Name: Isolamento delle cellule epiteliali dal follicolo dentale umano (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-11-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 7 s
Description: Impara l'isolamento delle cellule epiteliali dal follicolo dentale umano utilizzando collagenasi e tripsina-EDTA. Questo metodo consente la formazione di colonie in 7-10 giorni in mezzo senza siero.

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Questo studio è stato supportato da sovvenzioni della National Research Foundation of Korea (NRF) finanziate dal governo coreano (NRF-2017R1C1B2008406 e NRF-2021R1F1A1064350). Il Dr. Hee-Yeon Bae ha gentilmente fornito il DF per la cultura primaria.

Questo studio è stato approvato dall'Institutional Review Board del Kyung Hee University Hospital di Gangdong (approvazione IRB n. KHNMC 2017-06-009).
1. Raccogli DF
NOTA: I pazienti hanno dato il consenso informato prima dell'intervento chirurgico per la rimozione di un terzo molare colpito maturo o immaturo. Sono stati esclusi i pazienti con la seguente malattia: diabete, ipertensione, tubercolosi, epatite, sindrome da immunodeficienza acquisita. Anche le donne incinte sono state escluse.
<ol><li>Raccolta df durante l'estrazione chirurgica dei terzi molari colpiti (Figura 1A). NOTA: La chirurgia è stata eseguita da un chirurgo maxillo-facciale orale. È necessaria la collaborazione con un dentista per la raccolta dei tessuti.</li>
	<li>Conservare DF in soluzione salina tamponata con fosfato (DPBS) di Dulbecco con il 3% di penicillina-streptomicina a 4 °C prima dell'uso. Eseguire procedure di isolamento il giorno della raccolta DF (Figura 1B).</li>
</ol>2. Isolare le popolazioni monocellulari da DF
<ol><li>Preparare soluzioni madre di collagenasi di tipo I e proteasi in DPBS in modo che le concentrazioni finali di collagenasi di tipo I e proteasi siano rispettivamente di 1 mg/mL e 2,4 mg/mL.</li>
	<li>Preparare tre tubi di lavaggio da 50 ml con 20 ml di DPBS per tubo. Etichettare i tubi come 1, 2 e 3.</li>
	<li>Lavare il DF nei tubi di lavaggio in sequenza. Tenere il DF con una pinzetta e posizionare il DF nel tubo 1. Estrarre il DF dal tubo 1 e posizionarlo nel tubo 2. Estrarre il DF dal tubo 2 e posizionarlo nel tubo 3. Agitare delicatamente DF 10-15 volte in ogni tubo. Dopo aver lavato tre volte, posizionare il DF in una piastra di coltura da 60 mm (Figura 2A).</li>
	<li>Tritare il DF con forbici tissutali (Figura 2B). Trasferire solo una piccola porzione al piatto di coltura per ridurre al minimo la perdita di tessuto. Ripetere il taglio fino a quando il DF ha un aspetto polposo o squishy (Figura 2C).</li>
	<li>Mescolare 1 mL di collagenasi di tipo I e 1 mL di soluzione di proteasi in un tubo conico da 15 mL per ottenere concentrazioni finali rispettivamente di 1 mg/mL e 2,4 mg/mL.</li>
	<li>Trasferire il DF tritato nel tubo conico da 15 mL dal punto 2.5. Agitare delicatamente e incubare il tubo per 1 ora a 37 °C.</li>
	<li>Aggiungere 5 mL di tripsina-EDTA allo 0,05% al tubo, agitare e incubare il tubo per 15 minuti a 37 °C.</li>
	<li>Preparare il mezzo cheratinocitario contenente cheratinociti SFM 10% siero bovino fetale (FBS). Aggiungere 3 mL di cheratinociti in un nuovo tubo conico da 50 mL. Posizionare un filtro da 40 μm sopra questo tubo e utilizzare una pipetta sierologica da 10 ml per aspirare il surnatante dal punto 2.6 e passarlo attraverso il filtro. NOTA: Ridurre al minimo l'incorporazione di resti di tessuto digerito durante l'assunzione del surnatante. Rimuovere i residui di tessuto con un filtro da 40 μm per ridurre al minimo il fallimento. I resti di tessuto possono passare attraverso filtri da 70 μm e ostacolare la formazione di colonie. FBS nel mezzo cheratinocitario inattiverà gli enzimi.</li>
	<li>Ripetere i passaggi 2.7 e 2.8.</li>
	<li>Trasferire la sospensione raccolta in un tubo conico da 15 ml.</li>
	<li>Centrifugare il tubo conico da 15 mL a 288 × g per 3 min a 4 °C. Rimuovere il surnatante. NOTA: Fare attenzione ad evitare qualsiasi rimozione accidentale di celle pellettate, che sono per lo più invisibili.</li>
	<li>Aggiungere 3 mL di SFM cheratinocitario e lavare le cellule due volte con una pipetta da 1 mL con centrifugazione come nel passaggio 2.11.</li>
	<li>Placcare la popolazione unicellulare in un piatto di coltura da 60 mm usando cheratinociti SFM. Mantenere la superficie di coltura con un volume finale di 5 ml in un'atmosfera umidificata del 5% di CO2 a 37 °C. Cambiare il terreno di coltura ogni giorno fino a quando non si osservano detriti di tessuto o cellule. NOTA: rimuovere i detriti galleggianti nel terreno di coltura cambiando il mezzo. La rimozione ritardata di detriti tissutali o cellule morte ha un effetto sfavorevole sulla coltura primaria.</li>
	<li>Esaminare la piastra dal passaggio 2.13 per verificare la crescita delle cellule epiteliali (Figura 3A). NOTA: Le cellule epiteliali crescono entro 7-10 giorni dopo la placcatura delle popolazioni monocellulari.</li>
	<li>Espandere le colonie epiteliali e sottoculare le cellule.<ol>
<li>Aspirare il mezzo e lavare il fondo della piastra di coltura una volta con 3 ml di SFM cheratinociti.</li>
		<li>Aggiungere 2 mL di proteasi di dissociazione cellulare e incubare in atmosfera umidificata al 5% di CO2 a 37 °C per 3 min. NOTA: ripetere il passaggio 2.15.2 se il distacco delle cellule non è efficace.</li>
		<li>Aggiungere 2 mL di cheratinociti alla piastra di coltura e trasferire il contenuto in un tubo conico da 15 mL. NOTA: l'aggiunta di più cheratinociti non è necessaria se si ripete il passaggio 2.15.2.</li>
		<li>Centrifugare il tubo conico da 15 mL a 288 × g per 3 min a 4 °C.</li>
		<li>Rimuovere il surnatante e lavare il pellet cellulare due volte con 3 ml di SFM cheratinocitario.</li>
		<li>Placcare le cellule in una capsula di coltura da 100 mm usando cheratinociti SFM (volume finale di 10 ml per piatto da 100 mm).</li>
	</ol></li>
	<li>Preparare e conservare le scorte di cellule in un serbatoio di azoto liquido.<ol>
<li>Cellule di raccolta come descritto nei passaggi 2.15.1-2.15.5.</li>
		<li>Distribuire le cellule in criovioli in 1 mL di mezzo di congelamento (80% cheratinociti SFM, 10% dimetilsolfossido, 10% FBS).</li>
		<li>Mettere i flaconcini in un contenitore congelante e conservarli a -80 °C per 24 ore.</li>
		<li>Trasferire i flaconcini dal congelatore a un serbatoio di azoto liquido.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Tucker, A., Sharpe, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cutting-edge+of+mammalian+development%3B+How+the+embryo+makes+teeth%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">The cutting-edge of mammalian development; How the embryo makes teeth.</a> Nature Reviews Genetics. 5 (7), 499-508 (2004).</li>
<li>Choung, H. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+CPNE7+on+periodontal+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Connective+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">The effect of CPNE7 on periodontal regeneration.</a> Connective Tissue Research. 60 (5), 419-430 (2019).</li>
<li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+immortalized+Hertwig%27s+epithelial+root+sheath+cell+lines+for+cementum+and+dentin+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+and+Therapy%22%5BJournal%5D)">Development of immortalized Hertwig's epithelial root sheath cell lines for cementum and dentin regeneration.</a> Stem Cell Research and Therapy. 10 (1), 3(2019).</li>
<li>Huang, X. F., Bringas, P., Slavkin, H. C., Chai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fate+of+HERS+during+tooth+root+development%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Fate of HERS during tooth root development.</a> Developmental Biology. 334 (1), 22-30 (2009).</li>
<li>Farea, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+enhancement+of+a+homogenous+in+vitro+human+Hertwig%27s+epithelial+root+sheath+cell+population%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Isolation and enhancement of a homogenous in vitro human Hertwig's epithelial root sheath cell population.</a> International Journal of Molecular Sciences. 14 (6), 11157-11170 (2013).</li>
<li>Jung, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directing+the+differentiation+of+human+dental+follicle+cells+into+cementoblasts+and%2For+osteoblasts+by+a+combination+of+HERS+and+pulp+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Histology%22%5BJournal%5D)">Directing the differentiation of human dental follicle cells into cementoblasts and/or osteoblasts by a combination of HERS and pulp cells.</a> Journal of Molecular Histology. 42 (3), 227-235 (2011).</li>
<li>Fang, J., Tang, L., Liu, X. H., Wen, L. Y., Jin, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+of+the+unique+odontogenic+properties+of+rat+apical+bud+cells+under+the+developing+apical+complex+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Oral+Science%22%5BJournal%5D)">Changes of the unique odontogenic properties of rat apical bud cells under the developing apical complex microenvironment.</a> International Journal of Oral Science. 1 (1), 26-33 (2009).</li>
<li>Oh, J. E., Yi, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+dental+follicle-derived+Hertwig%27s+epithelial+root+sheath+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Oral+Investigations%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of dental follicle-derived Hertwig's epithelial root sheath cells.</a> Clinical Oral Investigations. 25 (4), 1787-1796 (2021).</li>
<li>Oh, J. E., Kim, R. H., Shin, K. H., Park, N. H., Kang, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delta+Np63+alpha+protein+triggers+epithelial-mesenchymal+transition+and+confers+stem+cell+properties+in+normal+human+keratinocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Delta Np63 alpha protein triggers epithelial-mesenchymal transition and confers stem cell properties in normal human keratinocytes.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (44), 38757-38767 (2011).</li>
<li>Morsczeck, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+precursor+cells+%28PCs%29+from+human+dental+follicle+of+wisdom+teeth%5BTitle%5D)+AND+%22Matrix+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation of precursor cells (PCs) from human dental follicle of wisdom teeth.</a> Matrix Biology. 24 (2), 155-165 (2005).</li>
<li>Nam, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+profile+of+the+stem+cell+markers+in+human+Hertwig%27s+epithelial+root+sheath%2FEpithelial+rests+of+Malassez+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cells%22%5BJournal%5D)">Expression profile of the stem cell markers in human Hertwig's epithelial root sheath/Epithelial rests of Malassez cells.</a> Molecular and Cells. 31 (4), 355-360 (2011).</li>
<li>Lee, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dental+follicle+cells+and+cementoblasts+induce+apoptosis+of+ameloblast-lineage+and+Hertwig%27s+epithelial+root+sheath%2Fepithelial+rests+of+Malassez+cells+through+the+Fas-Fas+ligand+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Oral+Sciences%22%5BJournal%5D)">Dental follicle cells and cementoblasts induce apoptosis of ameloblast-lineage and Hertwig's epithelial root sheath/epithelial rests of Malassez cells through the Fas-Fas ligand pathway.</a> European Journal of Oral Sciences. 120 (1), 29-37 (2012).</li>
<li>Wan, A. C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recapitulating+cell-cell+Interactions+for+organoid+construction+-+are+biomaterials+dispensable%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Recapitulating cell-cell Interactions for organoid construction - are biomaterials dispensable.</a> Trends in Biotechnology. 34 (9), 711-721 (2016).</li>
<li>Guo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Are+Hertwig%27s+epithelial+root+sheath+cells+necessary+for+periodontal+formation+by+dental+follicle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Oral+Biology%22%5BJournal%5D)">Are Hertwig's epithelial root sheath cells necessary for periodontal formation by dental follicle cells.</a> Archives of Oral Biology. 94, 1-9 (2018).</li>
<li>Sugaya, T., Tomita, M., Motoki, Y., Miyaji, H., Kawamami, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+enamel+matrix+derivative+on+healing+of+root+surfaces+after+bonding+treatment+and+intentional+replantation+of+vertically+fractured+roots%5BTitle%5D)+AND+%22Dental+Traumatology%22%5BJournal%5D)">Influence of enamel matrix derivative on healing of root surfaces after bonding treatment and intentional replantation of vertically fractured roots.</a> Dental Traumatology. 32 (5), 397-401 (2016).</li>
<li>Fong, H. K., Foster, B. L., Popowics, T. E., Somerman, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+crowning+achievement%3A+getting+to+the+root+of+the+problem%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Dental+Education%22%5BJournal%5D)">The crowning achievement: getting to the root of the problem.</a> Journal of Dental Education. 69 (5), 555-570 (2005).</li>
<li>Bonczek, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tooth+agenesis%3A+What+do+we+know+and+is+there+a+connection+to+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Genetics%22%5BJournal%5D)">Tooth agenesis: What do we know and is there a connection to cancer.</a> Clinical Genetics. 99 (4), 493-502 (2021).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.

Questo protocollo include passaggi critici. La raccolta di popolazioni monocellulari è essenziale per il successo dell'isolamento delle cellule epiteliali dalla DF. Abbiamo cercato di isolare le cellule epiteliali dal DF sulla base della nostra ipotesi che ci siano più cellule epiteliali nel DF. La procedura di tritatura migliora il distacco e il rilascio delle cellule dal DF. La procedura di tritatura è stata migliorata e la tritatura è stata ripetuta fino a quando il DF è apparso polposo per facilitare il rilascio di s...

La formazione dei denti inizia con l'invaginazione dell'epitelio orale1. Secondo lo stadio di sviluppo del dente, l'epitelio orale ha nomi diversi, tra cui l'epitelio dello smalto interno ed esterno, l'ansa cervicale e la guaina epiteliale della radice di Hertwig (HERS). I compartimenti epiteliali comunicano con le cellule mesenchimali circostanti. Le interazioni epitelio-mesenchimali regolano la formazione dei denti e la rigenerazione dei tessuti. L'approvvigionamento di cellule epiteliali dentali, come i cheratinociti orali e le cellule della guaina epiteliale della radice di Hertwig (HERSC), è fondamentale per lo studio delle interazioni epiteliale-mesenchimale dentale2.
Le cellule epiteliali dentali derivate dai roditori sono isolate dalla struttura epiteliale, come l'HERS. Li e colleghi hanno isolato e immortalato le HERSC di derivazione molare del ratto dopo aver raccolto la porzione apicale dei germi dei denti in via di sviluppo da ratti di 8 giorni3. L'HERS è stato separato dal tessuto apicale sotto ingrandimento. Considerando lo stadio di sviluppo dei denti e l'età, la raccolta dell'HERS dagli esseri umani è quasi impossibile a causa di problemi etici: un germe dentale in via di sviluppo deve essere rimosso da un bambino piccolo per raccogliere l'HERS umano. I germi dei denti immaturi vengono estratti raramente. Le cellule epiteliali dentali umane possono essere isolate dalla gengiva e dal legamento parodontale (PDL). Le cellule derivate dalla struttura epiteliale partecipano alla formazione dei denti insieme ai componenti mesenchimali e potrebbero essere più adatte per lo studio delle interazioni epiteliali-mesenchimali dentali rispetto ai cheratinociti orali. I resti di cellule epiteliali di Malassez (ERM) sono resti epiteliali derivati da HERS e risiedono in piccoli numeri nel PDL4. Gli studi riportano l'isolamento delle HERSC umane dalla PDL5. Tuttavia, la raccolta di HERSC umane dal tessuto PDL non ha sempre successo a causa della scarsità della popolazione epiteliale in questa posizione5,6.
Sebbene le HERSC derivate dai roditori siano mantenute in mezzi contenenti siero3,7, le cellule epiteliali umane derivate da DF sono coltivate con mezzi privi di siero simili ad altre cellule epiteliali umane, come i normali cheratinociti epidermici umani e i normali cheratinociti orali umani8,9. Ciò implica differenze fisiologiche o funzionali tra le cellule epiteliali dentali dei roditori e le cellule epiteliali dentali umane. Comprendere il meccanismo relativo alle interazioni epiteliale-mesenchimale dentale potrebbe contribuire allo sviluppo di applicazioni cliniche, tra cui il riattaccamento parodontale durante il reimpianto, la rigenerazione parodontale nella malattia parodontale, la rigenerazione del complesso polpa-dentina e la generazione di biodenti. Considerando le caratteristiche della ricerca traslazionale, le cellule epiteliali dentali umane possono essere più appropriate delle cellule epiteliali dentali dei roditori per lo studio delle interazioni epitelio-mesenchimali.
Il DF umano è un tessuto connettivo sciolto e spesso risiede in un dente colpito. Il DF contiene precursori mesenchimali10. Tuttavia, per quanto ne sappiamo, nessuno studio ha riportato l'isolamento delle cellule epiteliali dai follicoli dentali prima del 2021. Oh e Yi hanno riferito l'isolamento delle cellule epiteliali dal DF umano nel 20218. Il fenotipo epiteliale è stato confermato dal western blotting e dall'analisi morfologica. L'analisi dell'origine delle cellule epiteliali derivate da DF ha dimostrato risultati simili con altri studi. Le cellule epiteliali derivate da DF non erano né endoteliali né ematopoietiche5,11, e Oh e Yi suggerivano di nominare queste cellule come DF-HERSC. Il DF ha un volume maggiore rispetto al PDL e più cellule epiteliali possono essere isolate dal DF. Ciò migliora l'emergere di colonie epiteliali e si traduce in un alto tasso di successo nella raccolta di cellule epiteliali da DF. Questo studio suggerisce di utilizzare il DF come fonte di tessuto per l'isolamento delle cellule epiteliali dentali.
Nel presente studio, singole cellule sono state isolate dal DF secondo le procedure precedentemente descritte10,12. Il DF contiene popolazioni cellulari eterogenee e diversi tipi di cellule potrebbero essere presenti nella fase iniziale della procedura. Morsczek e colleghi hanno isolato cellule staminali mesenchimali derivate da DF10. Abbiamo ipotizzato che il DF contenga cellule epiteliali e che solo le cellule epiteliali possano sopravvivere in condizioni prive di siero. Questo studio differisce da quello di Morsczek et al. in termini di selezione della popolazione epiteliale e di inibizione delle cellule mesenchimali. La selezione è stata eseguita utilizzando mezzi privi di siero di cheratinociti (SFM), che consentono la proliferazione delle cellule epiteliali e inibiscono la proliferazione delle cellule mesenchimali. Questo studio ha avuto origine da un rapporto di Oh e Yi8. Lo scopo di questo studio era quello di descrivere i dettagli del metodo utilizzato in quel rapporto per l'isolamento delle cellule epiteliali dal DF umano.

<table><tbody><tr><td>EMSURE ACS, ISO, Reag. Ph Eur 2-propanolo</td><td>EMD millipore Co., MA, USA</td><td>1096341011</td><td>1 L</td></tr><tr><td>0,05% tripsina-EDTA</td><td>Gibco, Grand island, NY, USA</td><td>25300054</td><td>100 mL</td></tr><tr><td>40 &mu; Falcon</td><td>, NC, USA</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>Piastra per colture cellulari (100 x 20 mm)</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA</td><td>172958</td><td>Fuori produzione</td></tr><tr><td>Piastra per colture cellulari (60 x 15 mm)</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA</td><td>150326</td><td></td></tr><tr><td>Collagenasi tipo 1</td><td>Gibco, Grand island, NY, USA</td><td>17100017</td><td>1 g</td></tr><tr><td>Combi-514R / Refrigerato di grande capacità centrifuga</td><td>Hanil science industrial Co., LTD., Daejeon, Corea del Sud</td><td>CB-514R</td><td></td></tr><tr><td>Provetta conica</td><td>SPL Life Sciences Co., Ltd., Gyeonggi-do, Corea del Sud</td><td>50015 50050</td><td>15 mL 50 mL</td></tr><tr><td>Fiala criogenica</td><td>Corning Inc., NY, Stati Uniti</td><td>430488</td><td>2 ml</td></tr><tr><td>Dimetilsolfossido (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich, Missouri, Stati Uniti</td><td>D2650-100ml</td><td>100 ml</td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Gibco, Grand island, NY, USA</td><td>17105041</td><td>1 g</td></tr><tr><td>Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline</td><td>Welgene Inc., Gyengsangbuk-do, Corea del Sud</td><td>&nbsp;LB 001-02</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>Gibco, Grand island, NY, USA</td><td>16000044</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>Heraeus BB 15 / CO2 incubatore</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA</td><td>51023121</td><td></td></tr><tr><td>Terreno senza siero per cheratinociti</td><td>Gibco, Grand island, NY, USA</td><td>10724-011</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>MVE CryoSystem 2000</td><td>MVE Biological Solutions Co., GA, USA</td><td>CryoSystem 2000</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene Mr. Frosty Freezing Container</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA</td><td>5100-0001</td><td>per 1,2-2 mL CryoVials</td></tr><tr><td>Olympus CKX41 / Microscopio</td> <td>per colture cellulari invertiteOlympus Life Science, Waltham, Massachusetts</td><td>22-00723-01</td><td>Fuori produzione</td></tr><tr><td>Penicillina-streptomicina Streptomicina</td><td>Gibco, Grand island, NY, USA</td><td>15140122</td><td>100 mL (10.000 U/mL)</td></tr><tr><td>Pipet aid XP</td><td>Drummond scientific Co., PA, USA</td><td>HDR-4-000-201</td><td></td></tr><tr><td>Pipetman Classic P1000</td><td>Gilson, Villiers le Bel, Francia</td><td>F123602</td><td>100-1000 &micro; L</td></tr><tr><td>Refrigerante</td><td>Nihon congelatore Co. Ltd., Tokyo, Giappone</td><td>CLN 540U</td><td>~-80 &deg; C / Fuori produzione</td></tr><tr><td>Pipetta sierologica</td><td>SPL Life Sciences Co., Ltd., Gyeonggi-do, Corea del Sud</td><td>91010</td><td>10ml</td></tr><tr><td>TrypLE Express Enzyme (1x), rosso fenolo</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA</td><td>12605010</td><td>proteasi di dissociazione cellulare</td></tr></tbody></table>

isolamento delle cellule epiteliali dal follicolo dentale umano

Isolation of Epithelial Cells from Human Dental Follicle

Il follicolo dentale (DF) è stato raccolto durante la rimozione di un terzo molare colpito da un chirurgo maxillo-facciale orale. L'isolamento delle cellule epiteliali è stato eseguito il giorno della raccolta DF. Il DF è stato lavato tre volte con DPBS e poi sezionato con forbici di tessuto fino a quando il tessuto ha avuto una consistenza polposa o schiacciata. Le popolazioni unicellulari sono state pellettizzate mediante centrifugazione e lavate con un mezzo privo di siero di cheratinociti. Popolazioni cellulari eterogenee sono state distribuite in un piatto di coltura. Il mezzo privo di siero dei cheratinociti è stato utilizzato per selezionare le cellule epiteliali. Il terreno di coltura è stato cambiato ogni giorno fino a quando non sono stati osservati detriti galleggianti o cellule morte. Le cellule epiteliali sono apparse entro 7-10 giorni dalla distribuzione della popolazione cellulare. Le cellule epiteliali sono sopravvissute in mezzo privo di siero, mentre il mezzo essenziale minimo di modificazione α integrato con il 10% di siero bovino fetale ha permesso la proliferazione di cellule di tipo mesenchimale. Il DF è una fonte di tessuto per l'isolamento delle cellule epiteliali dentali.
Lo scopo di questo studio era quello di stabilire un metodo per l'isolamento delle cellule epiteliali dal DF umano. Il legamento parodontale (PDL) è stato utilizzato per l'isolamento delle cellule epiteliali dentali umane. L'approvvigionamento di cellule epiteliali dalla PDL umana non ha sempre successo a causa del piccolo volume tissutale, che porta a un basso numero di cellule epiteliali. DF ha un volume maggiore di PDL e contiene più celle. DF può essere una fonte di tessuto per la coltura primaria di cellule epiteliali dentali umane. Questo protocollo è più semplice ed efficiente rispetto al metodo di isolamento che utilizza PDL. L'approvvigionamento di cellule epiteliali dentali umane può facilitare ulteriori studi sulle interazioni epiteliali-mesenchimali dentali.

Raccolta DF La chirurgia è stata eseguita da un chirurgo maxillo-facciale orale. I materiali di derivazione umana, tra cui il frammento del dente, il tessuto gengivale e il DF, sono stati raccolti da un chirurgo (Figura 1A). Il DF potrebbe essere attaccato al frammento del dente. Un chirurgo maxillo-facciale orale sarà in grado di identificare il DF. La cooperazione e la comunicazione con il chirurgo sono necessarie per la raccolta dei tessuti. Il DF è un tessuto simile a...

Il follicolo dentale contiene una popolazione epiteliale e cellule mesenchimali. La popolazione epiteliale è stata selezionata dalla popolazione eterogenea di cellule follicolari dentali fornendo un terreno di coltura distinto. Le cellule epiteliali sopravvissero e formarono colonie in un mezzo privo di siero.

Isolamento delle cellule epiteliali dal follicolo dentale umano

The dental follicle (DF) was harvested during the removal of an impacted third molar by an oral maxillofacial surgeon. Epithelial cell isolation was ...

Questo protocollo dimostra un metodo avanzato per l'approvvigionamento di cellule epiteliali dentali umane. È difficile identificare il pellet di cella aggregato durante le procedure. Fai attenzione quando maneggi il surnatante per prevenire la perdita di popolazioni cellulari.Per iniziare, raccogliere i follicoli dentali durante l'estrazione chirurgica dei terzi molari colpiti. Avviare le procedure di isolamento cellulare o conservare i follicoli dentali a quattro gradi Celsius in DPBS con il 3% di penicillina-streptomicina. Per lavare i follicoli dentali, tenere il follicolo dentale con una pinzetta e metterlo nel tubo di lavaggio 1.Agitare delicatamente da 10 a 15 volte. Estrailo e mettilo nel tubo 2. Ancora una volta, agitalo da 10 a 15 volte.Infine, estrarlo e metterlo nel tubo 3, quindi agitarlo. Dopo il lavaggio tre volte, posizionare il follicolo dentale in un piatto di coltura da 60 millimetri. Tritare il tessuto con le forbici del tessuto fino a quando il follicolo dentale ha un aspetto polposo o schiacciato.Utilizzare una piccola sezione laterale del piatto di coltura per ridurre al minimo la perdita di tessuto. Mescolare un millilitro ciascuno di collagenasi di tipo 1 e

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Biologia

Un modo rapido, robusto di isolare vitali cellule staminali epiteliali adulte di pelle umana è descritta. Il metodo utilizza la digestione enzimatica della matrice di collagene della pelle, seguita da spiumatura dei follicoli piliferi e l'isolamento delle sospensioni singola cella o frammenti di tessuto per la coltura cellulare.

Isolamento e la coltura di cellule staminali epiteliali da pelle umana

Il metodo descritto l'isolamento e la caratterizzazione di cellule staminali dentali umane Pulp (hDPSCs)...

Differenziazione Isolamento, caratterizzazione e comparata delle cellule umane Dental Pulp staminali derivate da denti permanenti mediante due diversi metodi

Il mouse in continua crescita incisivo fornisce un modello per lo studio rinnovamento dei tessuti dentali da cellule staminali epiteliali dentali (desc). Un sistema robusto per modo coerente e affidabile l'ottenimento di tali cellule dal incisivo e in espansione in vitro è riportato qui.

Isolamento e Cultura della Dental epiteliali cellule staminali del topo adulto Incisor

Un modello ideale per studiare la biologia delle cellule staminali adulte è il follicolo pilifero del topo. Qui presentiamo un protocollo per isolare diverse popolazioni di cellule staminali dei follicoli piliferi e cheratinociti epidermici, impiegando la digestione enzimatica della pelle dorsale del topo seguita dall'analisi FACS.

Isolare le cellule staminali del follicolo pilifero e epidermico cheratinociti da pelle dorsale del mouse

Questo protocollo descrive l'ingegneria genetica transitoria delle cellule staminali dentali estratti dal follicolo dentale umano. La strategia applicata modifica non virali può diventare una base per il miglioramento dei prodotti terapeutico delle cellule staminali.

Isolamento, caratterizzazione e MicroRNA-basato di modificazione genetica di cellule staminali del follicolo dentale umano

Questo manoscritto descrive un protocollo basato su FACS per l'isolamento dei fibroblasti papillari e reticolari dalla pelle umana. Si aggira in vitro cultura che era inevitabile con il protocollo di isolamento comunemente usato attraverso le colture espianti. I sottogruppi di fibroblasti emananti sono funzionalmente distinti e mostrano l'espressione genica differenziale e la localizzazione all'interno del derma.

Isolamento dei fibroblasti papillari e reticolari dalla pelle umana mediante selezione cellulare attivata a fluorescenza

Presentiamo un metodo per isolare e coltivare cellule epiteliali derivate dalla ghiandola umana primaria. Queste cellule presentano modelli di espressione genica coerenti con loro di origine epiteliale salivari e possono essere coltivate come salisfere su matrici di membrana seminterrato derivate da cellule tumorali Engelbreth-Holm-Swarm o come monostrati su piatti di coltura trattati.

Isolamento delle cellule epiteliali salivari dalle ghiandole salivari umane per la crescita in vitro come Salispheres o Monostrati

Qui presentiamo un metodo modificato per l'isolamento e la coltura di cellule epiteliali gengivali umane aggiungendo l'inibitore della roccia, Y-27632, al metodo tradizionale. Questo metodo è più semplice, richiede meno tempo, migliora le proprietà delle cellule staminali e produce un numero maggiore di cellule epiteliali ad alto potenziale sia per il laboratorio che per le applicazioni cliniche.

Isolamento e coltura di cellule epiteliali gengivali umane primarie utilizzando Y-27632

L'attuale protocollo presenta un metodo veloce, efficiente e delicato per isolare singole cellule adatte per l'analisi RNA-seq a singola cellula da un incisivo di topo in continua crescita, molare di topo e denti umani.

Isolamento rapido di singole cellule da denti di topo e umani

Questo protocollo descrive un metodo di un giorno per l'isolamento delle cellule epiteliali delle tube di Falloppio umane. Le cellule epiteliali isolate possono essere piastrate in coltura bidimensionale (2D) o dissociate in sospensioni di singole cellule e utilizzate in esperimenti a valle, tra cui la citometria a flusso e il sequenziamento dell'RNA a singola cellula.

Un metodo efficiente per l'estrazione degli epiteli umani delle tube di Falloppio per l'analisi di singole cellule

Impara l'isolamento delle cellule epiteliali dal follicolo dentale umano utilizzando collagenasi e tripsina-EDTA. Questo metodo consente la formazione di colonie in 7-10 giorni in mezzo senza siero.

Isolamento delle cellule epiteliali dal follicolo dentale umano

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