bioluminescence+neuroimaging%3A+an+optimized+protocol+for+brain+studies%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Boosting bioluminescence neuroimaging: an optimized protocol for brain studies.</a> PLoS One. 8 (2), 55662(2013).</li>
<li>Roth, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain-released+alarmins+and+stress+response+synergize+in+accelerating+atherosclerosis+progression+after+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Brain-released alarmins and stress response synergize in accelerating atherosclerosis progression after stroke.</a> Science Translational Medicine. 10 (432), (2018).</li>
<li>Rust, R., Hofer, A. -S., Schwab, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stroke+promotes+systemic+endothelial+inflammation+and+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Stroke promotes systemic endothelial inflammation and atherosclerosis.</a> Trends in Molecular Medicine. 24 (7), 593-595 (2018).</li>
<li>Rust, R., Gantner, C., Schwab, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pro-+and+antiangiogenic+therapies%3A+current+status+and+clinical+implications%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Pro- and antiangiogenic therapies: current status and clinical implications.</a> FASEB Journal. 33 (1), 34-48 (2018).</li>
<li>Rust, R., Grönnert, L., Weber, R. Z., Mulders, G., Schwab, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Refueling+the+ischemic+CNS%3A+guidance+molecules+for+vascular+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Refueling the ischemic CNS: guidance molecules for vascular repair.</a> Trends in Neurosciences. 42 (9), 644-656 (2019).</li>
<li>Nih, L. R., Gojgini, S., Carmichael, S. T., Segura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual-function+injectable+angiogenic+biomaterial+for+the+repair+of+brain+tissue+following+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Materials%22%5BJournal%5D)">Dual-function injectable angiogenic biomaterial for the repair of brain tissue following stroke.</a> Nature Materials. 17 (7), 642(2018).</li>
<li>Montagne, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pericyte+degeneration+causes+white+matter+dysfunction+in+the+mouse+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Pericyte degeneration causes white matter dysfunction in the mouse central nervous system.</a> Nature Medicine. 24 (3), 326-337 (2018).</li>
<li>Montagne, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((APOE4+leads+to+blood-brain+barrier+dysfunction+predicting+cognitive+decline%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">APOE4 leads to blood-brain barrier dysfunction predicting cognitive decline.</a> Nature. 581 (7806), 71-76 (2020).</li>
<li>George, P. M., Steinberg, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+stroke+therapeutics%3A+unraveling+stroke+pathophysiology+and+its+impact+on+clinical+treatments%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Novel stroke therapeutics: unraveling stroke pathophysiology and its impact on clinical treatments.</a> Neuron. 87 (2), 297-309 (2015).</li>
<li>Weber, R. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+learning+based+behavioral+profiling+of+rodent+stroke+recovery%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Deep learning based behavioral profiling of rodent stroke recovery.</a> bioRxiv. , (2021).</li>
<li>Nair, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uses+for+humanised+mouse+models+in+precision+medicine+for+neurodegenerative+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Mammalian+Genome%22%5BJournal%5D)">Uses for humanised mouse models in precision medicine for neurodegenerative disease.</a> Mammalian Genome. 30 (7), 173-191 (2019).</li>
<li>Kirabali, T., Rust, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iPS-derived+pericytes+for+neurovascular+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">iPS-derived pericytes for neurovascular regeneration.</a> European Journal of Clinical Investigation. 51 (9), 13601(2021).</li>
<li>Weber, R. Z., Perron, P., Rust, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytes+for+brain+repair%3A+More+than+just+a+neuron%27s+sidekick%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Pathology%22%5BJournal%5D)">Astrocytes for brain repair: More than just a neuron's sidekick.</a> Brain Pathology. 31 (5), Zurich, Switzerland. 12999(2021).</li>
<li>Johansen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+Tet-on+system+to+avoid+transgene+down-regulation+in+ex+vivo+gene+transfer+to+the+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Evaluation of Tet-on system to avoid transgene down-regulation in ex vivo gene transfer to the CNS.</a> Gene Therapy. 9 (19), 1291-1301 (2002).</li>
<li>Vogel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initial+graft+size+and+not+the+innate+immune+response+limit+survival+of+engrafted+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Tissue+Engineering+and+Regenerative+Medicine%22%5BJournal%5D)">Initial graft size and not the innate immune response limit survival of engrafted neural stem cells.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (3), 784-793 (2018).</li>
</ol>

Gli autori non hanno potenziali conflitti di interesse da dichiarare.

Rigenerare il cervello ferito per consentire il recupero funzionale rimane una sfida insoddisfatta. Molti approcci preclinici innovativi hanno evoluto il targeting, ad esempio, modulazione immunitaria19,20, angiogenesi 1,21,22,23, integrità della barriera emato-encefalica 2,3,24,25 e sostituzione cellulare 5,26 . Soprattutto negli ultimi anni, le terapie a base cellulare sono emerse come una promettente strategia di trattamento per il cervello a causa dei grandi progressi nella tecnologia delle cellule staminali e dei protocolli di differenziazione efficienti15,28. Questo documento fornisce un protocollo prezioso per il trapianto e il monitoraggio delle cellule neurali nel cervello del topo. Il metodo è applicabile a tutte le linee cellulari trasducibili per applicazioni in vivo nel cervello del topo.
La configurazione presentata utilizza trapianti di origine umana in un topo. Questi trapianti non sono praticabili a lungo termine in topi wild-type immunocompetenti a causa dell'immunogenicità. Quindi, i topi NSG immunodeficienti sono stati utilizzati per superare questa limitazione. In alternativa, l'uso di trapianti di topo può essere preferito per superare gli aspetti immunogenici. Se è necessario il trapianto di cellule umane, i modelli murini umanizzati rappresentano un'alternativa emergente per ridurre la probabilità di rigetto dell'innesto29.
Un vettore virale commerciale a doppio reporter costituito da lucciola luciferasi ed eGFP sotto il promotore EF1α è stato utilizzato per visualizzare i trapianti. Questo promotore è stato selezionato per ottenere un'elevata intensità del segnale15. Tuttavia, oltre agli NPC, altri tipi di cellule hanno dimostrato di promuovere la funzione cerebrale dopo una lesione, compresi i periciti30 e gli astrociti31; quindi, a seconda della linea cellulare utilizzata, altri promotori potrebbero essere più adatti a raggiungere alti livelli di espressione. Inoltre, l'uso di promotori transgenici, come il CMV, può portare a una downregulation, specialmente negli esperimenti a lungo termine32. L'efficienza di trasduzione del vettore lentivirale dipende fortemente dalla linea cellulare utilizzata e può variare tra i singoli esperimenti. Pertanto, l'efficienza di trasduzione deve essere valutata prima di iniziare gli esperimenti in vivo e correggere le variazioni nell'efficacia della trasduzione tra gli esperimenti. La regione cerebrale del trapianto influenza anche la potenza del segnale. Sebbene sia stato raggiunto un limite di rilevamento di < 6.000 cellule per i trapianti corticali, potrebbe essere necessario più cellule per rilevare un segnale in regioni cerebrali più profonde, ad esempio striato o ippocampo.
I volumi di trapianto nel cervello del topo sono limitati a 1-2 μL. Pertanto, è importante identificare un numero di cella adatto per gli esperimenti. È stato precedentemente osservato che l'aumento del numero di cellule porta a una diminuzione del tasso di sopravvivenza, molto probabilmente a causa della limitata disponibilità di nutrienti e ossigeno nella regione del trapianto33. L'imaging a bioluminescenza in vivo fornisce una risoluzione spaziale relativamente bassa rispetto ad altri metodi di imaging in vivo come la risonanza magnetica o la TC. Pertanto, brevi percorsi migratori delle cellule innestate possono essere valutati in modo affidabile solo nella successiva analisi post-hoc .
La potenza assoluta del segnale della bioluminescenza è generalmente proporzionale al numero di cellule trapiantate. Tuttavia, la potenza del segnale potrebbe essere ridotta se gli innesti vengono trapiantati in strutture cerebrali più profonde o se la potenza del segnale è al di fuori dello spettro di rilevamento lineare del sistema di imaging in vivo . Attualmente, vengono sviluppati nuovi substrati per garantire una penetrazione più efficiente attraverso la barriera emato-encefalica rispetto alla D-luciferina, incluso il cicloluce1. Questi substrati potrebbero migliorare ulteriormente il limite di rilevamento delle cellule innestate in futuro18. Nel complesso, questo protocollo consente una procedura semplice e minimamente invasiva per trapiantare e osservare gli innesti nel cervello del topo.

Il cervello dei mammiferi ha capacità rigenerative limitate a seguito di lesioni o malattie, che richiedono strategie innovative per promuovere la riparazione dei tessuti e delle funzionalità. Le strategie precliniche si concentrano su diversi aspetti della rigenerazione cerebrale, tra cui neuroprotezione, neurogenesi, angiogenesi 1,2, riparazione della barriera emato-encefalica 3,4 o terapia cellulare 5,6. La terapia cellulare ha il vantaggio di essere in grado di promuovere molti di questi processi pro-riparazione contemporaneamente. Negli esperimenti con il trapianto di cellule, la riparazione dei tessuti è avvenuta attraverso (1) la sostituzione diretta delle cellule e (2) la produzione di citochine che portano all'angiogenesi e alla neurogenesi7. I recenti progressi nella tecnologia delle cellule staminali hanno ulteriormente facilitato lo sviluppo di sorgenti di cellule neurali scalabili e ben caratterizzate che sono ora in cantiere per gli studi clinici (esaminati in 7,8,9). Sebbene le terapie cellulari abbiano raggiunto lo stadio clinico per alcune malattie neurologiche (ad esempio, morbo di Parkinson10, ictus11 e lesione del midollo spinale12), la loro efficacia è stata variabile e sono necessarie ulteriori ricerche precliniche per comprendere i meccanismi delle interazioni innesto-ospite.
Una delle principali limitazioni di molti studi preclinici è il monitoraggio continuo delle cellule trapiantate all'interno dell'ospite. Spesso vengono eseguite solo misurazioni del punto finale, omettendo i processi dinamici migratori e di sopravvivenza nell'ospite 6,13. Queste limitazioni si traducono nella scarsa caratterizzazione delle cellule innestate e richiedono un numero elevato di animali per comprendere i cambiamenti longitudinali. Per superare queste limitazioni, in questo studio, trasduciamo cellule progenitrici neurali derivate da cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) con un vettore lentivirale dual-reporter disponibile in commercio costituito da luciferasi di lucciola rossa e proteina fluorescente verde potenziata (rFluc-eGFP). Queste cellule vengono trapiantate tramite iniezione intraparenchimale stereotassica nel cervello del topo e vengono tracciate longitudinalmente utilizzando l'imaging a bioluminescenza in vivo per 5 settimane. Dopo la raccolta del tessuto cerebrale, le cellule innestate che esprimono GFP vengono identificate e ulteriormente caratterizzate nelle sezioni cerebrali istologiche. Questo metodo può essere adattato senza problemi a fonti cellulari trasducibili alternative e vie di trapianto per applicazioni in vivo nel cervello dei roditori. Nel complesso, la procedura è preziosa per ottenere informazioni longitudinali sulla sopravvivenza e la migrazione dell'innesto nel cervello del topo e facilita la successiva caratterizzazione istologica.

<table><tbody><tr><td>Trasduzione virale</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pLL-EF1a-rFLuc-T2A-GFP-mPGK-Puro (virus Lenti-Labeler)</td><td>Systembio</td><td>LL410VA-1</td><td></td></tr><tr><td>Consumables</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf microprovette; 1,5 mL</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z606340</td><td></td></tr><tr><td>Falcon; 15 mL</td><td>TPP</td><td>91015</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini coprimicroscopio Prodotto</td><td></td><td></td><td>a scelta</td></tr><tr><td>Vetrini per microscopio Prodotto</td><td></td><td></td><td>a scelta</td></tr><tr><td>Tamponi</td><td></td><td></td> di cotone Sterlie <td>Prodotto a scelta</td></tr><tr><td>Suture; seta 5/0 con ago curvo</td><td>B. Braun</td><td>G0762482</td><td></td></tr><tr><td>Filtro per siringa; 0,22 &; m</td><td>TPP</td><td>99722</td><td></td></tr><tr><td>Siringa; 1 mL e 0,5 mL</td><td>B. Braun</td><td>9166017V</td><td></td></tr><tr><td>Piastra per coltura tissutale (24 pozzetti)</td><td>TPP</td><td>92024</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Contatore automatico di cellule (Vi-CELL XR)</td><td>Beckmann Coulter Life Science</td><td>383721</td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11064-07</td><td></td></tr><tr><td>Pinze, fine</td><td>Fine Science Tools</td><td>11412-11</td><td></td></tr><tr><td>Termoforo</td><td></td><td></td><td>Prodotto a scelta</td></tr><tr><td>Kit micromotore brushless ad alta velocità</td><td>Foredom</td><td>K.1060-22.</td><td></td></tr><tr><td>Ideal Micro Drill Burr Set di 5</td> punti di <td>cella specifici</td><td>60-1000</td><td></td></tr><tr><td>In-Vivo sistema di imaging (IVIS Lumina III con pacchetto software Living Imaging 4.2)</td><td>Perkin Elmer</td><td>CLS136334</td><td></td></tr><tr><td>Vaporizzatore di isoflurano</td><td>Provet AG</td><td>330724</td><td></td></tr><tr><td>Sistema di pompe a siringa per microiniezione</td><td>World Precision Instruments</td><td>UMP3T-1</td><td></td></tr><tr><td>Siringa da microlitri; Serie 700; Volume: 5-10 & micro; L</td><td>Hamilton</td><td>7635-01</td><td></td></tr><tr><td>Microtomo</td><td>Leica</td><td>HM430</td><td></td></tr><tr><td>NanoFill-33 G-Needle (rimovibile e riutilizzabile)</td><td>World Precision Instruments</td><td>NF33BV-2</td><td></td></tr><tr><td>Supporto per aghi</td><td>Fine Science Tools</td><td>12001-13</td><td></td></tr><tr><td>Pompa di perfusione e tubi</td><td>Masterflex</td><td>HV-77120-42</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel</td><td>Fine Science Tools</td><td>10003-12</td><td></td></tr><tr><td>Forbici bonn piccole, diritte</td><td>Fine Science Tools</td><td>14184-09</td><td></td></tr><tr><td>Forbici a molla piccole, diritte</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-03</td><td></td></tr><tr><td>Spatola</td><td>Merck</td><td>Z243213-2EA</td><td></td></tr><tr><td>Telaio stereotassico per roditori; motorizzato</td><td>World Precision Instruments</td><td>99401</td><td></td></tr><tr><td>Pharmaceuticals and Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Invitrogen</td><td>A11105-01</td><td>Proteolitico e collagenolitico; reagente di dissociazione cellulare</td></tr><tr><td>Anti-Human Nuclei Antibody, clone 235-1, coniugato di biotina</td><td>Merck</td><td>MAB1281B</td><td></td></tr><tr><td>B27 ... Integratore (50x)</td><td>Gibco</td><td>17504-001</td><td></td></tr><tr><td>Betadine (11 mg Iod als Povidon-Iod pro 1 ml L&ouml; sung)</td><td>Mundipharma Medical Company</td><td>Tutti i prodotti farmaceutici sono stati forniti dalla farmacia cantonale, Zurigo, Svizzera</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione bloccante (3% siero d'asina; 0,1% Triton-X-100 in PBS)</td><td></td><td></td><td>Prodotto a scelta; può essere fatto in casa</td></tr><tr><td>CHIR99021 (10 mM - 2.500x)</td><td>StemMACS</td><td>130-103-926</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione</td><td></td><td></td> <td>crioprotettivaProdotto a scelta; può essere fatto in casa</td></tr><tr><td>Soluzione DAPI (1 mg/mL)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>62248</td><td></td></tr><tr><td>D-Luciferina Sale di potassio</td><td>Perkin Elmer</td><td>122799</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>11320-074</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo secondario anti-topo d'asino (H+L) altamente adsorbito, Alexa Fluor 555</td><td>Invitrogen</td><td>A-31570</td><td></td></tr><tr><td>Siero</td><td></td><td></td> d'asino<td>Prodotto a scelta</td></tr><tr><td>Esconarcon (Pentobarbitalum natricum 300 mg)</td><td>Streuli Pharma AG</td><<td>em>Tutti i prodotti farmaceutici sono stati forniti dalla farmacia cantonale, Zurigo, Svizzera</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo; 70%</td><td></td><td></td><td>Prodotto di scelta</td></tr><tr><td>FGF Proteina umana ricombinante di base, senza origine animale</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>&nbsp; </td><td></td>PHG6015</tr><tr><td>Glutamax (100x)</td><td>Gibco</td><td>A12860-01</td><td></td></tr><tr><td>hLif (10 &micro; g/mL &ndash; 1.000x)</td><td>PeproTech</td><td>AF-300-05-25UG</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano (Isofluran (1-Chlor-2,2,2-trifluorethyl-difluoromethyl&shy; 99,9%)</td><td>Provet AG</td><<td>em>Tutti i prodotti farmaceutici sono stati forniti dalla farmacia cantonale, Zurigo, Svizzera</td><td></td></tr><tr><td>Laminin-L521 (L-521)</td><td>Biolaminin LN</td><td>LN521</td><td></td></tr><tr><td>Unguento alla lidocaina (Lidocaina: 25 mg, Prilocaina: 25 mg)</td><td>Aspen Pharma Schweiz GmbH</td><td>Tutti i prodotti farmaceutici sono stati forniti dalla farmacia cantonale, Zurigo, Svizzera</td><td></td></tr><tr><td>Montaggio Prodotto a</td><td></td><td></td><td>scelta; può essere fatto in casa</td></tr><tr><td>N2- Integratore (100x)</td><td>Gibco</td><td>&nbsp; 75202-001</td><td></td></tr><tr><td>Gibco</td> <td>neurobasale</td><td> 21103-049</td><td></td></tr><tr><td>Lubrificante oftalmico (Retinolo palmitato: 15.000 UI)</td><td>Bausch & Lomb Swiss AG</td><<td>em>Tutti i prodotti farmaceutici sono stati forniti dalla farmacia cantonale, Zurigo, Svizzera</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione</td><td></td><td></td> di paraformaldeide <td>Prodotto di scelta</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010023</td><td>Può anche essere fatto in casa</td></tr><tr><td>Soluzione di poli-L-ornitina (pLO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4957</td><td></td></tr><tr><td>Rimadyl (Carprofene 50 mg)</td><td>Zoetis Schweiz GmbH</td><td>Tutti i prodotti farmaceutici sono stati forniti dalla farmacia cantonale, Zurigo, Svizzera</td><td></td></tr><tr><td>Ringer lattato</td><td>B. Braun</td><td>3570500</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione Ringer</td><td>B. Braun</td><td>3570030</td><td></td></tr><tr><td>soluzione salina (0,9% NaCl)</td><td>B. Braun</td><td>3570160</td><td></td></tr><tr><td>SB431542 (10 mM - 3.333,3x)</td><td>StemMACS</td><td>130-106-543</td><td></td></tr><tr><td>adesivo tissutale (Histoacryl)</td><td>B. Braun</td><td>1050060</td><td></td></tr></tbody></table>

trapianto intracerebrale e monitoraggio della bioluminescenza in vivo delle cellule progenitrici neurali umane nel cervello del topo

Intracerebral Transplantation and In Vivo Bioluminescence Tracking of Human Neural Progenitor Cells in the Mouse Brain

La terapia cellulare è stata a lungo un paradigma di trattamento emergente nella neurobiologia sperimentale. Tuttavia, gli studi sul trapianto di cellule spesso si basano su misurazioni del punto finale e possono quindi valutare solo i cambiamenti longitudinali della migrazione e della sopravvivenza cellulare in misura limitata. Questo documento fornisce un protocollo affidabile e minimamente invasivo per trapiantare e tracciare longitudinalmente le cellule progenitrici neurali (NPC) nel cervello del topo adulto. Prima del trapianto, le cellule vengono trasdotte con un vettore lentivirale composto da un reporter bioluminescente (lucciola-luciferasi) e fluorescente (proteina fluorescente verde [GFP]). Gli NPC vengono trapiantati nell'emisfero corticale destro utilizzando iniezioni stereotassiche nella corteccia sensomotoria. Dopo il trapianto, le cellule innestate sono state rilevate attraverso il cranio intatto per un massimo di cinque settimane (ai giorni 0, 3, 14, 21, 35) con un limite di risoluzione di 6.000 cellule utilizzando l'imaging a bioluminescenza in vivo. Successivamente, le cellule trapiantate vengono identificate in sezioni cerebrali istologiche e ulteriormente caratterizzate da immunofluorescenza. Pertanto, questo protocollo fornisce uno strumento prezioso per trapiantare, tracciare, quantificare e caratterizzare le cellule nel cervello del topo.

Miriamo a tracciare longitudinalmente le cellule progenitrici neurali trapiantate nel cervello del topo utilizzando l'imaging a bioluminescenza in vivo e identificare le cellule trapiantate nella successiva analisi istologica (Figura 1A). Pertanto, le cellule progenitrici neurali sono trasdotte con un vettore lentivirale costituito da EF1α-rFluc-eGFP. Prima del trapianto, le cellule sono state testate per una trasduzione di successo mediante espressione di eGFP in vitro (Figura 1B). Le cellule trasdotte con successo sono state trapiantate stereotassicamente nel cervello del topo alle coordinate desiderate (ad esempio, nella corteccia sensomotoria). Dopo il trapianto, i topi sono stati iniettati per via sistemica con D-luciferina, il substrato per rFluc, e le intensità del segnale delle cellule trapiantate sono state misurate per confermare il successo del trapianto (Figura 1C).
Per valutare il limite di rilevazione dell'imaging a bioluminescenza in vivo , è stato trapiantato un intervallo di 6.000-180.000 cellule nella corteccia sensomotoria destra del topo (Figura 2A). Abbiamo rilevato &lt; 6.000 cellule e un segnale di bioluminescenza proporzionale al numero di cellule trapiantate direttamente dopo il trapianto (Figura 2B). Poiché le fonti di cellule umane sono immunogeniche per i topi immunocompetenti, i topi immunodeficienti NOD scid gamma (NSG) sono stati utilizzati per osservare la sopravvivenza a lungo termine degli innesti cellulari. La sopravvivenza a lungo termine e il rilevamento di un segnale di bioluminescenza fino a 5 settimane sono stati confermati dopo il trapianto di cellule (Figura 2C, D). Le cellule trapiantate sono state rilevate con successo ex vivo in una successiva analisi istologica attraverso il reporter eGFP e immunocoloranti con nuclei anti-umani e anticorpi mitocondriali anti-umani (Figura 2E).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63102/63102fig01.jpg"> Figura 1: Trapianto di cellule progenitrici neurali. (A) Panoramica schematica della generazione e del trapianto di NPC rFluc-eGFP. (B) Immagine rappresentativa di immunofluorescenza di NPC trasdotti (reporter GFP, verde) controcolorata con DAPI (blu); barre di scala = 5 μm. (C) Rilevazione in vivo del segnale di bioluminescenza in cellule trapiantate; barra di colore = blu (0, min, nessun segnale), rosso (4 flusso, p/s × 105, segnale massimo) Abbreviazioni: NPC = cellule progenitrici neurali; GFP = proteina fluorescente verde; rFluc-eGFP = luciferasi della lucciola rossa e proteina fluorescente verde potenziata; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindolo; p/s = fotoni/s. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63102/63102fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63102/63102fig2v2.jpg"> Figura 2: Decorso temporale delle cellule trapiantate. (A) Vista schematica dei numeri di cellule per il trapianto. (B) Limite di rilevazione delle cellule trapiantate 1 ora dopo il trapianto. (C, D) Corso temporale del trapianto (180.000 cellule) per un massimo di 35 giorni nei topi NSG; barra di colore = blu (0, min, nessun segnale), rosso (4 flusso, p/s × 105, segnale massimo) I dati sono medi ± SEM (n = 3). (E) Immagini rappresentative di fluorescenza di sezioni istologiche e cellule trapiantate 5 settimane dopo il trapianto. Barra della scala = 10 μm. Abbreviazioni: D = giorno dopo il trapianto; NSG = immunodeficiente NOD scid gamma; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindolo; GFP = proteina fluorescente verde; HuNu = Anticorpo Nuclei Anti-Umani, clone 235-1; p/s = fotoni/s. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63102/63102fig2v2large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Descriviamo il trapianto intraparenchimale di cellule progenitrici neurali umane trasdotte con un doppio vettore reporter che esprime la proteina fluorescente verde luciferasi (GFP) nel cervello del topo. Dopo il trapianto, il segnale della luciferasi viene ripetutamente misurato utilizzando bioluminescenza in vivo e cellule innestate che esprimono GFP identificate in sezioni cerebrali utilizzando la microscopia a fluorescenza.

Trapianto intracerebrale e monitoraggio della bioluminescenza in vivo delle cellule progenitrici neurali umane nel cervello del topo

Cell therapy has long been an emerging treatment paradigm in experimental neurobiology. However, cell transplantation studies often rely on end-point ...

La terapia cellulare ha un enorme potenziale per la rigenerazione del cervello. Il protocollo che dimostriamo qui è prezioso, in quanto consente l'imaging longitudinale in vivo di cellule trapiantate nel cervello del topo. Questo protocollo è particolarmente utile per ottenere informazioni sulla migrazione e la sopravvivenza dell'innesto nello stesso animale per un periodo di tempo.Questa procedura può essere applicata a qualsiasi linea cellulare che esprime luciferasi trapiantata nel cervello del topo. Tuttavia, la potenza del segnale può variare a seconda della profondità del trapianto o dell'espressione della luciferasi nella rispettiva linea cellulare. A dimostrare la procedura sarà Rebecca Weber, un'eccellente dottoranda nel nostro laboratorio.Inizia raccogliendo una fiala di cellule da meno 150 gradi Celsius e trasferiscila in laboratorio. Trasferire rapidamente il flaconcino a bagnomaria temperato a 37 gradi Celsius per due o tre minuti fino a quando i cristalli di ghiaccio si dissolvono. Quindi, trasferire la fiala nell'armadio di biosicurezza e pipettare l'intero contenuto in un tubo conico sterile da 15 millilitri.Aggiungere nove millilitri di PBS sterile e centrifugare a 300 G per cinque minuti a temperatura ambiente. Rimuovere il surnatante per aspirazione senza disturbare il pellet e contare le cellule prima della rotazione finale utilizzando un contatore di celle automatizzato. Trasportare l'animale dalla camera di induzione al telaio stereotassico, mantenendo l'anestesia utilizzando una maschera facciale.Applicare lubrificante oftalmico per evitare che gli occhi si secchino. Rasare il cuoio capelluto del topo con un rasoio elettrico e disinfettare la pelle con una soluzione di betadina al 5% usando tamponi di cotone. Fissare la testa del mouse e inserire le barre auricolari nel meato esterno.Praticare un foro con un diametro di due o tre millimetri attraverso il cranio con un trapano dentale chirurgico. Risospesso le cellule preparate nel tubo e aspirare due microlitri di sospensione cellulare in una siringa. Posizionare la siringa sopra il sito bersaglio e spostare lentamente l'ago sulla superficie della dura e calcolare le coordinate di profondità.Fare doppio clic sull'icona del software Living Image e selezionare un ID utente dall'elenco a discesa. Quindi, fare clic su Inizializza nel Pannello di controllo visualizzato. Nel software Living Image, selezionare le caselle Luminescente e Fotografia nel Pannello di controllo e selezionare Esposizione automatica.Selezionare un campo visivo. Immettere l'altezza del soggetto e selezionare l'opzione Usa messa a fuoco altezza soggetto. Impostare manualmente i parametri di filtraggio, tra cui Binning di grandi dimensioni, F/Stop, filtro di eccitazione bloccato e filtro di emissione aperto.Iniettare la luciferina per via intraperitoneale e, dopo cinque minuti, anestetizzare gli animali con un continuo apporto di isoflurano. Rasare gli animali sedati sulla regione della testa usando un rasoio per capelli convenzionale. Posizionare l'animale nella camera di imaging e iniziare l'imaging 15 minuti dopo l'iniezione di luciferina facendo clic su Acquisisci nel pannello di controllo.Prima di trapiantare cellule progenitrici neurali nel cervello del topo, le cellule sono state testate per una trasduzione di successo mediante espressione di EGFP in vitro. Il successo del trapianto è stato confermato dalla presenza del segnale rosso Firefly luciferase. Dopo il trapianto di 6.000-180.000 cellule nella corteccia motoria sensoriale destra del topo, il segnale di bioluminescenza era rilevabile a tutte le concentrazioni.Le cellule sono sopravvissute per almeno cinque settimane dopo il trapianto. Le cellule trapiantate sono state rilevate con successo ex vivo in una successiva analisi istologica attraverso il reporter EGFP e immunocolorante con nuclei anti-umani. È molto importante calcolare attentamente le coordinate di iniezione per evitare di perdere il sito di destinazione.Inoltre, lasciare la siringa in posizione per almeno cinque minuti dopo il trapianto per evitare qualsiasi reflusso. Dopo l'imaging bioluminescente in vivo, il tessuto cerebrale può essere preparato per l'analisi istologica o le cellule trapiantate possono essere isolate utilizzando FACS e caratterizzate con tecnologie diverse o miste. Nel complesso, questa tecnica fornisce un monitoraggio quantitativo e continuo delle cellule trapiantate nel cervello e può essere applicata a un numero enorme di malattie neurologiche tra cui ictus e lesioni cerebrali traumatiche.

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Con il crescente interesse per le terapie con cellule staminali, le tecniche di imaging molecolare sono ideali per il monitoraggio del comportamento delle cellule staminali dopo il trapianto. Geni reporter luciferasi hanno permesso non invasiva, la valutazione ripetitivo della sopravvivenza cellulare, la posizione e la proliferazione in vivo. Questo video dimostra come monitorare la proliferazione hESC in un topo vivo.

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Luciferasi modificati xenotrapianti di tumori al cervello umano può essere stabilita intracranially in topi atimici, con successivo monitoraggio della crescita tumorale e la risposta alla terapia con l'imaging bioluminescenza. In combinazione con l'analisi di sopravvivenza, il monitoraggio bioluminescenza è uno strumento di ricerca indispensabile per test pre-clinici di terapie che sono considerati per il trattamento dei tumori cerebrali.

Stabilire intracranica xenotrapianti Brain Tumor Con successiva analisi della crescita tumorale e risposta alla terapia con Imaging bioluminescenza

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Questo articolo descrive una sequenza ottimizzata di eventi per l'imaging multimodale di innesti cellulari nel cervello di roditori utilizzando: (i) in bioluminescenza vivo e la risonanza magnetica, e (ii) post mortem l'analisi istologica. La combinazione di queste modalità di imaging su un singolo animale consente la valutazione del trapianto cellulare ad alta risoluzione, sensibilità e specificità.

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Imaging in bioluminescenza in vivo di cellule progenitrici neurali umane in un cervello di topo

Basato sull'ingegneria calularisa in vitro dei precursori neuronali, sul loro co-trapianto in cervelli di tipo selvatico e sulla valutazione morbiterale accoppiata dei derivati "test" e "controllo", questo metodo consente una modellazione accurata del controllo genico in vivo morfologia dei neuroni in modo semplice e conveniente.

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Questo protocollo dimostra le metodologie per un modello murino di lesioni cerebrali traumatiche a cranio aperto e il trapianto di cellule derivate da cellule staminali pluripotenti indotte umane coltivate nel sito della lesione. Test comportamentali e istologici dei risultati di queste procedure sono descritti anche in breve.

Modello di impatto corticale controllato di lesioni cerebrali del topo con trapianto terapeutico di cellule neurali derivate da cellule staminali indotte dall'uomo

Questo studio dimostra la somministrazione di una lesione cerebrale traumatica ripetitiva ai topi e l'impianto simultaneo di una finestra cranica per il successivo imaging intravitale di un EGFP espresso da neuroni utilizzando la microscopia a due fotoni.

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Qui, descriviamo un protocollo per il trapianto e il tracciamento di cellule neurali marcate in organoidi cerebrali umani.

Un modello di organoide cerebrale umano di trapianto di cellule neurali

Impara il trapianto intracerebrale di cellule progenitrici neurali umane nel topo con imaging bioluminescente in vivo. Questo protocollo consente il monitoraggio longitudinale della migrazione e della sopravvivenza cellulare per studiare la rigenerazione cerebrale.

Trapianto intracerebrale e monitoraggio della bioluminescenza in vivo delle cellule progenitrici neurali umane nel cervello del topo (Video) | JoVE Journal

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