Isolamento delle cellule muscolari lisce aortiche primarie specifiche del paziente e misurazioni semiquantitative di contrazione in tempo reale in vitro

Questo metodo consente ai ricercatori di studiare la contrazione cellulare di più linee cellulari di pazienti contemporaneamente. Ci permette di studiare le malattie in modo più rapido ed efficiente. Questa tecnica ci permette di quantificare la contrazione cellulare in tempo reale.

Entro un'ora, possiamo ottenere i valori di contrazione di dozzine di cellule. Abbiamo dimostrato per la prima volta che la contrazione delle cellule muscolari è diminuita in un gruppo di pazienti con aneurismi aortici. Questo può essere un nuovo biomarcatore o un bersaglio per la terapia medica.

Inizia sterilizzando due paia di pinze chirurgiche e un bisturi immergendole nel 70% di etanolo e successivamente asciugandole. Quindi pipettare due millilitri di mezzo SMC in una capsula di Petri in cui verrà eseguita la dissezione del tessuto. Successiva pipetta 2,5 millilitri di SMC medium in due fiaschi T-25.

Ruotare i palloni in modo che il piccolo volume di medio copra l'intera superficie. Ispezionare visivamente la biopsia, identificando i tre strati aortici dalla presenza di placche aterosclerotiche sul lato intima e tessuto connettivo viscido sul lato avventiziale per distinguere gli strati. Per isolare gli SMC dal mezzo, rimuovere gli altri due strati posizionando prima il tessuto con la placca intima rivolta verso l'alto, quindi rimuovere la placca solida allontanandola dal tessuto con una pinza mentre si spinge il tessuto verso il basso con il secondo paio di pinze fino a quando lo strato mediale uniforme rosa è visibile.

Ora capovolgi il tessuto e ripeti la stessa procedura estraendo lo strato avventiziale, assicurandoti di rimuovere tutte le parti visibili in tutti i tentativi necessari poiché questo strato non si staccherà facilmente dal supporto. Una volta isolato lo strato di supporto, tagliare il tessuto a cubetti premendo il supporto verso il basso con una pinza e tagliando il tessuto in una direzione usando il bisturi facendo tagli unidirezionali puliti per ridurre al minimo i danni. Posizionare da 10 a 20 di questi pezzi di tessuto nel quarto superiore del fiocco T-25 usando una pinza.

Dopo aver sterilizzato due paia di pinze chirurgiche e un bisturi come descritto in precedenza, pipettare due millilitri di mezzo fibroblasto in una capsula di Petri in cui verrà eseguita la dissezione del tessuto. Quindi pipettare 2,5 millilitri di fibroblasto medio in due palloni T-25 e ruotare i palloni intorno in modo che il piccolo volume di medio copra l'intera superficie. Ispezionare visivamente la biopsia per identificare l'epidermide con una superficie cutanea riconoscibile, a volte con capelli visibili, quindi cercare il grasso sottocutaneo giallo e viscido sul lato opposto.

Lo strato tra l'epidermide e il grasso sottocutaneo è il derma, la fonte di fibroblasti vitali. Per isolare i fibroblasti dal derma, rimuovere gli altri due strati posizionando il tessuto sul lato del derma per rendere visibili tutti e tre gli strati. Quindi tenere il tessuto verso il basso con una pinza e tagliare via l'intera epidermide in una linea pulita senza danneggiare il tessuto.

Ora capovolgi il tessuto e ripeti la stessa procedura tagliando all'interno del derma parallelamente al bordo con il grasso sottocutaneo. Una volta isolato il derma, tagliare il tessuto a cubetti premendo il tessuto verso il basso con una pinza e tagliando il tessuto in una direzione usando il bisturi. Quindi posizionare da 10 a 20 di questi pezzi di tessuto nel quarto superiore del pallone T-25 usando la pinza.

Contare le cellule utilizzando un contatore cellulare automatizzato e seminare gli SMC in triplice copia a una densità di semina di 30.000 cellule per pozzetto in 200 microlitri di mezzo SMC nella piastra ECIS rivestita di gelatina. Posizionare la piastra con gli SMC nel supporto a 96 pozzetti dell'ECIS nell'incubatore di colture cellulari. Fare doppio clic sul software ECIS Applied BioPhysics per aprire il programma e premere il pulsante Setup.

Controllare se tutti gli elettrodi hanno contatto con il supporto nel pannello inferiore sinistro etichettato Well Configuration. Se gli elettrodi non sono collegati correttamente, regolare la piastra nel supporto prima di iniziare la misurazione. Ora selezionate il tipo di piastra nello stesso pannello facendo clic su Tipo matrice ( Array type ).

Quindi, preparare due pipette impostate a due microlitri e un volume di 150 microlitri. Prima di iniziare la stimolazione, premere Mark nel software e inserire un commento. Per stimolare le cellule, rimuovere il coperchio e posizionarlo su una superficie sterile all'interno dell'incubatore.

Quindi indurre la contrazione SMC pipettando due microlitri della soluzione di lavoro della ionomicina in ciascun pozzo il più rapidamente possibile. Una volta che tutte le cellule sono state stimolate, mescolare il mezzo nei pozzetti usando la seconda pipetta. Per determinare la riproducibilità della misurazione interesperimentale, due misurazioni indipendenti di tutte le linee cellulari di controllo e paziente incluse sono state tracciate come un grafico di Bland-Altman, dimostrando che questo metodo non mostrava variabilità al di fuori dell'intervallo di confidenza, ad eccezione di una linea cellulare anomala.

Due pozzi seminati con lo stesso esperimento e stimolati contemporaneamente hanno mostrato praticamente la stessa curva di risposta contrattuale. Per convalidare se la risposta mostrata fosse una contrazione e non uno stress osmotico a causa della stimolazione della ionomicina, il mezzo è stato sostituito dopo la stimolazione ed è stato registrato il comportamento delle cellule, il che ha dimostrato che le cellule stimolate hanno iniziato a diffondersi nuovamente sull'elettrodo. La risposta contrattile nelle SMC derivate da aorte sane e non dilatate ha mostrato una risposta mediana del 61% rispetto alla risposta mediana del 52% dei pazienti con aneurisma dell'aorta addominale.

La risposta contrattile media del gruppo di controllo è stata utilizzata per identificare quattro pazienti che avevano valori di contrazione inferiori rispetto ai valori normali. L'analisi Western blot e la successiva quantificazione hanno confermato che le cellule esprimono marcatori SMC. Per determinare la capacità proliferativa dell'SMC, è stata eseguita la qPCR per Ki67.

L'espressione di Ki67 era rilevabile in tutte le cellule, ma non era correlata con l'output contrattile. Quando si stimolano le cellule per la contrazione, ricordarsi di non pipettare troppi pozzetti contemporaneamente e cercare di pipettare il più velocemente possibile. Questa procedura potrebbe richiedere un po 'di pratica.

Utilizzando questo metodo, abbiamo diviso i pazienti in base alla loro contrazione e alla contrazione normale inferiore che ci ha permesso di indagare questi pazienti e i collegamenti con le loro caratteristiche cliniche come il fumo.