Name: Misurazione della fotofisiologia dello stadio collegato di Colacium sp. da un fluorometro a velocità di ripetizione rapida di tipo cuvetta (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-11-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 3 s
Description: Scopri come misurare la fotofisiologia di Colacium sp. attaccato a zooplancton utilizzando un fluorometro FRRf a cuvetta. Questo metodo permette analisi in tempo reale della fotosintesi algale in condizioni naturali.

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Il lavoro è stato sostenuto dal Collaborative Research Fund della Prefettura di Shiga dal titolo "Studio sulla qualità dell'acqua e sull'ambiente del fondo lago per la protezione della solidità dell'ambiente idrico" nell'ambito della sovvenzione giapponese per la rivitalizzazione regionale e il Fondo per la ricerca e lo sviluppo tecnologico dell'ambiente (n. 5-1607) del Ministero dell'Ambiente, Giappone. https://www.kantei.go.jp/jp/singi/tiiki/tiikisaisei/souseikoufukin.html. Gli autori desiderano ringraziare Enago (www.enago.jp) per la recensione in lingua inglese.

1. Campionamento
<ol><li>Raccogli l'acqua del lago dalla superficie con un secchio. Per colpire Colacium sp. attaccato a S. mucronata (Figura 1A-C) filtrare 0,5-10 L di acqua di lago utilizzando una rete a rete di nylon da 100 μm52. NOTA: S. mucronata spesso si aggrega densamente in acque poco profonde, eutrofiche, fangose, come tra le aree di canna (phragmites).</li>
	<li>Conservare i campioni concentrati in bottiglie di plastica da 500 ml con 350 ml di acqua di lago. Conservare in condizioni di oscurità.</li>
	<li>In laboratorio, versare l'acqua del campione in un becher da 500 ml e lasciarlo depositare per alcuni minuti.</li>
	<li>Filtrare l'acqua del lago attraverso un filtro di dimensioni dei pori di 0,2 μm.</li>
	<li>Raccogli S. individui mucronata che usano una pipetta al microscopio ottico con ingrandimento 100x. Eseguire l'identificazione delle specie secondo Błędzki e Rybak53.</li>
	<li>Trasferirli in una goccia di acqua di lago filtrata (FLW) da 0,2 μm posta su un vetrino. NOTA: S. mucronata può nuotare in superficie o attaccarsi alla parete del becher.</li>
	<li>Controllare S. mucronata al microscopio ottico.</li>
	<li>Lavare S. individui mucronata che usano FLW (3 gocce o più) per prevenire la contaminazione da altri organismi (Figura 2).</li>
	<li>Mantenere S. mucronata ad una temperatura in situ in una camera di crescita inferiore a 40 μmol fotone·m−2·s−1.</li>
</ol>2. Effetti di S . mucronata alla fluorescenza basale
<ol><li>
S. coltivazione mucronata<ol>
<li>Prelevare gli individui di S. mucronata usando una pipetta al microscopio ottico con ingrandimento 100x e lavare con FLW, come nel passaggio 1.8.</li>
		<li>Aerare l'acqua del rubinetto utilizzando una pompa dell'aria elettrica tramite una pietra d'aria per almeno 1 settimana. Versare 300 ml di acqua di rubinetto aerata in un barattolo di vetro da 350 ml.</li>
		<li>Nutrire la clorella (1 mg C·L−1) e mantenere a 20 °C sotto 40 μmol fotone·m−2·s−1 in una camera di crescita.</li>
		<li>Dopo circa 14 giorni, raccogliere 5-30 individui usando una pipetta al microscopio ottico con ingrandimento 100x e inocularli in 300 ml di acqua di rubinetto pulita e aerata per mantenere il mezzo fresco.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Configurazione di FRRf<ol>
<li>Avvia il software Act2Run.</li>
		<li>Fare clic sulla scheda Opzioni e selezionare Act2 FLC (LED bianchi) in Modalità di funzionamento per impostare il colore dei LED attinici.</li>
		<li>Fare clic sul valore di Buio al passaggio 1 delle impostazioni della curva di luce fluorescente nella finestra principale e digitare 30 per impostare la durata del periodo di buio (Figura 3A).</li>
		<li>Fare clic sulla combinazione di LED B, C e D per disattivare i LED verdi e arancioni (Figura 3C).</li>
		<li>Fare clic sul valore di Fets e Pitch in Sat e digitare rispettivamente 100 e 2 per impostare il numero e il pitch del flashlet nella fase di saturazione (Figura 3D).</li>
		<li>Fare clic sul valore di Fets e Pitch sotto Rel e digitare rispettivamente 40 e 60 per impostare il numero e il pitch del flashlet nella fase di rilassamento (Figura 3E).</li>
		<li>Attivare la pompa a camicia d'acqua facendo clic su During FLC (Figura 3F) per controllare la temperatura del campione durante la misurazione.</li>
		<li>Attivare facendo clic su Auto-LED e Auto-PMT (Figura 3F).</li>
		<li>Fare clic su Sincronizza per connettersi a FRRf-Act2.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Misure FRRf<ol>
<li>Per esaminare gli effetti degli individui di zooplancton sulla fluorescenza basale, preparare S adulto. mucronata (dimensioni corporee 400-650 μm) dalla coltura nei passaggi 2.1.1-2.1.4 senza organismi attaccati.</li>
		<li>Per evitare la fluorescenza dal contenuto intestinale, affamare gli individui in FLW a 20 ° C per almeno 90 minuti.</li>
		<li>Versare 1,5 ml di FLW in una cuvetta. Raccogli individui con 0, 1, 5 e 10 S. mucronata usando una pipetta al microscopio ottico con ingrandimento 100x.</li>
		<li>Trasferimento S. mucronata individui nella cuvetta e aggiungere FLW per portare il campione fino a 2 ml.</li>
		<li>Acclimatarsi in condizioni di scarsa illuminazione (1-10 μmol foton·m−2·s−1) a 20 °C per 15 minuti prima della misurazione FRRf.</li>
		<li>Fare clic su Act2 Run per avviare la misurazione. Ripetere le misurazioni >3 volte per campione.</li>
		<li>Leggere il valore Fo dal grafico dei risultati (Figura 4).</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Effetti dell'organismo substrato sulla fluorescenza Chl- a
<ol><li>
Colacium sp. coltivazione<ol>
<li>Preparare il FLW e l'AF-6 medium54 per la coltivazione (Tabella 2).</li>
		<li>Raccogliere Colacium sp. attaccato a S. mucronata come nei passaggi 1.1 e 1.2 e, mantenere a temperatura in situ in una camera di crescita.</li>
		<li>Prelevare Colacium sp. con un carapace fuso (Figura 1D) utilizzando una pipetta al microscopio ottico con ingrandimento 100x. Lavarli con FLW, come nel passaggio 1.8.</li>
		<li>Inoculare inoculare asetticamente Colacium sp. e AF-6 medium in un tubo di vetro da 10 ml su un banco pulito.</li>
		<li>Mantenere la coltura a temperatura in situ sotto 200 μmol fotone·m−2·s−1 in una camera di crescita. Agitare delicatamente il tubo di vetro a mano almeno una volta al giorno per evitare l'insediamento cellulare. NOTA: Per mantenere l'effetto di attenuazione delle colonie aggregate il più basso possibile, controllare le colonie al microscopio prima della misurazione FRRf. L'aggregazione cellulare può causare colonie dense e influenzare la fotofisiologia algale55.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Misure FRRf<ol>
<li>Per esaminare gli effetti degli individui di zooplancton sulla fluorescenza Chl-a da Colacium sp., preparare S adulto. mucronata (dimensioni corporee 400-650 μm) senza organismi attaccati.</li>
		<li>Per evitare la fluorescenza dal contenuto intestinale, affamare gli individui in FLW per almeno 90 minuti.</li>
		<li>Impostare un fluorometro a velocità di ripetizione rapida di tipo cuvetta (FRRf).</li>
		<li>Versare un sottocampione da 1,5 ml di Colacium sp. precolto in una cuvetta. Trasferisci 0, 5, 10 e 15 S. mucronata individui in queste cuvette e aggiungere 2 μm di mezzo filtrato per portare il campione fino a 2 ml.</li>
		<li>Acclimatarsi in condizioni di scarsa illuminazione (1-10 μmol fotone·m−2·s−1) a 20 °C per 15 minuti prima di effettuare la misurazione FRRf. NOTA: Mantenere i campioni alla temperatura di incubazione durante le misurazioni</li>
		<li>Fare clic su Act2 Run per avviare la misurazione. Ripetere le misurazioni >3 volte per campione.</li>
		<li>Leggere i valori FO e Fm dal grafico dei risultati (Figura 4). NOTA: Controllare il valore RσPSII (Tabella 1), che mostra se la potenza del LED rientra nell'intervallo ottimale per stimare correttamente i parametri PSII. Quando l'Auto-LED è attivato, il sistema Act2run controlla la potenza del LED per ottenere un intervallo RσPSII ottimale (0,042-0,064). Il valore di cut-off sperimentale RσPSII è stato definito a 0,03 e 0,08 in uno studio precedente48.</li>
		<li>Per correggere la fluorescenza basale22, filtrare il terreno di coltura utilizzando un filtro di dimensioni dei pori di 0,2 μm e misurare la fluorescenza. Sottrarre FO del campione di base da FO e Fm di Colacium sp. oppure modificare il valore di correzione Blank nelle Impostazioni della scheda Opzioni.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Fotofisiologia di Colacium sp. (stadio allegato)
<ol><li>Isolare gli individui di S. mucronata con Colacium sp. usando una pipetta al microscopio ottico.</li>
	<li>Lavare S. mucronata utilizzando FLW, come nel passaggio 1.8.</li>
	<li>Trasferimento S. mucronata in un 100 mL di FLW. Per la fame, tenere in condizioni di oscurità a temperatura in situ per 90 minuti.</li>
	<li>Versare 1,5 ml di FLW in una cuvetta.</li>
	<li>Trasferimento ~10 S. mucronata individui con Colacium sp. in una cuvetta. Per le misurazioni sono necessarie più di 100 cellule di Colacium per 2 ml. Aggiungere FLW per portare il campione fino a 2 ml.</li>
	<li>Acclimatarsi in condizioni di scarsa illuminazione (1-10 μmol fotone·m−2·s−1) a temperatura in situ per 15 min. Misurare la fluorescenza Chl-a come nei passaggi 3.2.6-3.2.8.</li>
	<li>Per enumerare il numero di cellule attaccate, fissare il campione con glutaraldeide (volume finale del 2%) dopo aver effettuato la misurazione FRRf. Scatta foto a diverse profondità focali e posizioni di S. mucronata al microscopio ottico.</li>
</ol>5. Fotofisiologia del Colacium sp. (stadio planctonico)
<ol><li>Coltivare Colacium sp. campionato in mezzo AF-6 a temperatura in situ come nei passaggi 3.1.1-3.1.5.</li>
	<li>Per la fase stazionaria, prendere 2 ml di Colacium sp. coltivato e versare in una cuvetta.</li>
	<li>Acclimatarsi in condizioni di scarsa illuminazione (1-10 μmol fotone·m−2·s−1) a temperatura in situ per 15 min. Misurare la fluorescenza Chl-a come nei passaggi 3.2.6-3.2.8.</li>
</ol>6. Effetti dell'addizione di Ca e Mn sulla fotofisiologia di Colacium sp.
<ol><li>Effetti sul palco collegato<ol>
<li>Isolare gli individui di S. mucronata con Colacium sp. usando una pipetta al microscopio ottico. Lavare con FLW, come nel passaggio 1.8.</li>
		<li>Trasferire sei individui ciascuno in 12 bicchieri di vetro con 30 ml di FLW. Assicurarsi che ogni becher contenga >100 cellule colacium sp.</li>
		<li>Aggiungere 200 μmol· L−1 CaCl2· H2O (trattamento Ca), 40 μmol· L−1 MnCl4 (trattamento Mn), o acqua ultrapura (controllo) a ciascun becher. Incubare i campioni sotto 200 μmol fotoni·m−2 ·s−1 a temperatura in situ in una camera di crescita.</li>
		<li>A 3 h e 21 h, trasferire tutti gli individui e le pelli mutate in una cuvetta con 2 ml del mezzo.</li>
		<li>Per esaminare la risposta rapida all'aumento della luce, fare clic su Su dei periodi di 8 passi di luce attinica e digitare 20 (Figura 3A) per impostare la durata di ciascun passaggio in 20 s. Per impostare la luce attinica graduale come 0, 11, 25, 44, 68, 101, 144 e 200 μmol foton·m−2·s−1, fare clic su High E e Step Up e modificare i valori rispettivamente in 200 e 34 (Figura 3B).</li>
		<li>Dopo 15 minuti di acclimatazione scura, misurare la fluorescenza Chl-a di ciascun campione in modo simile ai passaggi 3.2.6-3.2.8. NOTA: verificare che i valori RσPSII e RσPSII' rientrino nell'intervallo ottimale (0,03-0,08)48.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Effetti sullo stadio planctonico<ol>
<li>Coltivare Colacium sp. campionato in mezzo AF-6 a temperatura in situ come nei passaggi 3.1.1-3.1.5.</li>
		<li>Trasferire il Colacium sp. coltivato in FLW e acclimatarsi a temperatura in situ inferiore a 200 μmol fotone·m−2·s−1 per 3 giorni.</li>
		<li>Trasferire 1 mL dei campioni acclimatati in tre flaconcini di vetro con 10 mL di FLW.</li>
		<li>Aggiungere 200 μmol· L−1 CaCl2· H2O (trattamento Ca), 40 μmol· L−1 MnCl3 (trattamento Mn) o acqua ultrapura (controllo) ai flaconcini. Incubare i campioni sotto 200 μmol fotoni·m−2·s−1 a temperatura in situ in una camera di crescita.</li>
		<li>A 3 ore e 21 ore, misurare la fluorescenza Chl-a di ciascun campione come nei passaggi 3.2.6-3.2.8.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Gli autori non hanno divulgazioni da dichiarare.

Questo protocollo ha dimostrato per la prima volta che la fotofisiologia di Colacium sp. durante la fase attaccata in un ambiente naturale è paragonabile al suo stadio planctonico nel mezzo AF-6. Inoltre, il contenuto intestinale di S. mucronata affamato non ha influenzato la fluorescenza al basale e Chl-a quando la densità era ≤5 inds·mL−1 (Figura 5 e Figura 6). Questi risultati suggeriscono che questo protocollo può misura...

La fluorescenza variabile della clorofilla è uno strumento utile per misurare la fotofisiologia del fotosistema algale II (PSII). Le alghe rispondono a vari stress ambientali, come l'eccesso di luce e la carenza di nutrienti, alterando la loro fotofisiologia PSII. Il fluorometro a velocità di ripetizione rapida (FRRf) è un metodo comune per misurare la fotofisiologia PSII1,2 e stimare la produttività primaria1,3,4, che consente di monitorare la fotofisiologia del fitoplancton PSII e la produttività primaria su ampie scale spaziali e temporali5,6,7. FRRf può misurare simultaneamente la sezione trasversale di assorbimento PSII (σ PSII), la concentrazione del centro di reazione ([RCII]), la massima efficienza fotochimica (Fv / Fm), l'efficienza fotochimica efficace (Fq ′ / Fm′) e la tempra non fotochimica (NPQNSV) (Tabella 1). In generale, Fv/Fm e Fq′/Fm′ sono definiti come attività PSII8, mentre NPQNSV è definito come energia relativa dissipata dal calore9.
È importante sottolineare che i flash a singolo turnover (ST) di FRRf riducono completamente l'accettore di elettroni chinoni primari, QA, ma non il pool di plastochinoni. Al contrario, i flash di rotazione multipla (MT) da un fluorometro a modulazione di ampiezza dell'impulso (PAM) possono ridurre entrambi. Il metodo ST ha un chiaro vantaggio rispetto al metodo MT nell'identificare le possibili origini di NPQNSV misurando contemporaneamente la cinetica di recupero di Fv/Fm, Fq′/Fm′, NPQNSV e σ PSII10. Ad oggi, diversi tipi di strumenti FRRf, come il tipo sommergibile, il tipo cuvetta e il tipo flow-through, sono disponibili in commercio. Il FRRf di tipo sommergibile consente misurazioni in situ in oceani e laghi, mentre il FRRf di tipo cuvetta è adatto per misurare piccoli volumi di campioni. Il tipo flow-through è comunemente usato per misurare continuamente la fotofisiologia del fitoplancton nelle acque superficiali.
Dato lo sviluppo di fluorometri PAM, incluso il tipo a cuvetta, per una vasta gamma di soggetti11, i fluorometri PAM sono ancora più comuni dei FRRf nella ricerca di fotofisiologia algale12. Ad esempio, sebbene la struttura della camera del campione e la capacità della cuvetta tra questi strumenti differiscano solo leggermente, il PAM di tipo cuvetta è stato applicato ai fitoplancton13,14,15, alle microalghe bentoniche16,17,18, alle alghe ghiacciate19 e alle alghe epizoiche20, mentre la FRRf di tipo cuvetta è stata applicata principalmente ai fitoplancton21,22,23 e un numero limitato di comunità algali di ghiaccio24,25. Data la sua efficacia, il FRRf di tipo cuvetta è ugualmente applicabile alle alghe bentoniche ed epizoiche. Pertanto, l'espansione della sua applicazione fornirà una notevole comprensione della fotofisiologia PSII, in particolare per la fotofisiologia algale epizoica meno conosciuta.
Le alghe epizoiche hanno ricevuto poca attenzione, con pochi studi che esaminano la loro fotofisiologia PSII20,26, molto probabilmente a causa dei loro ruoli minori nelle reti alimentari acquatiche27,28. Tuttavia, gli epibionti, comprese le alghe epizoiche, possono influenzare positivamente le dinamiche della comunità dello zooplancton, come l'aumento dei tassi di riproduzione e sopravvivenza29,30, nonché i processi di impatto negativo, come l'aumento del tasso di affondamento29,31 e la vulnerabilità ai predatori visivi32,33,34,35,36 . Pertanto, è fondamentale esplorare i fattori ambientali e biologici che controllano le dinamiche epibionti nelle comunità di zooplancton.
Tra le alghe epizoiche, Colacium Ehrenberg 1834 (Euglenophyta) è un gruppo algale comune, d'acqua dolce32,37,38,39 con vari stadi di vita, tra cui annesso (Figura 1A-D), planctonico non mobile (Figura 1E,F) e stadio planctonico mobile40,41 . Durante lo stadio planctonico non mobile, le cellule vivono come plancton unicellulari, colonie aggregate o colonie di fogli monostrato, coperte da mucillagini42. Nella fase attaccata, Colacium sp. utilizza mucillagini escrete dall'estremità anteriore della cellula37,39,41 per attaccarsi agli organismi substrati (basibionti), in particolare ai microcrustaceani41,43. Il loro ciclo vitale comporta anche il distacco dall'esoscheletro fuso o dal basibionte morto e il nuoto con i loro flagelli per trovare un altro organismo substrato39. Sia gli stadi planctonici che quelli attaccati possono aumentare le dimensioni della popolazione di mitosi40. Sebbene il loro stadio collegato sia ipotizzato come un tratto evolutivo per la raccolta di risorse, come la luce44 e gli oligoelementi41,45,46, o come strategia di dispersione27, sono disponibili poche prove sperimentali su questi aspetti37,41,44 e i meccanismi di attaccamento chiave sono in gran parte sconosciuti. Ad esempio, Rosowski e Kugrens si aspettavano che Colacium ottenesse manganese (Mn) dai copepodi del substrato41, concentrati nell'esoscheletro47.
Qui, descriviamo come misurare la fotofisiologia PSII delle alghe planctoniche e il relativo metodo di applicazione per il targeting delle alghe attaccate (che si attaccano allo zooplancton) con le cellule colacium sp. usando il FRRf di tipo cuvetta. Utilizziamo il sistema Act2 dotato di tre diodi emettitori di luce (LED) che forniscono energia di eccitazione del flash centrata a 444 nm, 512 nm e 633 nm48. Qui, 444 nm (blu) corrisponde al picco di assorbimento della corofilla a (Chl-a), mentre 512 nm (verde) e 633 nm (arancione) corrispondono ai picchi di assorbimento della ficoeritrina e della ficocianina, rispettivamente. Il picco di rilevamento del segnale fluorescente è di 682 nm con una mezza larghezza di banda di 30 nm. Poiché è difficile trovare lo stadio planctonico di Colacium sp. in ambienti naturali, il loro stadio attaccato è stato raccolto per gli esperimenti. Tra i numerosi organismi substrato, Scapholeberis mucronata O.F. Müller 1776 (Branchiopoda, Daphniidae; La Figura 1A, B, G) è una delle più semplici da gestire a causa della loro bassa velocità di nuoto, delle grandi dimensioni del corpo (400-650 μm) e del comportamento unico (appeso a testa in giù sulla superficie dell'acqua). Pertanto, questo protocollo utilizza Colacium sp. attaccato su S. mucronata come caso di studio del sistema Colacium-basibiont. Per evitare la fluorescenza derivata dal contenuto intestinale, S. mucronata è stata affamata. Poiché uno studio precedente ha riportato che il segnale di fluorescenza dal contenuto intestinale (alghe ingerite) mostra una diminuzione di cinque volte dopo 40 min49, ci aspettavamo che 90 minuti di fame sarebbero stati sufficienti per ridurre al minimo la possibilità che la fluorescenza del contenuto intestinale influenzasse la misurazione FRRf con effetti minimi di stress sperimentale a Colacium sp., come la carenza di nutrienti. Inoltre, questo protocollo è stato applicato per chiarire il meccanismo di attacco di Colacium sp. e determinare come due metalli, calcio (Ca) e manganese (Mn) influenzano la fotofisiologia di entrambi gli stadi planctonici e attaccati. Il calcio svolge un ruolo chiave nelle vie fotosintetiche50 in diversi modi, ed entrambi i metalli sono necessari per costruire i complessi in evoluzione dell'ossigeno del PSII51. Poiché il calcio e il manganese sono altamente concentrati nel carapace dello zooplancton dei crostacei47, ipotizziamo che la fotofisiologia di Colacium sp. potrebbe rispondere in modo più prominente all'arricchimento di Ca e Mn durante lo stadio planctonico se questa fase di vita ottiene questi elementi da S. mucronata durante lo stadio attaccato.

<table><tbody><tr><td>filtro per siringa Acrodisc</td><td>Pall Corporation, Ann Arbor, MI, USA</td><td></td><td>0.2 &mu; m dimensione dei pori</td></tr><tr><td>Act2Run</td><td>CTG Ltd., West Molesey, Regno Unito</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biotina</td><td>Wako</td><td>023-08711</td><td>AF-6 medio</td></tr><tr><td>CaCl2&middot; 2H2O</td><td>Wako</td><td>031-25031</td><td>AF-6 medio</td></tr><tr><td>CaCO3</td><td>Wako</td><td>036-00382</td><td>AF-6 medio</td></tr><tr><td>Acido citrico</td><td>Wako</td><td>036-05522</td><td>AF-6</td></tr><tr><td>medio CoCl2&middot; 6H2O</td><td>Wako</td><td>036-03682</td><td>AF-6 medium</td></tr><tr><td>Clorella concentrata</td><td>Recenttec, Tokyo, Giappone</td><td></td><td>20 mg C&middot; mL&minus; 1 ; negozio a 4 &deg; C</td></tr><tr><td>FastOcean Act2</td><td>CTG Ltd., West Molesey, Regno Unito</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fe-citrato</td><td>Wako</td><td>093-00952</td><td>AF-6 medio</td></tr><tr><td>FeCl3&middot; 6H2O</td><td>Wako</td><td>091-00872</td><td>AF-6 medio</td></tr><tr><td>HCLP-880PF</td><td>Nippon Medical and Chemical Instruments &nbsp;Co., Ltd., Osaka, Giappone</td><td></td><td>Con lampadine a LED</td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Wako</td><td>160-04292</td><td>AF-6 medio</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Wako</td><td>167-04241</td><td>AF-6 medio</td></tr><tr><td>MgSO4&middot; 7H2O</td><td>Wako</td><td>137-00402</td><td>AF-6 medio</td></tr><tr><td>MnCl3&middot; 4H2O</td><td>Wako</td><td>139-00722</td><td>AF-6 medio</td></tr><tr><td>Na2EDTA</td><td>Wako</td><td>343-01861</td><td>AF-6 medio</td></tr><tr><td>Na2MoO4</td><td>Wako</td><td>196-02472</td><td>AF-6 medio</td></tr><tr><td>NaNO3</td><td>Wako</td><td>191-02542</td><td>AF-6 medio</td></tr><tr><td>NH4NO3</td><td>Wako</td><td>015-03231</td><td>AF-6 medium</td></tr><tr><td>Plankton Counter</td><td>Matsunami Glass, Osaka, Japan</td><td>S6300</td><td></td></tr><tr><td>Pylex provetta</td><td>CTG Ltd., West Molesey, UK</td><td></td><td>Con bordo, 16 x 100 mm</td></tr><tr><td>Vit. B1</td><td>Wako</td><td>203-00851</td><td>AF-6 medio</td></tr><tr><td>Vit. B12</td><td>Wako</td><td>226-00343</td><td>AF-6 medio</td></tr><tr><td>B6</td><td>Wako</td><td>165-05401</td><td>AF-6 medio</td></tr><tr><td>ZnSO4&middot; 7H2O</td><td>Wako</td><td>264-00402</td><td>AF-6 medio</td></tr></tbody></table>

misurazione della fotofisiologia dello stadio collegato di colacium sp. da un fluorometro a velocità di ripetizione rapida di tipo cuvetta

Measuring Photophysiology of Attached Stage of Colacium sp. by a Cuvette-Type Fast Repetition Rate Fluorometer

Il fluorometro a velocità di ripetizione rapida (FRRf) è un metodo utile per misurare la fotofisiologia del fotosistema II (PSII) e la produttività primaria. Sebbene FRRf possa misurare la sezione trasversale di assorbimento PSII (σ PSII), la massima efficienza fotochimica (Fv / Fm), l'efficienza fotochimica efficace (Fq ′ / Fm′) e la tempra non fotochimica (NPQNSV) per varie alghe eucariotiche e cianobatteri, quasi tutti gli studi FRRf fino ad oggi si sono concentrati sul fitoplancton. Qui, il protocollo descrive come misurare la fotofisiologia PSII di un'alga epizoica Colacium sp. Ehrenberg 1834 (Euglenophyta), nel suo stadio annesso (attaccato allo zooplancton), usando FRRf di tipo cuvetta. In primo luogo, abbiamo stimato gli effetti dello zooplancton substrato (Scapholeberis mucronata O.F. Müller 1776, Cladocera, Daphniidae) sulla fluorescenza basale e σ PSII, Fv/Fm, Fq′/Fm′ e NPQNSV del planctonico Colacium sp. Per convalidare questa metodologia, abbiamo registrato misurazioni fotofisiologiche di Colacium sp. allegato su S. mucronata e confrontato questi risultati con il suo stadio planctonico. I risultati rappresentativi hanno mostrato come il protocollo potrebbe determinare gli effetti del calcio (Ca) e del manganese (Mn) sulla fotofisiologia di Colacium sp. e identificare i vari effetti dell'arricchimento di Mn tra stadi attaccati e planctonici. Infine, discutiamo l'adattabilità di questo protocollo ad altre alghe perifite.

Non vi è stato alcun effetto significativo della fluorescenza al basale (Figura 5) o della fluorescenza Chl-a (Figura 6) da parte di S. mucronata fino a 5 individui (inds.) mL−1. Tuttavia, Fv/Fm e NPQNSV sono stati significativamente colpiti quando S. mucronata era di 7,5 inds·mL−1. Pertanto, per misurare la fotofisiologia di Colacium sp. durante...

Il fluorometro a velocità di ripetizione rapida (FRRf) è un metodo utile per misurare la fotofisiologia del fotosistema II e la produttività primaria. Qui descriviamo un protocollo per misurare la fotofisiologia PSII dell'alga epizoica, Colacium sp. su substrato zooplancton utilizzando FRRf di tipo cuvetta.

Misurazione della fotofisiologia dello stadio collegato di Colacium sp. da un fluorometro a velocità di ripetizione rapida di tipo cuvetta

Fast repetition rate fluorometer (FRRf) is a beneficial method for measuring photosystem II (PSII) photophysiology and primary productivity. Although FRRf ...

Questo protocollo misura l'attività fotosintetica delle alghe attaccate, mentre si attaccano ancora al plancton, proprio come in natura. Il vantaggio principale di questa tecnica è che la misurazione della fotofisiologia può essere eseguita in tempo reale senza distrazioni del campione. Per esaminare gli effetti degli individui di zooplancton sulla fluorescenza basale, preparare scapholeberis mucronata adulto dalla coltura senza organismi attaccati.Ora affamare gli individui in FLW a 20 gradi Celsius per almeno 90 minuti per evitare la fluorescenza dal contenuto intestinale. Versare 1,5 millilitri di FWL in una cuvetta. Raccogli il numero desiderato di s.individui mucronata che usano una pipetta al microscopio ottico a 100 volte l'ingrandimento e li trasferiscono nella cuvetta. Aggiungere FLW per portare il volume del campione fino a 2 millilitri e consentirgli di acclimatarsi in condizioni di scarsa illuminazione a 20 gradi Celsius è per 15 minuti prima della misurazione del fluorometro a velocità di ripetizione rapida. Quindi fare clic su act to run"per avviare la misurazione e ripetere le misurazioni più di tre volte per campione.Leggete il valore F0 dal plottaggio risultante. R

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Piattaforme microfluidica gocce a base sono candidati promettenti per la sperimentazione ad alto rendimento in quanto sono in grado di generare picolitri, auto-compartimenti imbarcazioni a buon mercato a prezzi kHz. Attraverso l'integrazione con veloce, sensibile e ad alta risoluzione metodi di spettroscopia di fluorescenza, la grande quantità di informazioni generate all'interno di questi sistemi possono essere estratte in modo efficiente, sfruttato ed utilizzato.

Metodi di rilevamento a fluorescenza per piattaforme goccia microfluidica

Förster trasferimento di energia di risonanza (FRET) microscopia è una potente tecnica di monitoraggio in tempo reale degli eventi di segnalazione nelle cellule in diretta tramite biosensori vari giornalisti. Qui si descrive come costruire un epifluorescenza personalizzato FRET sistema di imaging da componenti disponibili in commercio e come usarlo per esperimenti FRET.

FRET Microscopia per Monitoraggio in tempo reale di segnalazione di eventi in cellule vive Uso Biosensori unimolecolare

Questo video dimostra la tecnica della spettroscopia di fluttuazione della fluorescenza (FFS) per studiare l'omo-oligomerizzazione delle proteine. Le proteine marcate in fluorescenza in un campione vengono dimerizzate utilizzando un agente quando si studia l'oligomerizzazione proteica mediante FFS. Utilizzando un microscopio confocale, mentre le proteine si muovono dentro e fuori dal piccolo volume di osservazione, viene eseguita l'analisi delle fluttuazioni della luminosità delle molecole...

Spettroscopia di fluttuazione della fluorescenza per studiare l'omo-oligomerizzazione delle proteine

Fonte: Kulkarni, M. et al. Imaging Ca2+ Dinamica nei terminali assonici dei fotorecettori dei coni della retina del topo. J. Vis. Exp. (2015)Questo video dimostra l'uso della microscopia a due fotoni per monitorare la dinamica del calcio nei fotorecettori dei coni di una retina di topo transgenico. Descrive i passaggi per la preparazione delle fette di retina, l'imaging di biosensori di calcio basati su FRET e l'analisi delle variazioni di fluorescenza per quantificare i livelli di calcio in...

Microscopia a due fotoni per il monitoraggio della dinamica del calcio nei fotorecettori dei coni retinici di topo

Misurare intracellulare Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Modifiche di sperma umano utilizzando quattro tecniche: fluorometria convenzionale, si fermò fluorometria Flow, Citometria a flusso singolo e l&#39;imaging cellulare

Attualmente, la maggior parte degli indicatori di calcio disponibili vengono utilizzati per quantificare i transitori citoplasmatici del calcio come misure indirette del calcio rilasciato dal reticolo sarcoplasmatico in cellule muscolari lisce in coltura. Questo protocollo descrive l'uso di uno specifico indicatore basato su FRET che consente la misurazione diretta dei segnali di calcio all'interno del lume del reticolo sarcoplasmatico.

Misura di fluttuazioni calcio all&#39;interno del reticolo sarcoplasmatico di coltura cellule muscolari lisce Uso FRET-based Imaging confocale

Nel cuore, eventi molecolari coordinare le funzioni elettriche e contrattili dell'organo. Un insieme di campo fluorescenza tecniche di microscopia locali qui presentati consente la registrazione di variabili cellulari nei cuori intatti. Identificare i meccanismi che definiscono la funzione cardiaca è fondamentale per capire come funziona il cuore in situazioni patologiche.

Campo locale microscopia a fluorescenza: Imaging segnali cellulari nei cuori Intact

Qui descriviamo l'acquisizione ottica e la caratterizzazione di potenziali d'azione da cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte utilizzando un sistema di fotometria modulare ad alta velocità.

Misurazione del potenziale d'azione ottico a singola cellula in cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte umane

Questo articolo presenta un metodo per l'analisi spaziotemporale di sonde mobili a singola molecola basate sul trasferimento di energia di risonanza di Förster (smFRET) utilizzando la microscopia a fluorescenza a campo largo. Il toolkit software di nuova concezione consente la determinazione delle tracce temporali smFRET delle sonde in movimento, compresa la corretta efficienza FRET e le posizioni molecolari, come funzioni del tempo.

Analisi spaziotemporale bidimensionale automatizzata di sonde FRET mobili a singola molecola

Il presente protocollo descrive l'imaging autofluorescenza passo-passo e la valutazione dei cambiamenti ficobiliproteici nelle alghe rosse sulla base dell'analisi spettrale. Questo è un metodo privo di etichette e non distruttivo per valutare l'adattamento cellulare ad habitat estremi, quando è disponibile solo materiale scarso e le cellule crescono lentamente, o per niente, in condizioni di laboratorio.

Autofluorescenza per valutare la fisiologia delle alghe rosse

Scopri come misurare la fotofisiologia di Colacium sp. attaccato a zooplancton utilizzando un fluorometro FRRf a cuvetta. Questo metodo permette analisi in tempo reale della fotosintesi algale in condizioni naturali.

Misurazione della fotofisiologia dello stadio collegato di Colacium sp. da un fluorometro a velocità di ripetizione rapida di tipo cuvetta (Video) | JoVE Journal

Misurazione della fotofisiologia dello stadio collegato di Colacium sp. da un fluorometro a velocità di ripetizione rapida di tipo cuvetta

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