Quantificazione dei parametri vascolari nelle retine a montaggio intero di topi con retinopatie non proliferative e proliferative

Nelle retinopatie, le alterazioni vascolari sono il primo segno che viene rilevato dai medici. Seguono la progressione della malattia e scelgono un trattamento in base a questi cambiamenti. Sono stati sviluppati diversi modelli animali per studiare le diverse fasi della patologia.

In questo lavoro, mostreremo come misurare diverse alterazioni vascolari. Per questo, impiegheremo due modelli animali. Uno di questi è il modello murino di retinopatia indotta da ossigeno, che riproduce la retinopatia della prematurità e alcuni aspetti della retinopatia diabetica proliferativa.

Qui, misureremo le aree avascolari, le aree neovascolari e la dilatazione e la tortuosità delle arteriole. Nel nostro laboratorio è stato sviluppato un modello murino di sindrome metabolica, che induce una retinopatia non proliferativa. In questo lavoro sono state valutate la densità vascolare e la ramificazione.

Al sacrificio dei topi, enucleatizza con le forbici. Fissare gli occhi enucleati con paraformaldeide appena preparata per un'ora a temperatura ambiente. Sotto il microscopio sezionante, rimuovere le cornee con le forbici tagliando lungo il limbus e sezionare l'intera retina.

Scartare il segmento anteriore dell'occhio e quindi separare la retina dalla coroide RPE. Posizionare le retine in 200 tubi microlitro. Quindi bloccare e permeabilizzare le retine in 100 microlitri di TBS contenenti il 5% di albumina sierica bovina Tritone per sei ore a quattro gradi con una delicata agitazione nello shaker.

Quindi invertire il tubo per posizionare la retina nella tazza e rimuovere la soluzione bloccante con pipetta. Aggiungere 100 microlitri di soluzione contenente isolectina. Avvolgere i tubi con un foglio di alluminio per proteggere i campioni dalla luce.

Incubare le retine con soluzione di lectina durante la notte a quattro gradi con una delicata agitazione nello shaker. Lavare le retine con 100 microlitri di TBS-Triton per 20 minuti con una delicata agitazione nello shaker. Ripetere questo passaggio tre volte.

Posizionare la retina in un vetrino e aggiungere una goccia di PBS. Al microscopio di dissezione, eseguire quattro tagli ugualmente distanti dai bordi della retina verso il nervo ottico. Per aprire i petali della retina, utilizzare una pinza o piccoli pezzi di carta da filtro.

Assicurarsi che il lato del fotorecettore sia rivolto verso il basso. Rimuovere il PBS rimanente dalla diapositiva con carta da filtro. Quindi aggiungere una mediana di montaggio e una coverslip.

Lasciare asciugare per un'ora a temperatura ambiente. Conservare le diapositive a quattro gradi al riparo dalla luce. Al microscopio confocale, posizionare il vetrino nella piastra a faccia in giù.

Focalizzare il plesso superiore della vascolarizzazione retinica e selezionare un'area per avviare l'acquisizione dell'immagine. Impostare i parametri laser generali nel software. Impostate le coordinate sugli assi X, Y e Z.

Inizializzare la scansione. Al termine del processo di scansione, aprire l'immagine e salvarla con un'estensione preferita. Nel software ImageJ FIJI, vai alla barra dei menu e fai clic su File, Apri.

Selezionare l'immagine da elaborare. Nella finestra Opzione di importazione bioformati, selezionare Visualizza metadati OME-XML e fare clic OK.In finestra Metadati OME, cercare informazioni sulle dimensioni dei pixel. Copiare questi dati.

Per la calibrazione dell'immagine, vai alla barra dei menu e seleziona Proprietà immagine. Copiare le informazioni e fare clic su OK. Assegna una lut preferita all'immagine. Per visualizzare tutti gli stack in una singola immagine, vai alla barra dei menu e seleziona Immagine, Stack, Progetto Z.

Nella finestra di proiezione visualizzata, selezionare tutte le pile in cui vengono visualizzate le navi. In Tipo proiezione (Projection Type), selezionate Intensità media (Average Intensity) e fate clic su OK. Vai alla barra dei menu, Immagine, Regola, Luminosità / Contrasto. Fare clic su Applica e salvare le modifiche.

Copiare i parametri selezionati per luminosità e contrasto. Questi devono essere identici per tutte le immagini. Nella barra dei menu scegliere lo strumento bacchetta.

Seleziona l'area retinica che manca di vasi formati. Premere T sulla tastiera per registrare le aree selezionate in ROI Manager. Fare clic su Misura nel ROI Manager per ottenere le informazioni sull'area avascolare.

Ripetere questi passaggi per misurare l'area totale della retina. Nella barra dei menu scegliere lo strumento bacchetta. Ingrandisci l'immagine per visualizzare meglio i neovasi.

Selezionate i neovasi uno per uno con lo strumento bacchetta. Premere la lettera T sulla tastiera per registrare l'area selezionata in ROI Manager. Fare clic su Misura nel ROI Manager per ottenere i dati dell'area.

Nella barra dei menu, selezionate lo strumento Linea retta. Ingrandisci l'immagine per visualizzare meglio la parete della nave. Eseguire tre linee trasversali alla nave principale prima del primo ramo.

Premere T sulla tastiera per registrare le aree selezionate nel ROI Manager. Fare clic su Misura in ROI Manager per ottenere i dati sulla distanza. Nella barra dei menu, fate clic sull'icona dello strumento Linea retta con il tasto destro del mouse e selezionate Linea segmentata.

Tracciare una linea all'interno del vaso dal nervo ottico fino alla prima ramificazione del vaso, seguendo la forma vascolare. Premere la lettera T sulla tastiera per registrare l'area selezionata in ROI Manager. Nella barra dei menu, selezionate lo strumento Linea retta.

Disegna una linea dal nervo ottico fino alla prima ramificazione del vaso. Premere la lettera T sulla tastiera per registrare l'area selezionata in ROI Manager. Fare clic su Misura nel ROI Manager per ottenere i dati sulle distanze.

Con lo strumento Ovale della barra dei menu, definite un'area applicata equamente a tutte le condizioni sperimentali. L'area selezionata deve essere un cerchio concentrico disegnato attorno al nervo ottico. Premere la lettera T sulla tastiera per registrare l'area selezionata in ROI Manager.

Contare manualmente il numero di rami primari derivanti dalle navi principali all'interno dell'area di selezione. Trasforma l'immagine in modalità a 8 bit. Vai a Plugin nella barra dei menu, seleziona Analisi dei vasi, Densità vascolare.

Definite un'area con lo strumento quadrato della barra dei menu in cui desiderate misurare la densità del recipiente. Fare clic su OK. Il programma visualizzerà una nuova finestra con le informazioni richieste. Nel primo esempio sperimentale, è stato utilizzato il modello murino di retinopatia indotta da ossigeno.

Le iniezioni intravitreali sono state eseguite al giorno 12 postnatale per determinare l'efficacia di un farmaco come antiangiogenico. I topi iniettati con il veicolo sono stati impiegati come controllo. Le aree avascolari sono definite come le zone che mancano di vasi sanguigni retinici.

Dalle immagini acquisite, le aree avascolari possono essere quantificate come la somma delle regioni senza vasi divise l'area totale della retina. Le aree con danni meccanici mostrano anche l'assenza di navi. Per identificare le aree danneggiate, analizzare l'integrità degli strati neuronali con la macchia di Hoechst.

I neovasi sono vasi di piccolo calibro che provengono da vasi preesistenti del plesso vascolare superiore. Abbiamo calcolato l'area occupata dai ciuffi dei neovasi quantificando l'area neovascolare della retina occupata dall'area totale della retina. Poiché la forma e le dimensioni dei neovasi sono variabili, occasionalmente possono sembrare simili a detriti e artefatti.

Per distinguere i neovasi, verificare che il ciuffo cresca da una nave matura. Per l'analisi della dilatazione, abbiamo misurato il diametro principale del vaso a tre altezze prima del primo ramo. I ricercatori devono definire una distanza predeterminata per misurare il diametro del vaso al fine di ridurre la variabilità tra i risultati.

Idealmente, il punto più lontano dal nervo ottico dovrebbe essere di circa 300 micrometri. Suggeriamo di eseguire l'analisi, e in seguito, la media di almeno sei animali per condizione. Per quanto riguarda la tortuosità, misuriamo la distanza percorsa dal vaso principale seguendo la sua forma, rispetto alla distanza in linea retta tra il nervo ottico e il primo punto di ramificazione.

Come possiamo vedere nell'immagine, c'è eterogeneità nella sinuosità dei vasi principali. Per ottenere un risultato rappresentativo, devono essere quantificati non meno di sei topi per condizione. Gli ultimi parametri, ramificazione vascolare e densità, sono stati analizzati in un modello di sindrome metabolica che presenta retinopatia non proliferativa.

Per la misura della ramificazione vascolare, abbiamo definito l'area di quantificazione disegnando un cerchio concentrico, e poi abbiamo contato, uno per uno, i rami primari derivanti da un vaso centrale principale. Dalle immagini acquisite, la densità vascolare è stata quantificata come l'area occupata dai vasi divisa per l'area del ROI, che è stata posizionata in luoghi diversi in ciascuna microfotografia. Evitare di quantificare le aree con danni meccanici.

Se ci sono più di due aree con punture, la retina deve essere scartata. In sintesi, in questo articolo, abbiamo mostrato tecniche classiche, consolidate e riproducibili per quantificare alcuni dei parametri più rilevanti tenendo conto nella pratica clinica.