Name: Un modello di abrasione epiteliale per lo studio della guarigione delle ferite corneali (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 45 s
Description: Impara un modello riproducibile di abrasione epiteliale corneale nei topi per studiare la guarigione delle ferite e l'infiammazione. Questa tecnica permette di valutare i meccanismi di riparazione tissutale in condizioni normali e patologiche.

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Finanziamento: Supportato da: NIH EY018239 (A.R.B., C.W.S. e R.E.R.), P30EY007551 (A.R.B.) e Sigma Xi Grant in Aid of Research (P.K.A.). Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresenta le opinioni ufficiali del National Institutes of Health o di Sigma Xi.

Tutti i protocolli sugli animali sono stati approvati dai comitati istituzionali per la cura e l'uso degli animali presso l'Università di Houston e il Baylor College of Medicine. Le linee guida delineate nella dichiarazione dell'Associazione per la ricerca in visione e oftalmologia (ARVO) sull'uso degli animali nella visione e nella ricerca oftalmica sono state seguite nella gestione e nell'uso dei topi.
1. Preparazione
<ol><li>Preparazione della soluzione di fluoresceina<ol>
<li>Preparare la soluzione di fluoresceina all'1% sciogliendo 10 mg di sale di fluoresceina sodica in 1 mL di soluzione salina sterile o sterile 1x soluzione salina tamponata con fosfato (PBS). NOTA: Preparare la soluzione di fluoresceina sodica il giorno dell'uso o un giorno prima per evitare la contaminazione microbica. Se preparato un giorno prima dell'uso, conservare la soluzione di fluoresceina a 4 °C al riparo dalla luce. Avvolgere i tubi con un foglio di alluminio per evitare il fotosbiancamento.</li>
		<li>Dividere la soluzione in aliquote adatte all'uso in un singolo esperimento. 1-1,5 μL di soluzione di fluoresceina viene utilizzato per topo per punto temporale. Utilizzare la seguente formula per calcolare il volume di aliquota appropriato per un singolo esperimento: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63112/63112eq01.jpg"> NOTA: Ad esempio, se sei topi vengono studiati in un singolo esperimento con la dimensione della ferita monitorata in cinque punti temporali, il volume di aliquota adatto per quel singolo esperimento sarebbe: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/63112/63112eq02.jpg">
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparazione di cocktail ketamina / xilazina per anestesia di topi.<ol>
<li>Per preparare 10 mL di cocktail, mescolare 2,0 mL di ketamina (100 mg/mL) con 1,0 mL di xilazina (20 mg/mL) e aggiungere 7,0 mL di PBS sterile. Preparare il cocktail ketamina / xilazina un giorno prima o il giorno dell'intervento. NOTA: tutte le soluzioni devono essere utilizzate a temperatura ambiente, salvo diversa indicazione.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Anestesia
<ol><li>Pesare il topo (topi C57BL/6 wildtype di 8-12 settimane) per determinare la quantità appropriata di anestetico da somministrare. Utilizzare la tecnica di ritenuta del mouse a due mani per trattenere e maneggiare i topi per l'iniezione dell'anestetico18. Somministrare ketamina/xilazina cocktail per via intraperitoneale (i.p.) ad una concentrazione finale di 80 mg/kg di ketamina e 8 mg/kg di xilazina.</li>
	<li>Attendere fino al raggiungimento dell'anestesia completa prima di eseguire ferite corneali sul topo. Valutare la profondità dell'anestesia valutando il riflesso del pedale dopo il pizzicamento delle dita dei piedi. Quando si ottiene un'anestesia adeguata, il mouse non deve muoversi sul pizzico della punta. NOTA: Poiché i topi perdono rapidamente calore corporeo durante l'anestesia, è importante fornire una fonte di calore per i topi per prevenire l'ipotermia. Posizionare i topi su una fonte di calore (piastra riscaldante) durante l'anestesia e le fasi di recupero.</li>
</ol>3. Creazione della ferita corneale
<ol><li>Ferire solo l'occhio destro o sinistro. Mantenere la coerenza con l'occhio (cioè sinistro o destro) che viene ferito quando si passa da un mouse all'altro. NOTA: Poiché le abrasioni danneggiano i nervi corneali e riducono l'acuità, ferire entrambi gli occhi può causare disagio e compromissione significativi. Poiché gli analgesici hanno il potenziale per sopprimere le risposte infiammatorie, il loro uso può essere un fattore confondente in alcuni esperimenti volti a comprendere l'infiammazione corneale. Evitare gli analgesici negli esperimenti sulle ferite corneali è stato approvato dal nostro Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali (IACUC).</li>
	<li>Per creare la ferita corneale epiteliale<ol>
<li>Sotto un microscopio di dissezione, utilizzare la trefina di 2 mm di diametro (vedi Figura 1) per delimitare il centro della cornea, tenendo l'occhio spalancato usando il pollice e l'indice per tenere le palpebre. Ruotare delicatamente la trefina per fare impressione sull'epitelio corneale. NOTA: Bisogna fare attenzione a non applicare una pressione eccessiva quando si utilizza la trefina in quanto ciò può causare perforazione corneale. Inoltre, bisogna fare attenzione a posizionare la trefina centralmente. Le pupille possono essere utilizzate come punto di riferimento per individuare il centro della cornea.</li>
		<li>Sotto un microscopio sezionante, tenere la mazza da golf smussata spud (vedi Figura 1) a circa 45 ° dalla superficie della cornea all'interno dell'area delimitata con la trefina. Raschiare con cura e continuamente l'epitelio all'interno dell'area delimitata con lo spud per sbrigliare l'epitelio. NOTA: Non applicare una forza eccessiva nello sbrigliamento in quanto ciò può anche causare perforazione corneale. Gli occhi dei topi possono asciugarsi durante il processo di ferita, rendendo difficile lo sbrigliamento. In tal caso, applicare PBS sterile sulla superficie oculare per mantenere un'idratazione ottimale.</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63112/63112fig01.jpg"> Figura 1: trefina da 2 mm e spud smussato della mazza da golf. La trefina viene utilizzata per delimitare una regione circolare al centro della cornea e lo spud della mazza da golf viene utilizzato per rimuovere l'epitelio all'interno della regione delimitata. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63112/63112fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
4. Monitoraggio della chiusura e della riepitelizzazione delle ferite
<ol><li>Pipettare 1-1,5 μL di soluzione di fluoresceina all'1% sulla superficie ferita e visualizzare la cornea utilizzando un microscopio digitale con una sorgente di luce blu.</li>
	<li>Acquisire immagini entro il primo minuto di aggiunta di soluzione di fluoresceina per evitare la diffusione all'epitelio circostante che porta a una sovrastima delle dimensioni della ferita. Le cornee ferite vengono fotografate in momenti specifici (cioè 0 h, 12 h, 18 h, 24 h e 30 h) dopo la ferita. NOTA: in tutti i momenti, l'imaging viene eseguito in anestesia; ketamina/xilazina viene utilizzato al momento della ferita mentre l'isoflurano viene utilizzato nei punti temporali successivi. I topi sono alloggiati individualmente in gabbie separate per la durata del monitoraggio della chiusura della ferita. Quando alloggiati insieme, i topi tendono a leccare gli occhi del cucciolato, un comportamento che ha dimostrato di influenzare la guarigione delle ferite in diversi tessuti19,20.</li>
	<li>Analizza le immagini catturate, tracciando l'area della ferita utilizzando un software di analisi delle immagini. L'area della ferita per ogni punto temporale è espressa come percentuale dell'area della ferita originale a 0 h.</li>
</ol>5. Imaging e analisi a immunofluorescenza
<ol><li>Eutanasia dei topi con un metodo approvato dalla IACUC (in questo caso, sovradosaggio di anidride carbonica seguito da lussazione cervicale) nei punti temporali desiderati dopo la ferita.</li>
	<li>Raccogli i bulbi oculari premendo delicatamente sul canto laterale per spostare il bulbo oculare usando la forbice curva dell'iride. Guidare le forbici dietro il bulbo oculare per afferrare saldamente il nervo ottico, quindi tagliare il nervo, che consente di rimuovere il bulbo oculare.</li>
	<li>Fissare ogni bulbo oculare in 1 mL di 1x PBS contenente il 2% di paraformaldeide per 1 ora a temperatura ambiente, quindi lavare tre volte in 1 mL di 1x PBS per 5 minuti ciascuno.</li>
	<li>Sotto un microscopio sezionante, utilizzare una lama chirurgica per fare un'incisione nella sclera, circa 500 μm distale al limbus, e quindi tagliare il globo. Usando la pinza, rimuovere delicatamente la materia dell'iride dalla cornea, quindi tagliare con cura il tessuto sclerale, assicurandosi di lasciare intatto il limbus.</li>
	<li>Effettuare quattro tagli radiali parziali, ciascuno di circa 1 mm di lunghezza, che si estendono dalla cornea periferica e si fermano a breve distanza dal centro per consentire alla cornea di appiattirsi.</li>
	<li>Permeabilizzare e bloccare le cornee in 1 mL di albumina sierica bovina al 2% (BSA) e 0,01% TritonX -100 in 1x PBS per 15 minuti, seguita dal blocco nel 2% di BSA in 1x PBS per ulteriori 45 minuti a temperatura ambiente.</li>
	<li>Incubare le cornee durante la notte a 4 °C in un cocktail di anticorpi coniugati con fluorocromo unico direttamente etichettati preparati in 1x PBS contenente il 2% di BSA. NOTA: gli anticorpi sono mirati a etichettare cellule e tessuti specifici di interesse. Ad esempio, endotelio, neutrofili e piastrine sono etichettati con anticorpi anti-CD3121,22, anti-Ly-6G 23,24 e anti-CD4125,26, rispettivamente. Il 4',6-diamidino-2-fenilide (DAPI) viene aggiunto al cocktail di anticorpi per visualizzare i nuclei.</li>
	<li>Dopo l'incubazione, lavare le cornee tre volte in 1x PBS per 15 minuti ciascuna.</li>
	<li>Montare le cornee su un vetrino del microscopio in una goccia di mezzo di montaggio a fluorescenza anti-dissolvenza, coprire con un coperchio e l'immagine con l'ingrandimento desiderato (obiettivo da 4x a 100x) utilizzando un microscopio a luce fluorescenza. Scatta immagini a tutto spessore della cornea in diverse regioni come illustrato nella Figura 2A. NOTA: Il modello di analisi microscopica illustrato nella Figura 2A viene utilizzato per analizzare specifici cambiamenti regionali nell'infiammazione e nella divisione cellulare. Sia la colorazione DAPI che Ly-6G vengono utilizzate per identificare i neutrofili extravascolari. Con la colorazione DAPI, i neutrofili sferici hanno un nucleo distinto a forma di ferro di cavallo o ciambella (Figura 2B).</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63112/63112fig02.jpg"> Figura 2: Strategia di imaging corneale e infiltrazione di neutrofili dopo abrasione centrale. (A) Rappresentazione schematica di una cornea integrale che mostra nove campi microscopici attraverso il diametro della cornea. L'area grigia rappresenta l'area della ferita originale. La larghezza di ogni regione è di 500 μm. (B) Si noti la distinta forma a ferro di cavallo o ciambella dei nuclei neutrofili con colorazione DAPI. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63112/63112fig02large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Lo scopo di questo documento di metodi era quello di descrivere un protocollo per la creazione di una ferita da abrasione epiteliale corneale centrale nel topo usando una trefina e uno spud smussato della mazza da golf. Questo modello murino è stato utilizzato per studiare l'infiammazione corneale e il suo contributo alla guarigione delle ferite. Questo tipo di modello può essere utilizzato per studiare i meccanismi di guarigione delle ferite corneali in condizioni fisiologiche normali e in patologie</s...

La cornea è il trasparente anteriore un terzo dell'occhio. La cornea svolge diverse funzioni tra cui la protezione delle strutture interne dell'occhio e la formazione di una barriera strutturale che protegge l'occhio dalle infezioni1. Ancora più importante, la cornea è fondamentale per la visione, fornendo circa i due terzi del potere di rifrazione dell'occhio 2,3. Cruciale per il ruolo della cornea nella visione è la sua trasparenza. Tuttavia, a causa della sua posizione verso l'esterno, la cornea è esposta a un'ampia varietà di lesioni su base giornaliera che possono portare all'interruzione della sua funzione di barriera, perdita di trasparenza ed eventuale cecità. La perdita di trasparenza corneale è una delle principali cause di disabilità visiva in tutto il mondo 4,5. Le abrasioni corneali sono un motivo comune per le visite al pronto soccorso (ER), rappresentando la metà dei casi correlati agli occhi presentati al ER6. Si stima che oltre 1 milione di persone soffrano di lesioni oculari ogni anno negli Stati Uniti7. Un'efficiente guarigione delle ferite corneali in risposta a queste lesioni è fondamentale per mantenere l'omeostasi corneale e preservare la sua trasparenza e le sue capacità di rifrazione. In caso di compromissione della guarigione delle ferite corneali, la cornea diventa vulnerabile a infezioni, ulcerazioni e cicatrici 8,9. Inoltre, la crescente popolarità degli interventi chirurgici refrattivi pone una sfida traumatica unica sulla cornea10. Data l'importanza fondamentale della guarigione delle ferite corneali per la conservazione della trasparenza e della visione corneale, una migliore comprensione del normale processo di guarigione delle ferite corneali è un prerequisito per comprendere la compromissione della guarigione delle ferite corneali associata a infezioni e malattie.
A tal fine, sono stati sviluppati diversi modelli animali di guarigione delle ferite corneali 11,12,13,14,15. I modelli murini di guarigione delle ferite corneali si sono dimostrati utili per promuovere la nostra comprensione dei meccanismi di guarigione delle ferite corneali che operano in normali condizioni fisiologiche. Diversi tipi di ferite corneali sono stati impiegati nello studio della guarigione delle ferite corneali, ognuno adatto per indagare diversi aspetti del processo di guarigione delle ferite. I tipi più comuni di modelli di ferite utilizzati negli studi di guarigione delle ferite corneali sono i modelli di ferite meccaniche e chimiche. Le ferite corneali chimiche, che coinvolgono principalmente la creazione di ustioni alcaline sulla cornea, sono utili per studiare le ulcere corneali, l'opacizzazione e la neovascolarizzazione13. Le ferite corneali meccaniche comportano ferite da debridement (abrasione) e ferite da cheratectomia 14,15,16. Una membrana basale epiteliale corneale intatta o violata definisce rispettivamente le ferite da debridement e cheratectomia. Nelle ferite da debridement, la membrana basale epiteliale rimane intatta, mentre nelle ferite da cheratectomia, la membrana basale viene violata con la penetrazione principalmente nello stroma anteriore. Le ferite da debridement sono più utili per studiare la riepitelizzazione, la proliferazione delle cellule epiteliali, la risposta immunitaria e la rigenerazione nervosa dopo la ferita corneale. Le ferite da cheratectomia, d'altra parte, sono più utili per studiare le cicatrici corneali14,15.
Qui, viene descritto un protocollo per la creazione di una ferita da abrasione epiteliale corneale centrale nel topo usando una trefina e uno spud smussato della mazza da golf. Questo semplice modello di guarigione delle ferite corneali è altamente riproducibile e ben pubblicato e viene ora utilizzato per valutare la guarigione delle ferite corneali compromesse nel contesto della malattia17.

<table><tbody><tr><td>Anticorpo anti-CD31</td><td>BD Bioscience, Pharmingen</td><td>550274</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-CD41</td><td>BD Bioscience, Pharmingen</td><td>553847</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo Anti-Ly6G</td><td>BD Bioscience, Pharmingen</td><td>551459</td><td></td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina (BSA)</td><td>ThermoFisher scientific</td><td>B14</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6 topi</td><td>Jackson Laboratories</td><td>664</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8417</td><td></td></tr><tr><td>DeltaVision Microscopio a fluorescenza con deconvoluzione ad ampio campo</td><td>GE Life Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio da dissezione</td><td>Leica microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bilance elettroniche a caricamento dall'alto (bilancia)</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>ThermoFisher</td><td>scientific T038181000CS</td><td></td></tr><tr><td>Spud per mazze da golf</td><td>Stephens instruments</td><td>S2-1135</td><td></td></tr><tr><td>Forbici per curva dell'iride</td><td>Fisher Scientific</td><td>31212</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Patterson veterinario</td><td>07-893-1389</td><td></td></tr><tr><td>Ketamina</td><td>Patterson veterinario</td><td>07-890-8598</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)</td><td>ThermoFisher scientific</td><td>AM9624</td><td></td></tr><tr><td>Sale di fluoresceina di sodio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>46970</td><td></td></tr><tr><td>Lama chirurgica (lama scapel)</td> <td>Strumenti per le scienze</td><td>10022-00</td><td></td></tr><tr><td>Trephine</td><td>Integra Miltex</td><td>33-31</td><td></td></tr><tr><td>TritonX -100</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-295-34</td><td></td></tr><tr><td>Forcipe</td><td>Strumenti per le scienze</td><td>11923-13</td><td></td></tr><tr><td>Xilazina</td><td>Patterson veterinario</td><td>07-808-1947</td><td></td></tr></tbody></table>

un modello di abrasione epiteliale per lo studio della guarigione delle ferite corneali

An Epithelial Abrasion Model for Studying Corneal Wound Healing

La cornea è fondamentale per la visione, rappresentando circa i due terzi del potere rifrattivo dell'occhio. Cruciale per il ruolo della cornea nella visione è la sua trasparenza. Tuttavia, a causa della sua posizione esterna, la cornea è altamente suscettibile a un'ampia varietà di lesioni che possono portare alla perdita di trasparenza corneale e all'eventuale cecità. Un'efficiente guarigione delle ferite corneali in risposta a queste lesioni è fondamentale per mantenere l'omeostasi corneale e la conservazione della trasparenza corneale e delle capacità di rifrazione. In caso di compromissione della guarigione delle ferite corneali, la cornea diventa vulnerabile a infezioni, ulcerazioni e cicatrici. Data l'importanza fondamentale della guarigione delle ferite corneali per la conservazione della trasparenza e della visione corneale, una migliore comprensione del normale processo di guarigione delle ferite corneali è un prerequisito per comprendere la compromissione della guarigione delle ferite corneali associata a infezioni e malattie. Verso questo obiettivo, i modelli murini di ferite corneali si sono dimostrati utili per promuovere la nostra comprensione dei meccanismi di guarigione delle ferite corneali che operano in condizioni fisiologiche normali. Qui, viene descritto un protocollo per la creazione di un'abrasione epiteliale corneale centrale nel topo usando una trefina e uno spud smussato della mazza da golf. In questo modello, una trefina circolare di 2 mm di diametro, centrata sulla cornea, viene utilizzata per delimitare l'area della ferita. Lo spud della mazza da golf viene utilizzato con cura per sbrigliare l'epitelio e creare una ferita circolare senza danneggiare la membrana basale epiteliale corneale. La risposta infiammatoria risultante procede come una cascata ben caratterizzata di eventi cellulari e molecolari che sono fondamentali per una guarigione efficiente delle ferite. Questo semplice modello di guarigione delle ferite corneali è altamente riproducibile e ben pubblicato e viene ora utilizzato per valutare la guarigione delle ferite corneali compromesse nel contesto della malattia.

La Figura 3 mostra una micrografia elettronica a trasmissione di una ferita corneale creata con lo spud smussato della mazza da golf, dimostrando che la membrana basale epiteliale è effettivamente intatta dopo la lesione.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63112/63112fig03.jpg"> Figura 3: La membrana basale epiteliale rimane intatta dopo l'abrasione corneale. </strong...

Qui, viene descritto un protocollo per la creazione di una ferita da abrasione epiteliale corneale centrale nel topo usando una trefina e uno spud smussato della mazza da golf. Questo modello di guarigione delle ferite corneali è altamente riproducibile e viene ora utilizzato per valutare la guarigione delle ferite corneali compromesse nel contesto delle malattie.

Un modello di abrasione epiteliale per lo studio della guarigione delle ferite corneali

The cornea is critical for vision, accounting for about two-thirds of the refractive power of the eye. Crucial to the role of the cornea in vision is its ...

Questo protocollo è significativo perché è un ottimo modello per studiare l'infiammazione corneale e il suo contributo alla guarigione delle ferite in condizioni normali e patologiche. Il vantaggio principale di questa tecnica è che crea una ferita epiteliale precisa e riproducibile senza rompere la membrana basale. Questo modello di ferita corneale è semplice e veloce da eseguire.A dimostrare la procedura sarà il principe Akowuah, uno studente di dottorato del mio laboratorio. Per iniziare, preparare una soluzione di fluoresceina all'1% sciogliendo 10 milligrammi di sale di fluoresceina di sodio in un millilitro di soluzione salina sterile o PBS. Successivamente, per l'anestesia, preparare 10 millilitri di un cocktail ketamina-xilazina mescolando due millilitri di ketamina, un millilitro di xilazina e sette millilitri di PBS sterile.Dopo aver anestetizzato un topo C57 black 6 wild-type di 8-12 settimane, valuta la profondità dell'anestesia valutando il riflesso del pedale dopo il pizzicamento delle dita dei piedi. Per creare la ferita corneale epiteliale, posizionare il topo anestetizzato sotto un microscopio di dissezione. Ferire solo l'occhio destro o sinistro e mantenere la coerenza con l'occhio ferito quando si passa dal mouse al mouse.Tenere l'occhio spalancato tenendo le palpebre con il pollice e l'indice. Quindi, usando una trefina sterile di due millimetri di diametro, delimitare il centro della cornea e far roteare delicatamente la trefina per fare un'impressione sull'epitelio corneale. Non applicare una pressione eccessiva, in quanto ciò può causare perforazione corneale.Successivamente, tenendo lo spud sterile smussato della mazza da golf con un angolo di circa 45 gradi dalla superficie della cornea, sbrigliare l'epitelio raschiando attentamente e continuamente all'interno dell'area delimitata utilizzando lo spud. Non applicare una forza eccessiva e mantenere l'idratazione utilizzando PBS sterile, se necessario. Per il monitoraggio della chiusura e della riepitelizzazione della ferita, pipettare da 1 a 1,5 microlitri di soluzione di fluoresceina all'1% sulla superficie ferita e visualizzare la cornea utilizzando un microscopio digitale con una sorgente di luce blu.Immagina la cornea ferita in momenti specifici dopo la ferita. Scatta immagini entro il primo minuto di aggiunta di soluzione di fluoresceina per evitare la diffusione della soluzione all'epitelio circostante, che può portare a una sovrastima delle dimensioni della ferita. Successivamente, utilizzando un software di analisi delle immagini, tracciare l'area della ferita ed esprimere l'area della ferita in ogni punto temporale come percentuale dell'area della ferita originale all'ora zero.Una micrografia elettronica a trasmissione della ferita corneale dimostra che la membrana basale dell'epitelio rimane intatta anche dopo la lesione. Nei topi selvatici di 8-12 settimane, la chiusura della ferita è completa 24 ore dopo la ferita. La risposta infiammatoria alla ferita è caratterizzata dall'imaging cellulare al limbus.Qui è mostrata la vascolarizzazione limbare di una cornea non avvolta con neutrofili extra-vascolari e quella di una cornea ferita con piastrine extravascolari e neutrofili 30 ore dopo l'abrasione. Per riprodurre correttamente questo protocollo, è necessario utilizzare lo stesso ceppo in ogni intervallo di mouse e le dimensioni e la profondità della ferita devono essere create come descritto.

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