Name: Estrazione euristica di genotipi gerarchici e loci genomici accessori in popolazioni batteriche (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-07T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 3 s
Description: Scopri l'analisi genomica batterica su larga scala con ProkEvo, mappando genotipi gerarchici e loci accessori. Questo protocollo automatizzato supporta la sorveglianza epidemiologica in tempo reale.

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Questo lavoro è stato sostenuto da finanziamenti forniti dalla Divisione di ricerca agricola UNL-IANR e dall'Istituto nazionale per la ricerca e l'istruzione sulla resistenza antimicrobica e dal Nebraska Food for Health Center presso il Dipartimento di scienza e tecnologia alimentare (UNL). Questa ricerca potrebbe essere completata solo utilizzando l'Holland Computing Center (HCC) dell'UNL, che riceve il sostegno della Nebraska Research Initiative. Siamo anche grati di avere accesso, attraverso l'HCC, alle risorse fornite dall'Open Science Grid (OSG), che è supportato dalla National Science Foundation e dall'Office of Science del Dipartimento dell'Energia degli Stati Uniti. Questo lavoro ha utilizzato il software di gestione del flusso di lavoro Pegasus che è finanziato dalla National Science Foundation (sovvenzione n. 1664162).

Gli autori hanno dichiarato che non esistono interessi concorrenti.

L'utilizzo di un'analisi euristica e gerarchica della struttura della popolazione basata su sistemi fornisce un quadro per identificare nuove firme genomiche in set di dati batterici che hanno il potenziale per spiegare modelli ecologici ed epidemiologici unici20. Inoltre, la mappatura dei dati del genoma accessorio sulla struttura della popolazione può essere utilizzata per dedurre tratti ancestrali acquisiti e / o di derivazione recente che facilitano la diffusione di lignaggi ST o varianti cgML...

Il crescente uso del sequenziamento dell'intero genoma batterico (WGS) come base per la sorveglianza di routine e l'indagine epidemiologica da parte dei laboratori di sanità pubblica e delle agenzie di regolamentazione ha sostanzialmente migliorato le indagini sui focolai di patogeni 1,2,3,4. Di conseguenza, grandi volumi di dati WGS de-identificati sono ora disponibili al pubblico e possono essere utilizzati per studiare aspetti della biologia della popolazione di specie patogene su una scala senza precedenti, compresi studi basati su: strutture di popolazione, frequenze di genotipo e frequenze geniche / alleliche in più serbatoi, regioni geografiche e tipi di ambienti5 . Le indagini epidemiologiche guidate dal WGS più comunemente utilizzate si basano su analisi che utilizzano solo il contenuto genomico di base condiviso, in cui il contenuto condiviso (conservato) da solo viene utilizzato per la classificazione genotipica (ad esempio, la chiamata delle varianti) e queste varianti diventano la base per l'analisi epidemiologica e il tracciamento 1,2,6,7 . Tipicamente, la genotipizzazione basata sul genoma del nucleo batterico viene effettuata con approcci MLST (Multi-locus sequence typing) utilizzando da sette a poche migliaia di loci 8,9,10. Queste strategie basate su MLST comprendono la mappatura di sequenze genomiche preassemblate o assemblate su database altamente curati, combinando così le informazioni alleliche in unità genotipiche riproducibili per l'analisi epidemiologica ed ecologica11,12. Ad esempio, questa classificazione basata su MLST può generare informazioni genotipiche a due livelli di risoluzione: tipi di sequenza di livello inferiore (ST) o lignaggi ST (7 loci) e varianti MLST (cgMLST) del genoma centrale di livello superiore (~ 300-3.000 loci)10.
La classificazione genotipica basata su MLST è computazionalmente portatile e altamente riproducibile tra i laboratori, rendendola ampiamente accettata come un approccio accurato di sottostimolazione al di sotto del livello13,14 delle specie batteriche. Tuttavia, le popolazioni batteriche sono strutturate con vari gradi di clonalità specie-specifici (cioè omogeneità genotipica), modelli complessi di parentela gerarchica tra genotipi 15,16,17 e un'ampia gamma di variazioni nella distribuzione del contenuto genomico accessorio18,19 . Pertanto, un approccio più olistico va oltre le classificazioni discrete nei genotipi MLST e incorpora le relazioni gerarchiche dei genotipi a diverse scale di risoluzione, insieme alla mappatura del contenuto genomico accessorio su classificazioni genotipiche, che facilita l'inferenza basata sulla popolazione 18,20,21 . Inoltre, le analisi possono anche concentrarsi su modelli condivisi di ereditarietà di loci genomici accessori tra genotipi anche lontanamente correlati21,22. Nel complesso, l'approccio combinato consente un'interrogazione agnostica delle relazioni tra la struttura della popolazione e la distribuzione di specifiche composizioni genomiche (ad esempio, loci) tra gradienti geospaziali o ambientali. Un tale approccio può fornire informazioni sia fondamentali che pratiche sulle caratteristiche ecologiche di popolazioni specifiche che possono, a loro volta, spiegare il loro tropismo e i modelli di dispersione tra i bacini idrici, come gli animali alimentari o gli esseri umani.
Questo approccio gerarchico orientato alla popolazione basato su sistemi richiede grandi volumi di dati WGS per una potenza statistica sufficiente a prevedere firme genomiche distinguibili. Di conseguenza, l'approccio richiede una piattaforma computazionale in grado di elaborare molte migliaia di genomi batterici contemporaneamente. Recentemente, ProkEvo è stato sviluppato ed è una piattaforma bioinformatica liberamente disponibile, automatizzata, portatile e scalabile che consente analisi integrative della popolazione batterica basate su gerarchia, inclusa la mappatura pan-genomica20. ProkEvo consente lo studio di set di dati batterici su scala da moderata a grande, fornendo al contempo un quadro per generare ipotesi epidemiologiche ed ecologiche verificabili e deducibili e previsioni fenotipiche che possono essere personalizzate dall'utente. Questo lavoro integra questa pipeline nel fornire una guida su come utilizzare i file di output derivati da ProkEvo come input per l'analisi e l'interpretazione delle classificazioni gerarchiche della popolazione e dell'estrazione genomica accessoria. Il caso di studio qui presentato ha utilizzato la popolazione di Salmonella enterica lignaggio I sierotipo zoonotico S. Newport come esempio ed era specificamente finalizzato a fornire linee guida pratiche per microbiologi, ecologi ed epidemiologi su come: i) utilizzare un approccio automatizzato filogenesi-dipendente per mappare genotipi gerarchici; ii) valutare la distribuzione in frequenza dei genotipi come proxy per valutare l'idoneità ecologica; iii) determinare i gradi di clonalità specifici del lignaggio utilizzando approcci statistici indipendenti; e iv) mappare i loci AMR differenzianti il lignaggio come esempio di come estrarre il contenuto genomico accessorio nel contesto della struttura della popolazione. Più in generale, questo approccio analitico fornisce un quadro generalizzabile per eseguire un'analisi genomica basata sulla popolazione su una scala che può essere utilizzata per dedurre modelli evolutivi ed ecologici indipendentemente dalla specie bersaglio.

<table><tbody><tr><td></td><td></td><td></td> amr_data_filtered <td>https://figshare.com/account/projects/116625/articles/14829225?file=28758762</td></tr><tr><td>amr_data_raw</td><td></td><td></td><td>https://figshare.com/account/projects/116625/articles/14829225?file=28547994</td></tr><tr><td>baps_output</td><td></td><td></td><td>https://figshare.com/account/projects/116625/articles/14829225?file=28548003</td></tr><tr><td>filogenesi del genoma centrale</td><td></td><td></td><td>https://figshare.com/account/projects/116625/articles/14829225?file=28548006</td></tr><tr><td>genome_sra</td><td></td><td></td><td>https://figshare.com/account/projects/116625/articles/14829225?file=28639209</td></tr><tr><td>Linux, Mac o PC</td><td></td><td></td><td>qualsiasi piattaforma ad alte prestazioni</td></tr><tr><td>mlst_output</td><td></td><td></td><td>https://figshare.com/account/projects/116625/articles/14829225?file=28547997</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> sistr_output <td>https://figshare.com/account/projects/116625/articles/14829225?file=28548000</td></tr><tr><td>sono necessarie le credenziali figshare per l'accesso e l'accesso ai file</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

estrazione euristica di genotipi gerarchici e loci genomici accessori in popolazioni batteriche

Heuristic Mining of Hierarchical Genotypes and Accessory Genome Loci in Bacterial Populations

L'uso sistematico e sistematico del sequenziamento dell'intero genoma batterico (WGS) sta migliorando l'accuratezza e la risoluzione delle indagini epidemiologiche condotte dai laboratori di sanità pubblica e dalle agenzie di regolamentazione. Grandi volumi di dati WGS disponibili pubblicamente possono essere utilizzati per studiare le popolazioni patogene su larga scala. Recentemente, è stata pubblicata una piattaforma computazionale liberamente disponibile chiamata ProkEvo per consentire analisi genomiche di popolazione riproducibili, automatizzate e scalabili basate su gerarchia utilizzando dati WGS batterici. Questa implementazione di ProkEvo ha dimostrato l'importanza di combinare la mappatura genotipica standard delle popolazioni con l'estrazione di contenuti genomici accessori per l'inferenza ecologica. In particolare, il lavoro qui evidenziato ha utilizzato output derivati da ProkEvo per analisi gerarchiche su scala di popolazione utilizzando il linguaggio di programmazione R. L'obiettivo principale era quello di fornire una guida pratica per microbiologi, ecologi ed epidemiologi mostrando come: i) utilizzare una mappatura filogenica dei genotipi gerarchici; ii) valutare le distribuzioni di frequenza dei genotipi come proxy per l'idoneità ecologica; iii) determinare le relazioni di parentela e la diversità genetica utilizzando specifiche classificazioni genotipiche; e iv) mappare il lignaggio differenziando i loci accessori. Per migliorare la riproducibilità e la portabilità, sono stati utilizzati file di markdown R per dimostrare l'intero approccio analitico. Il set di dati di esempio conteneva dati genomici da 2.365 isolati del patogeno zoonotico di origine alimentare Salmonella Newport. La mappatura ancorata alla filogenesi dei genotipi gerarchici (Serovar -> BAPS1 -> ST -> cgMLST) ha rivelato la struttura genetica della popolazione, evidenziando i tipi di sequenza (ST) come genotipo differenziante chiave di volta. Attraverso i tre lignaggi più dominanti, ST5 e ST118 hanno condiviso un antenato comune più recentemente che con il filotipo ST45 altamente clonale. Le differenze basate sulla ST sono state ulteriormente evidenziate dalla distribuzione dei loci di resistenza antimicrobica accessoria (AMR). Infine, è stata utilizzata una visualizzazione ancorata alla filogenesi per combinare genotipi gerarchici e contenuto AMR per rivelare la struttura della parentela e le firme genomiche specifiche del lignaggio. Combinato, questo approccio analitico fornisce alcune linee guida per condurre analisi genomiche euristiche della popolazione batterica utilizzando informazioni pan-genomiche.

Utilizzando la piattaforma computazionale ProkEvo per le analisi genomiche di popolazione, il primo passo nel data mining WGS batterico consiste nell'esaminare la struttura gerarchica della popolazione nel contesto di una filogenesi nucleo-genoma (Figura 1). Nel caso di S. enterica lignaggio I, come esemplificato dalla S. Set di dati newport, la popolazione è strutturata gerarchicamente come segue: sierotipo (livello più basso di risoluzione), sottogruppi o aploti...

Questa piattaforma computazionale analitica fornisce una guida pratica per microbiologi, ecologi ed epidemiologi interessati alla genomica delle popolazioni batteriche. Nello specifico, il lavoro qui presentato ha dimostrato come eseguire: i) mappatura filogenetica di genotipi gerarchici; ii) analisi dei genotipi basata sulla frequenza; iii) analisi di parentela e clonalità; iv) identificazione del lignaggio differenziando i loci accessori.

Estrazione euristica di genotipi gerarchici e loci genomici accessori in popolazioni batteriche

Routine and systematic use of bacterial whole-genome sequencing (WGS) is enhancing the accuracy and resolution of epidemiological investigations carried ...

Questo protocollo analitico consente lo studio di popolazioni patogene di batteri, su larga scala. Questo è molto importante perché migliora il modo in cui le indagini ecologiche ed epidemiologiche possono essere fatte. Ma perché ciò accada, ciò di cui abbiamo bisogno è uno strumento automatizzato e scalabile, o una piattaforma computazionale che consenta di analizzare contemporaneamente molte migliaia di sequenze genomiche.ProkEvo si adatta a quella nicchia e consente di eseguire analisi pratiche della popolazione batterica su larga scala, mappando il contenuto pan-genomico, che esamina i genotipi e le caratteristiche uniche di quei genotipi per l'indagine ecologica ed epidemiologica. Il vantaggio principale di questo protocollo è l'utilizzo di piattaforme computazionali potenti, automatizzate e scalabili, come ProkEvo per eseguire l'estrazione euristica di genotipi gerarchici nelle popolazioni batteriche. Il protocollo analitico qui presentato oggi ha diverse implicazioni pratiche.Uno di questi è quello di facilitare la diagnostica nel senso che consentirebbe di mappare e tracciare i genotipi batterici in tempo reale, in modo scalabile, il che consente di discernere e definire i lignaggi patogeni dei patogeni per tracciare e mappare tali agenti patogeni in diversi contesti. Un'altra applicazione è quella di migliorare la sorveglianza di routine dei laboratori di sanità pubblica e delle agenzie di regolamentazione, che viene fatto per facilitare il tracciamento degli agenti patogeni in diversi contesti commerciali. Il protocollo qui presentato fornisce una guida pratica per microbiologi, ecologi, epidemiologi e chiunque sia interessato alla genomica delle popolazioni batteriche.ProkEvo è una piattaforma open source e disponibile pubblicamente e la sua pagina GitHub fornisce istruzioni dettagliate per l'uso. Il protocollo spiegato qui può essere trovato anche su GitHub. Con le istruzioni fornite, vogliamo rendere ProkEvo e questo protocollo facili da usare ed essere utilizzati da ricercatori principianti e avanzati.Inizia a condurre le analisi usando l'albero di Gigi per tracciare un albero filogenetico insieme a informazioni genotipiche. Per fare ciò, ottimizza la dimensione della figura dell'albero Gigi, incluso il diametro e la larghezza degli anelli modificando i valori numerici all'interno della mappa di calore x-lim e G. Quando si tracciano più livelli di dati con l'albero filogenetico, aggregare tutti i metadati nel minor numero possibile di categorie per facilitare la scelta del pannello da colorare.Condurre l'aggregazione dei dati in base alla questione dell'interesse e della conoscenza del dominio. Una volta fatto, usa un grafico a barre per valutare le frequenze relative aggregando i dati per il tipo di sequenza o i lignaggi ST e la tipizzazione della sequenza multilocus del genoma del nucleo o le varianti cgMLST per facilitare le visualizzazioni. Scegli una soglia empirica o statistica utilizzata per l'aggregazione dei dati.Il codice di esempio può essere utilizzato per ispezionare la distribuzione di frequenza dei lignaggi ST e determinare il cutoff. Il codice di esempio mostra come vengono aggregati gli ST minori o a bassa frequenza. Gli ST che non sono numerati possono essere raggruppati come altri ST.Utilizzare un codice simile per le varianti cgMLST. Utilizzare l'approccio nidificato per calcolare la proporzione di ciascun lignaggio ST all'interno di ciascun sottogruppo BAPS1 per identificare gli ST che appartengono allo stesso sottogruppo BAPS1. Il codice esemplifica come la proporzione basata su ST può essere calcolata tra i sottogruppi BAPS1.Per tracciare la distribuzione della resistenza antimicrobica o dei loci AMR tra i lignaggi ST, utilizzare una soglia empirica o statistica per filtrare i loci AMR più importanti per facilitare le visualizzazioni. Fornire un raw. csv contenente le proporzioni calcolate di tutti i loci AMR su tutti i lignaggi ST.Quindi calcolare la proporzione AMR per ciascun ST utilizzando il codice. Dopo aver eseguito i calcoli per tutti gli ST, combinare i set di dati in un unico frame di dati utilizzando il codice e quindi esportare il file CSV contenente le proporzioni calcolate con il codice. Prima di tracciare la distribuzione basata su AMR tra i lignaggi ST, filtrare i dati in base a una soglia per facilitare le visualizzazioni.Successivamente, traccia la filogenesi del genoma di base insieme alle classificazioni genotipiche gerarchiche nei dati AMR in un singolo grafico usando l'albero di Gigi. Quindi ottimizzare la dimensione della figura all'interno dell'albero Gigi utilizzando i parametri menzionati in precedenza. Ottimizzare le visualizzazioni aggregando le variabili o utilizzando la classificazione binaria, ad esempio la presenza o l'assenza del gene.È stata esaminata la struttura gerarchica della popolazione del lignaggio Salmonella enterica uno nel contesto di una filogenesi del genoma di base. Le frequenze relative di tutti i genotipi gerarchici sono state quindi utilizzate per valutare la distribuzione complessiva e le classificazioni più frequentemente osservate. I lignaggi ST meno frequenti sono stati aggregati come altri ST per facilitare la visualizzazione dei dati.Allo stesso modo, le varianti cgMLST meno frequenti sono state aggregate come altre cgMLST. Le relazioni ancestrali tra gli ST sono state esaminate utilizzando un approccio nidificato valutando la frequenza relativa dei lignaggi ST da parte dei sottogruppi o aplotipi BAPS1. La frequenza relativa dei loci AMR differenzianti del lignaggio ST è stata valutata per identificare firme genomiche accessorie uniche legate alla struttura della popolazione di Newport sierovara.Nei risultati, i loci MDFA e AAC6IAA sembravano essere ancestralmente acquisiti dalla popolazione sierovara di Newport, mentre si prevede che ST45 sia multi-farmaco resistente. Rispetto all'ST45, gli altri principali lignaggi ST, come ST5 e ST118, hanno maggiori probabilità di essere suscettibili a più farmaci. Inoltre, è stata utilizzata una visualizzazione ancorata alla filogenesi per integrare sistematicamente i dati della struttura gerarchica della popolazione.Questo protocollo analitico presenta una base per il data mining di popolazioni batteriche su larga scala. Ciò che consente è che i genotipi siano mappati e tracciati su larga scala utilizzando ProkEvo, ma può anche essere ampliato per rispondere ad altre domande, come esplorare la distribuzione delle vie metaboliche e dei fattori di virulenza associati alle informazioni genotipiche. Cioè, possiamo prevedere i fenotipi associati a specifici genotipi di interesse.Il protocollo qui descritto apre sicuramente la strada ai ricercatori per esplorare nuove domande nel campo della genomica delle popolazioni e dedurre modelli evolutivi ed ecologici per specie batteriche patogene e non patogene.

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