Colonne di cromatografia di affinità della membrana cellulare per identificare metaboliti vegetali specializzati che interagiscono con il recettore della tropomiosina chinasi B immobilizzato

Questa verticale presenta passi importanti nell'assemblaggio di colonne di cromatografia di affinità della membrana cellulare con recettori transmembrana funzionali. Queste colonne possono essere utilizzate per l'identificazione di piccole molecole presenti in estratti complessi e che interagiscono con recettori transmembrana immobilizzati. Le colonne di cromatografia di affinità di membrana cellulare velocizzano l'identificazione di composti biologicamente attivi presenti in miscele complesse.

L'utilizzo di colonne di cromatografia di affinità di membrana cellulare può essere di particolare interesse per chi è interessato all'identificazione di composti farmacologicamente attivi presenti in matrici naturali complesse, come estratti vegetali, fungini o batterici. Per iniziare, preparare la soluzione madre di benzamidina 200 millimolare sciogliendo 120 di benzamidina in cinque millilitri di acqua deionizzata ultrapura. Preparare una soluzione madre PMSF da 10 millimolari sciogliendo 0,017 grammi di PMSF in 10 millilitri di etanolo in una cappa aspirante.

Preparare il cocktail inibitore delle proteasi 100X sciogliendo la miscela di inibitori della proteasi disponibile in commercio in un millilitro di acqua deionizzata ultrapura. Mescolare accuratamente e aliquot da 200 a 300 microlitri del cocktail. Preparare la soluzione madre di ATP 100 millimolari sciogliendo 55,114 milligrammi di idrato di sale disodico ATP in un millilitro di acqua ultrapura ionizzata.

Mescolare accuratamente e aliquota 100 microlitri della miscela. Preparare il tampone sciogliendo 3,03 grammi di Tris-HCL, 2,9 grammi di cloruro di sodio, 0,22 grammi di cloruro di calcio anidro, 0,2 grammi di cloruro di magnesio esaidrato e 0,19 grammi di cloruro di potassio in 500 millilitri di acqua deionizzata ultrapura. Preparare il tampone di omogeneizzazione mescolando 17,3 millilitri del tampone Tris con 0,3 millilitri di soluzione madre di benzamidina, 0,2 millilitri di soluzione madre PMSF, 0,2 millilitri di cocktail inibitore delle proteasi, 20 microlitri di soluzione madre di ATP, due millilitri di glicerolo e 0,029 grammi di EDTA.

Regolare il pH a 7,4 utilizzando la soluzione di acido cloridrico. Abbassare le cellule raccolte a quattro gradi Celsius per cinque minuti a 400 x g e rimuovere il surnatante e lavare il pellet cellulare rimanente con 10 millilitri di 1X pH 7,4 PBS ghiacciato. Scartare il surnatante e aggiungere 20 millilitri di tampone di omogeneizzazione.

Posizionare il tubo conico sul ghiaccio. Trasferire la sospensione cellulare in una smerigliatrice di tessuto omogeneizzatore Dounce da 40 millilitri, omogeneizzare manualmente la sospensione sul ghiaccio usando 40 colpi di pestello su e giù. Trasferire la sospensione cellulare omogeneizzata in un tubo conico da 50 millilitri, scartare il pellet e trasferire il surnatante in un nuovo tubo conico.

Salvare il pellet di membrana cellulare ed eliminare il surnatante. Preparare il tampone di solubilizzazione mescolando 8,7 millilitri della soluzione tampone con 0,1 millilitri di soluzione madre PMSF, 0,15 millilitri di soluzione madre di benzamidina, 0,1 millilitri di cocktail inibitore delle proteasi, 10 microlitri di soluzione madre di ATP, un millilitro di glicerolo e 0,2 grammi di colato di sodio. Trasferire il tampone di solubilizzazione nel tubo conico con frammenti di membrana cellulare.

E risospesciare il pellet. Ruotare la miscela risultante a 150 RPM a quattro gradi Celsius per 18 ore. Dopo 18 ore, centrifugare la miscela di solubilizzazione a quattro gradi Celsius per 30 minuti a 47.900 x g.

Aggiungi 100 milligrammi di IAM. PC. DD2 particelle al surnatante e ruotare la miscela di sospensione risultante a 150 RPM a quattro gradi Celsius per un'ora. Preparare il tampone per dialisi in quattro litri di acqua deionizzata ultrapura aggiungendo 24 grammi di Tris-HCl, 23,4 grammi di cloruro di sodio, 0,06 grammi di cloruro di calcio, 5,85 grammi di EDTA e 0,07 grammi di PMSF.

Sciogliere pmsf prima in un piccolo volume di etanolo e poi aggiungere lentamente nel becher con il tampone. Tagliare 10 centimetri di tubo di dialisi a membrana di cellulosa per preparare il tubo di dialisi e trasferire la sospensione contenente IAM. PC. Particelle DD2 e frammenti di membrana cellulare nel tubo di dialisi.

Chiudere entrambe le estremità del tubo di dialisi con clip per tubi di dialisi. Posizionare il tubo di dialisi nel tampone di dialisi. Dopo 24 ore, posizionare il tubo di dialisi nel tampone di dialisi appena preparato e continuare la dialisi per altre 24 ore.

Preparare un tampone di acetato di ammonio a pH 7,4 millimolare che verrà utilizzato per lavare lo IAM. PC. Particelle DD2 e esperimenti di caratterizzazione in colonna sciogliendo 0,778 grammi di acetato di ammonio in un litro di acqua deionizzata ultrapura. Dopo 48 ore di dialisi, rimuovere il tubo di dialisi dal tampone di dialisi e trasferire il contenuto del tubo di dialisi in un tubo conico da 15 millilitri.

Scartare il surnatante e lavare il pellet rimanente tre volte con 10 millilitri di tampone di acetato di ammonio. Dopo il terzo lavaggio, risospesere il pellet rimanente in un millilitro di tampone di acetato di ammonio. Mescolare accuratamente e utilizzare il liquame risultante per imballare la colonna di vetro 5 x 20 per ottenere la colonna di cromatografia CMAC.

Per imballare la colonna, posizionare un filtro inferiore precedentemente imbevuto di tampone di acetato di ammonio nel portafiltro. Montare il portafiltro nella colonna di vetro e avvitare il cappuccio della colonna per fissare la posizione del supporto. Posizionare la colonna verticalmente in un morsetto per le dita e fissarla nel supporto del laboratorio.

Posizionare un becher sotto la colonna, trasferire lentamente un piccolo volume del liquame nella colonna di vetro con un pipetter a canale singolo che tiene la punta della pipetta contro la parete della colonna di vetro. Per accelerare il processo di imballaggio, rimuovere il tampone dall'alto del letto fisso con una micropipetta tra ogni passaggio. Posizionare un filtro superiore e avvitare l'unità adattatore in modo che non vi sia alcun buffer residuo sopra la fase stazionaria.

Fissare la posizione dell'unità adattatore con il blocco dell'adattatore. Collegare la colonna a una pompa per cromatografia liquida ad alte prestazioni e, per lavare la colonna durante la notte con tampone in acetato di ammonio, impostare la portata su 0,2 millilitri al minuto. Per una conservazione più lunga, eseguire la colonna con una soluzione di azide di sodio allo 0,05% in tampone di acetato di ammonio, indossando un camice da laboratorio, occhiali di sicurezza e guanti quando si lavora con azide di sodio e conservare a quattro gradi Celsius.IAM.

PC. Le particelle DD2 con frammenti di membrana cellulare TrkB di neuroblastoma immobilizzato e in presenza di BDNF hanno provocato particelle fluorescenti. Non è stata osservata alcuna fluorescenza nelle particelle IAM incapsulate nella membrana cellulare nulla TrkB o quando non è stato utilizzato BDNF come nelle particelle IAM incapsulate nella membrana cellulare TrkB. Viene mostrato un cromatogramma di affinità frontale tipico delle colonne CMAC funzionali di concentrazioni crescenti di 7, 8-DHF di un millimolare, 750 nanomolare, 500 nanomolari e 300 nanomolari ai recettori TrkB immobilizzati, che ha mostrato un cambiamento dipendente dalla concentrazione nel tempo di ritenzione.

Una colonna CMAC non funzionale ha mostrato la mancanza di cambiamenti dipendenti dalla concentrazione nella ritenzione del ligando marcatore. Una colonna di controllo negativa CMAC è stata preparata immobilizzando frammenti di membrana cellulare, non esprimendo la proteina mirata per escludere interazioni non specifiche. L'aggiunta dello 0,2% di estratto acquoso di cola di Gotu ha comportato una significativa riduzione della ritenzione di 7, 8-DHF, indicando la presenza di ligandi concorrenti per il sito di legame dell'agonista.

La mancanza di riduzione della ritenzione di 7, 8-DHF sulla colonna TrkB nulla negativa CMAC ha ulteriormente confermato la mancanza di recettori TrkB funzionali su questa colonna. L'approccio di cromatografia di picco mancante ha identificato un composto fortemente mantenuto sulla colonna TrkB, mentre eluiva precocemente sulla colonna nulla TrkB, indicando un'interazione specifica. È fondamentale conoscere la fonte dei recettori per la colonna di cromatografia di affinità della membrana cellulare veloce.

Assicurati di controllare la letteratura per progettare correttamente i tamponi di omogeneizzazione e solubilizzazione. La colonna di cromatografia dell'affinità della membrana cellulare preparata in questo protocollo è stata utilizzata per identificare nuovi potenziali colpi di farmaci e per caratterizzare la natura dell'interazione tra il recettore immobilizzato e i suoi ligandi naturali.