Estrazione euristica di genotipi gerarchici e loci genomici accessori in popolazioni batteriche
7 dicembre 2021
Questa piattaforma computazionale analitica fornisce una guida pratica per microbiologi, ecologi ed epidemiologi interessati alla genomica delle popolazioni batteriche. Nello specifico, il lavoro qui presentato ha dimostrato come eseguire: i) mappatura filogenetica di genotipi gerarchici; ii) analisi dei genotipi basata sulla frequenza; iii) analisi di parentela e clonalità; iv) identificazione del lignaggio differenziando i loci accessori.
Questo protocollo analitico consente lo studio di popolazioni patogene di batteri, su larga scala. Questo è molto importante perché migliora il modo in cui le indagini ecologiche ed epidemiologiche possono essere fatte. Ma perché ciò accada, ciò di cui abbiamo bisogno è uno strumento automatizzato e scalabile, o una piattaforma computazionale che consenta di analizzare contemporaneamente molte migliaia di sequenze genomiche.
ProkEvo si adatta a quella nicchia e consente di eseguire analisi pratiche della popolazione batterica su larga scala, mappando il contenuto pan-genomico, che esamina i genotipi e le caratteristiche uniche di quei genotipi per l'indagine ecologica ed epidemiologica. Il vantaggio principale di questo protocollo è l'utilizzo di piattaforme computazionali potenti, automatizzate e scalabili, come ProkEvo per eseguire l'estrazione euristica di genotipi gerarchici nelle popolazioni batteriche. Il protocollo analitico qui presentato oggi ha diverse implicazioni pratiche.
Uno di questi è quello di facilitare la diagnostica nel senso che consentirebbe di mappare e tracciare i genotipi batterici in tempo reale, in modo scalabile, il che consente di discernere e definire i lignaggi patogeni dei patogeni per tracciare e mappare tali agenti patogeni in diversi contesti. Un'altra applicazione è quella di migliorare la sorveglianza di routine dei laboratori di sanità pubblica e delle agenzie di regolamentazione, che viene fatto per facilitare il tracciamento degli agenti patogeni in diversi contesti commerciali. Il protocollo qui presentato fornisce una guida pratica per microbiologi, ecologi, epidemiologi e chiunque sia interessato alla genomica delle popolazioni batteriche.
ProkEvo è una piattaforma open source e disponibile pubblicamente e la sua pagina GitHub fornisce istruzioni dettagliate per l'uso. Il protocollo spiegato qui può essere trovato anche su GitHub. Con le istruzioni fornite, vogliamo rendere ProkEvo e questo protocollo facili da usare ed essere utilizzati da ricercatori principianti e avanzati.
Inizia a condurre le analisi usando l'albero di Gigi per tracciare un albero filogenetico insieme a informazioni genotipiche. Per fare ciò, ottimizza la dimensione della figura dell'albero Gigi, incluso il diametro e la larghezza degli anelli modificando i valori numerici all'interno della mappa di calore x-lim e G. Quando si tracciano più livelli di dati con l'albero filogenetico, aggregare tutti i metadati nel minor numero possibile di categorie per facilitare la scelta del pannello da colorare.
Condurre l'aggregazione dei dati in base alla questione dell'interesse e della conoscenza del dominio. Una volta fatto, usa un grafico a barre per valutare le frequenze relative aggregando i dati per il tipo di sequenza o i lignaggi ST e la tipizzazione della sequenza multilocus del genoma del nucleo o le varianti cgMLST per facilitare le visualizzazioni. Scegli una soglia empirica o statistica utilizzata per l'aggregazione dei dati.
Il codice di esempio può essere utilizzato per ispezionare la distribuzione di frequenza dei lignaggi ST e determinare il cutoff. Il codice di esempio mostra come vengono aggregati gli ST minori o a bassa frequenza. Gli ST che non sono numerati possono essere raggruppati come altri ST.
Utilizzare un codice simile per le varianti cgMLST. Utilizzare l'approccio nidificato per calcolare la proporzione di ciascun lignaggio ST all'interno di ciascun sottogruppo BAPS1 per identificare gli ST che appartengono allo stesso sottogruppo BAPS1. Il codice esemplifica come la proporzione basata su ST può essere calcolata tra i sottogruppi BAPS1.
Per tracciare la distribuzione della resistenza antimicrobica o dei loci AMR tra i lignaggi ST, utilizzare una soglia empirica o statistica per filtrare i loci AMR più importanti per facilitare le visualizzazioni. Fornire un raw. csv contenente le proporzioni calcolate di tutti i loci AMR su tutti i lignaggi ST.
Quindi calcolare la proporzione AMR per ciascun ST utilizzando il codice. Dopo aver eseguito i calcoli per tutti gli ST, combinare i set di dati in un unico frame di dati utilizzando il codice e quindi esportare il file CSV contenente le proporzioni calcolate con il codice. Prima di tracciare la distribuzione basata su AMR tra i lignaggi ST, filtrare i dati in base a una soglia per facilitare le visualizzazioni.
Successivamente, traccia la filogenesi del genoma di base insieme alle classificazioni genotipiche gerarchiche nei dati AMR in un singolo grafico usando l'albero di Gigi. Quindi ottimizzare la dimensione della figura all'interno dell'albero Gigi utilizzando i parametri menzionati in precedenza. Ottimizzare le visualizzazioni aggregando le variabili o utilizzando la classificazione binaria, ad esempio la presenza o l'assenza del gene.
È stata esaminata la struttura gerarchica della popolazione del lignaggio Salmonella enterica uno nel contesto di una filogenesi del genoma di base. Le frequenze relative di tutti i genotipi gerarchici sono state quindi utilizzate per valutare la distribuzione complessiva e le classificazioni più frequentemente osservate. I lignaggi ST meno frequenti sono stati aggregati come altri ST per facilitare la visualizzazione dei dati.
Allo stesso modo, le varianti cgMLST meno frequenti sono state aggregate come altre cgMLST. Le relazioni ancestrali tra gli ST sono state esaminate utilizzando un approccio nidificato valutando la frequenza relativa dei lignaggi ST da parte dei sottogruppi o aplotipi BAPS1. La frequenza relativa dei loci AMR differenzianti del lignaggio ST è stata valutata per identificare firme genomiche accessorie uniche legate alla struttura della popolazione di Newport sierovara.
Nei risultati, i loci MDFA e AAC6IAA sembravano essere ancestralmente acquisiti dalla popolazione sierovara di Newport, mentre si prevede che ST45 sia multi-farmaco resistente. Rispetto all'ST45, gli altri principali lignaggi ST, come ST5 e ST118, hanno maggiori probabilità di essere suscettibili a più farmaci. Inoltre, è stata utilizzata una visualizzazione ancorata alla filogenesi per integrare sistematicamente i dati della struttura gerarchica della popolazione.
Questo protocollo analitico presenta una base per il data mining di popolazioni batteriche su larga scala. Ciò che consente è che i genotipi siano mappati e tracciati su larga scala utilizzando ProkEvo, ma può anche essere ampliato per rispondere ad altre domande, come esplorare la distribuzione delle vie metaboliche e dei fattori di virulenza associati alle informazioni genotipiche. Cioè, possiamo prevedere i fenotipi associati a specifici genotipi di interesse.
Il protocollo qui descritto apre sicuramente la strada ai ricercatori per esplorare nuove domande nel campo della genomica delle popolazioni e dedurre modelli evolutivi ed ecologici per specie batteriche patogene e non patogene.
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Panoramica
Questo articolo presenta un protocollo pratico e scalabile per l'analisi genomica di popolazioni batteriche mediante la piattaforma computazionale ProkEvo. Sfruttando dati di sequenziamento dell'intero genoma (WGS) e una mappatura genotipica gerarchica, il protocollo consente ai ricercatori di analizzare migliaia di genomi batterici, facilitando indagini ecologiche ed epidemiologiche. L'approccio viene illustrato utilizzando Salmonella Newport, integrando dati filogenetici, genotipici e genomici accessori per rivelare la struttura della popolazione e i modelli di resistenza agli antimicrobici.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Genomica delle popolazioni batteriche
- Biologia computazionale
- Epidemiologia microbica
Sfondo
- Il sequenziamento genomico di routine sta trasformando le indagini epidemiologiche nella sanità pubblica.
- L'analisi su larga scala delle popolazioni batteriche richiede strumenti computazionali automatizzati e scalabili.
- ProkEvo è una piattaforma open-source progettata per l'analisi genomica gerarchica delle popolazioni.
- La combinazione del mappaggio genotipico con l'analisi del genoma accessorio migliora l'inferenza ecologica.
Scopo dello studio
- Fornire un protocollo riproducibile e scalabile per l'analisi genomica di popolazioni batteriche mediante ProkEvo.
- Guidare i ricercatori nel mappare genotipi gerarchici e loci accessori per ottenere informazioni ecologiche ed epidemiologiche.
- Dimostrare applicazioni pratiche utilizzando un ampio insieme di dati costituito da genomi di Salmonella Newport.
Metodi Utilizzati
- Analisi automatizzata dei dati WGS utilizzando ProkEvo.
- Mappatura guidata dalla filogenesi di genotipi gerarchici (Sierovar → BAPS1 → ST → cgMLST).
- Visualizzazione di alberi filogenetici con dati genotipici e accessori mediante Gigi tree in R.
- Aggregazione e analisi della frequenza dei tipi di sequenza (ST) e delle varianti di MLST del genoma core.
- Valutazione della distribuzione dei loci di resistenza agli antimicrobici (AMR) tra i diversi linaggi.
Risultati principali
- Il mapping genotipico gerarchico ha rivelato la struttura della popolazione di Salmonella Newport.
- Le linee ST5 e ST118 condividono un antenato comune più recente rispetto alla altamente clonale ST45.
- Si prevede che ST45 sia multiresistente, mentre ST5 e ST118 sono più probabilmente suscettibili a più farmaci.
- Visualizzazioni ancorate alla filogenia hanno integrato dati genotipici e di resistenza agli antimicrobici, evidenziando firme genomiche specifiche per linea.
Conclusioni
- Il protocollo consente analisi genomiche scalabili e riproducibili delle popolazioni batteriche.
- La combinazione della mappatura genotipica gerarchica con l'analisi del genoma accessorio fornisce informazioni ecologiche ed epidemiologiche.
- Questo approccio supporta la sorveglianza in tempo reale e il tracciamento di linee patogene in contesti sanitari pubblici e regolatori.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Questo protocollo consente un'analisi scalabile e automatizzata della genetica di popolazione batterica mediante dati di sequenziamento dell'intero genoma, supportando la sorveglianza epidemiologica e l'inferenza ecologica in ambiti sanitari e regolatori. Integrando una mappatura gerarchica dei genotipi con l'analisi del genoma accessorio, fornisce un quadro per ridurre i rischi nella validazione di bersagli negli studi sulla resistenza agli antimicrobici e sui fattori di virulenza. L'approccio migliora la sicurezza predittiva delle firme genomiche specifiche per linea, orientando decisioni di avanzamento o interruzione nelle fasi iniziali dei percorsi di scoperta di interventi antibatterici.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo di Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Permette l'analisi di ipotesi terapeutiche mappando genotipi gerarchici (sierovar → BAPS1 → ST → cgMLST) per chiarire la struttura della popolazione e identificare genotipi chiave differenzianti, come i tipi di sequenza.
- Valore scientifico: Supporta la riduzione del rischio biologico valutando le distribuzioni di frequenza dei genotipi come indicatore della fitness ecologica, aiutando a prioritizzare bersagli associati a linee stabili.
- Valore scientifico: Determina le relazioni di parentela e la diversità genetica mediante classificazioni genotipiche, riducendo l'ambiguità meccanicistica nella selezione dei bersagli per strategie antimicrobiche o anti-virulenza.
Sviluppo di Screening e Saggi
- Valore scientifico: Prepara sistemi biologici validati per flussi di lavoro successivi, mappando loci accessori specifici della linea, inclusi marcatori di resistenza agli antimicrobici (AMR), al fine di consentire screening affidabili di composti su sfondi genetici definiti.
- Valore operativo: Affronta la standardizzazione e la riproducibilità dei saggi attraverso la visualizzazione ancorata alla filogenia di genotipi gerarchici e del contenuto di AMR, facilitando letture coerenti tra diversi laboratori.
- Valore operativo: Evidenzia prontezza e scalabilità per lo screening, dimostrando l'elaborazione automatizzata di 2.365 isolati di Salmonella Newport, sostenendo un profiling genotipico ad alto rendimento.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore Scientifico: Discute la rilevanza per le malattie collegando i loci accessori di resistenza agli antimicrobici (ad esempio, MDFA e AAC6IAA) a firme genomiche specifiche per linea in patogeni zoonotici, sostenendo l'allineamento di biomarcatori traslazionali.
- Valore Scientifico: Descrive il percorso dalla scoperta alla validazione preclinica utilizzando le differenze basate sugli ST (sequence types) per tracciare l'acquisizione ancestrale di loci di resistenza, fornendo informazioni per decisioni di avanzamento con rischio calibrato.
- Valore Scientifico: Si concentra sulla riduzione predittiva del rischio identificando loci accessori differenziatori di linea che si correlano a tratti fenotipici come la suscettibilità o resistenza a più farmaci, permettendo la previsione del fenotipo a partire dal genotipo.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si integra nel percorso di scoperta, dall'Early Discovery all'Identificazione del Lead e ai lavori Preclinici, fornendo un'analisi scalabile della mappatura genotipica e del genoma accessorio che supporta la verifica delle ipotesi, la chiarificazione dei percorsi metabolici e la riduzione del rischio biologico.
- Biologia della scoperta: Spiega come il metodo supporti la verifica di ipotesi, la chiarificazione di percorsi biologici o la riduzione del rischio biologico attraverso la mappatura guidata dalla filogenesi di genotipi gerarchici e l'analisi basata sulla frequenza delle linee ST.
- Screening: Descrive la prontezza del saggio, la riproducibilità o le uscite quantitative quando supportate dall'articolo, come la distribuzione proporzionale dei loci di resistenza agli antimicrobici (AMR) tra le linee ST per pannelli di screening standardizzati.
- Analisi: Mette in evidenza misurazioni, letture o risultati statistici che aiutano i gruppi di lavoro a confrontare diverse condizioni, inclusi i calcoli di frequenza relativa delle linee ST all'interno dei sottogruppi BAPS1 e le proporzioni dei loci AMR.
- Ricerca traslazionale: Collega il metodo alla continuità preclinica o all'allineamento di biomarcatori solo quando sostenuto dalla fonte, ad esempio mappando il contenuto AMR specifico delle linee per inferire modelli evolutivi ed ecologici nelle popolazioni patogene.
- Riutilizzo aziendale: Presenta il metodo come una capacità riutilizzabile piuttosto che una tecnica monouso, sottolineandone l'automazione, la scalabilità e la disponibilità open source tramite ProkEvo per applicazioni ripetute su diverse specie batteriche e studi.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Affidabilità predittiva, validazione degli obiettivi, riduzione dell'ambiguità meccanicistica.
- Valore operativo: Standardizzazione, riproducibilità e scalabilità.
- Valore strategico: Decisioni più efficaci su prosegui/non prosegui, efficienza del capitale e riduzione del rischio biologico in fasi avanzate.
- Impatto sul portafoglio: Prioritizzazione e decisioni di avanzamento corrette per il rischio.
Considerazioni sull'implementazione
- Competenze scientifiche richieste in genomica microbica, filogenetica e programmazione in R per l'analisi gerarchica della genetica di popolazione.
- I requisiti strumentali e infrastrutturali analitici includono l'accesso a dati di sequenziamento del genoma completo, risorse computazionali per l'elaborazione su larga scala e strumenti come Gigi tree per la visualizzazione filogenetica.
- I requisiti di standardizzazione tra i gruppi di lavoro prevedono l'aggregazione dei metadati in categorie minime per ottenere pannelli di colorazione coerenti e l'applicazione di soglie empiriche o statistiche per il filtraggio e la visualizzazione dei dati.
- Le considerazioni sull'adattamento in diversi sistemi modello includono la modifica delle gerarchie genotipiche (ad esempio, Sierotipo → BAPS1 → ST → cgMLST) e delle soglie di filtraggio per i loci accessori in base al patogeno e alla domanda di ricerca.
- I limiti pratici supportati dalla letteratura includono la necessità di aggregare ST o varianti cgMLST a bassa frequenza come "altro" per facilitare la visualizzazione, nonché la dipendenza dalla conoscenza specifica del settore per l'aggregazione dei dati e la scelta delle soglie.
