Name: Imaging dal vivo e quantificazione dellinfezione virale in topi transgenici K18 hACE2 utilizzando SARS-CoV-2 ricombinante che esprime reporter (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-11-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 41 s
Description: Impara l'imaging dal vivo e la quantificazione dell'infezione virale in topi transgenici K18 hACE2 utilizzando SARS-CoV-2 ricombinante con reporter. Questo metodo consente di valutare efficacemente i trattamenti terapeutici.

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Vorremmo ringraziare i membri del nostro istituto (Texas Biomedical Research Institute) per i loro sforzi nel mantenere le nostre strutture pienamente operative e sicure durante la pandemia di COVID-19. Vorremmo anche ringraziare il nostro Comitato istituzionale per la biosicurezza (IBC) e spell (IACUC) per aver rivisto i nostri protocolli in modo efficiente in termini di tempo. Ringraziamo il Dr. Thomas Moran della Icahn School of Medicine del Mount Sinai per aver fornito l'anticorpo monoclonale della proteina nucleocapsside (N) cross-reattivo 1C7C7 SARS-CoV. La ricerca SARS-CoV-2 nel laboratorio di Martinez-Sobrido è attualmente supportata dalle sovvenzioni NIAID / NIH RO1AI161363-01, RO1AI161175-01A1 e R43AI165089-01; il Dipartimento della Difesa (DoD) concede W81XWH2110095 e W81XWH2110103; la San Antonio Partnership for Precision Therapeutic; il Texas Biomedical Research Institute Forum; l'Università del Texas Health Science Center di San Antonio; la San Antonio Medical Foundation; e dal Center for Research on Influenza Pathogenesis and Transmission (CRIPT), un Centro di eccellenza per la ricerca e la risposta all'influenza finanziato dal NIAID (CEIRR, contratto # 75N93021C00014).

I protocolli che coinvolgono topi transgenici K18 hACE2 sono stati approvati dal Texas Biomedical Research Institute (TBRI) Institutional Biosafety Committee (IBC) e dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). Tutti gli esperimenti seguono le raccomandazioni contenute nella Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio del Consiglio Nazionale delleRicerche 40. Il dispositivo di protezione individuale (DPI) appropriato è necessario quando si lavora con i topi.
1. Uso di topi transgenici K18 hACE2
<ol><li>Acquistare e mantenere topi femmina di 4-6 settimane B6.Cg-Tg (K18-ACE2) 2Prlmn / J (topi transgenici K18 hACE2) in una struttura di cura degli animali a livello di biosicurezza (BSL)-2 in condizioni specifiche prive di agenti patogeni.<ol>
<li>Dopo l'arrivo alle strutture BSL2, consentire agli animali di acclimatarsi per 7 giorni e trasferirli alla struttura per animali BSL-3 per infezioni e altre procedure sperimentali.</li>
		<li>Seguendo i protocolli IACUC, posizionare 4 topi per gabbia. Per garantire che l'animale sia deceduto, dopo l'infezione dei topi da rSARS-CoV-2 e imaging in vivo , eutanasizzare gli animali con una dose letale di Fatal-Plus (>100 mg/kg).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Biosicurezza
NOTA: In questo manoscritto, rSARS-CoV-2 viene generato utilizzando i sistemi genetici inversi basati su BAC per il ceppo SARS-CoV-2 USA-WA1/2020, come precedentemente descritto37. Tutte le procedure in vivo che coinvolgono infezioni da rSARS-CoV-2/Nluc o rSARS-CoV-2/Venere devono essere eseguite in un armadio di sicurezza biologica in condizioni BSL-3.
<ol><li>Pulire l'armadio di biosicurezza con il 2% di wexicida e il 70% di etanolo disinfettante sequenzialmente prima e dopo aver eseguito tutte le procedure sperimentali descritte in questo articolo.</li>
	<li>Sterilizzare tutto il materiale di dissezione (forbici, pinze di dissezione, ecc.) e l'omogeneizzatore prima e dopo ogni utilizzo.</li>
	<li>Pulire la camera di isolamento e disinfettare utilizzando compresse MB10 prima e dopo ogni utilizzo secondo le istruzioni del produttore.</li>
	<li>Scartare tutto il materiale biologico prodotto durante le procedure secondo le linee guida IBC e IACUC.</li>
</ol>3. Caratterizzazione in vivo di rSARS-CoV-2
<ol><li>Infezioni da topi<ol>
<li>Metti topi transgenici K18 hACE2 di 4-6 settimane in gabbie etichettate, identifica i topi in ogni gabbia usando un codice di punzonatura auricolare e posiziona 4 topi per gabbia. Utilizzare un gruppo di topi per il peso corporeo e la sopravvivenza e un altro gruppo di animali per la titolazione virale e l'imaging.</li>
		<li>Prima dell'infezione, radere il torace dei topi sul lato ventrale dal capezzolo pettorale all'area del capezzolo inguinale per facilitare il segnale di bioluminescenza.</li>
		<li>Preparare l'inoculo rSARS-CoV-2 con 105 unità formanti placche (PFU)/topo in condizioni sterili in un volume totale di 50 μL utilizzando soluzione salina tampone fosfato sterile 1x (PBS). NOTA: Calcolare la quantità di rSARS-CoV-2 da utilizzare nella diluizione virale con la formula: virus necessario = (105 PFU per topo / 50 μL) x volume finale) / titolo virale di riserva.</li>
		<li>Mantenere l'inoculo del virus refrigerato sul ghiaccio.</li>
		<li>Utilizzare i topi infettati da simulazione (1x PBS) e rSARS-CoV-2 / WT-infetti come controlli interni. Metti i topi finti infetti in una gabbia separata rispetto ai topi infetti da rSARS-CoV-2.</li>
		<li>Anestetizzare i topi usando il 5% di sedazione gassosa isoflurano in una camera di anestesia e mantenere con il 3% di isoflurano.</li>
		<li>Una volta confermata la reazione posturale e il riflesso di raddrizzamento, posizionare il topo nella posizione di reclinazione dorsale.</li>
		<li>Scruffare il collo del topo tra l'indice e il pollice e tenere la coda contro il palmo della mano con il mignolo per tenere l'animale in posizione dorsale.</li>
		<li>Posizionare la punta della pipetta contenente 50 μL di inoculo virale nella narice ed espellere lentamente la soluzione. Assicurarsi che l'inoculo del virus venga inalato e che non vi sia reflusso osservando la scomparsa della goccia di inoculo.</li>
	</ol></li>
	<li>Monitoraggio della bioluminescenza K18 hACE2 topi transgenici infettati da rSARS-CoV-2/Nluc (Figura 1 e Figura 2) NOTA: questo esperimento segue la rappresentazione schematica e utilizza i virus visualizzati nella Figura 1. Per il sistema di imaging in vivo (IVIS) è necessario un attacco per anestesia isoflurano. Vedere la Tabella dei materiali per i dettagli degli strumenti e dei sistemi necessari.<ol>
<li>Avviare il software di imaging e impostare i parametri, fare clic sulla modalità immagine su Bioluminescenza, aprire il filtro e impostare il tempo di esposizione su auto.</li>
		<li>Dopo aver inizializzato la macchina IVIS, posizionare i mouse nella camera di isolamento mentre sono ancora all'interno dell'armadio di biosicurezza. Indurre topi con isoflurano a una concentrazione del 5%. Una volta confermata la perdita della reazione posturale e il riflesso di raddrizzamento, mantenere con il 3% di isoflurano.</li>
		<li>Una volta che i topi sono stati anestetizzati, rimuoverli dalla camera di isolamento e somministrare retro-orbitalmente il substrato della luciferasi diluito 1:10 in 1x PBS (volume finale 100 μL / topo) con un ago da 25 G.</li>
		<li>Dopo la somministrazione del substrato di luciferasi, riposizionare i topi nella camera di isolamento con il torace rivolto verso l'alto e la cavità nasale all'interno del multiplo per mantenere l'animale anestetizzato durante la procedura di imaging.</li>
		<li>Trasferire la camera di isolamento sulla macchina IVIS e, istantaneamente dopo aver chiuso lo sportello dell'imager IVIS, selezionare Acquisisci nel programma software da inizializzare (Figura 2A).</li>
		<li>Per analizzare le immagini di bioluminescenza acquisite, utilizzare lo strumento ROI (regione di interesse) nel software per designare il segnale preciso e misurare il flusso (Figura 2B).</li>
		<li>Clicca su Misura e consenti al sistema di iniziare a valutare la bioluminescenza nei fotoni per fornire l'emissione assoluta di fotoni paragonabile alle misure di uscita fornite dai vari parametri.</li>
		<li>Immagini di topi a 1, 2, 4 e 6 giorni dopo l'infezione.</li>
		<li>Dopo l'imaging, rimetti i topi in gabbia.</li>
	</ol></li>
	<li>Analisi di fluorescenza in topi transgenici K18 hACE2 infettati da rSARS-CoV-2/Venere (Figura 3 e Figura 4) NOTA: questo esperimento segue la rappresentazione schematica e rSARS-CoV-2 mostrati nella Figura 3. Vedere la Tabella dei materiali per i dettagli degli strumenti e dei sistemi necessari.<ol>
<li>Avviare il software di imaging e impostare i parametri, impostare l'eccitazione (500 nm) e i filtri di emissione (530 nm), fare clic sulla modalità immagine su Fluorescenza e impostare il tempo di esposizione su auto.</li>
		<li>Eutanasia intraperitoneale dei topi usando una dose letale di Fatal-Plus (>100 mg/kg). Dopo l'eutanasia, disinfettare il sito di incisione con etanolo al 70%.</li>
		<li>Usando una pinzetta, tirare la pelle, fare un'incisione dallo sterno all'addome e tagliare l'incisione dai lati con le forbici. Tagliare la vena epatica per ridurre al minimo la quantità di sangue nei polmoni ed evitare segnali di fondo elevati durante l'imaging.</li>
		<li>Usando le forbici, tagliare lo sterno e aprire la cassa toracica. Quindi, tagliare l'estremità della trachea con le forbici e rimuovere i polmoni con una pinzetta.</li>
		<li>Posizionare i polmoni asportati in una piastra a 6 pozzetti contenente 2 ml di PBS 1x e risciacquare per rimuovere il sangue in eccesso. Ridurre al minimo la possibilità di contaminazione tra i campioni disinfettando e pulendo gli strumenti chirurgici tra i campioni utilizzando il 70% di etanolo.</li>
		<li>Dopo aver inizializzato la macchina IVIS, posizionare i polmoni in un vassoio nero e separare i tessuti l'uno dall'altro.</li>
		<li>Posizionare il vassoio all'interno della camera di isolamento all'interno dell'armadio di biosicurezza, quindi trasferire la camera di isolamento all'IVIS. Chiudere la porta e fare clic su Acquisisci per avviare il sistema di imaging (Figura 4A).</li>
		<li>Per analizzare la fluorescenza, utilizzare lo strumento ROI e disegnare ROI attorno a ciascuno dei singoli polmoni. Misurare manualmente ogni ROI e quindi utilizzare i valori medi di efficienza radiante forniti e sottrarre da quelli dei topi finti infetti (Figura 4B).</li>
		<li>Una volta completata l'imaging, posizionare i tessuti sul ghiaccio per l'analisi dello stesso giorno o in un criotubo per il congelamento del ghiaccio secco da conservare a -80 °C per una successiva lavorazione.</li>
	</ol></li>
	<li>Imaging del campo luminoso polmonare e punteggio patologico di topi transgenici K18 hACE2 infettati da rSARS-CoV-2/Nluc (Figura 2A-C) e rSARS-CoV-2/Venere (Figura 4A-C)<ol>
<li>Dopo aver imaging la bioluminescenza di topi infetti da rSARS-CoV-2 / Nluc, rSARS-CoV-2 / WT e finto-infetti, riportare i topi nelle loro gabbie. Procedere con l'eutanasia e l'imaging a campo luminoso ex vivo dei polmoni dei topi (Figura 2A).</li>
		<li>Dopo aver imaging la fluorescenza ex vivo dei polmoni di topi infetti, acquisire immagini in campo luminoso dei polmoni (Figura 4A).</li>
		<li>Analizzare le lesioni grossolane sulla superficie del polmone utilizzando ImageJ (Figure 2C e 4C).</li>
		<li>Aprire l'immagine polmonare da analizzare in ImageJ.</li>
		<li>Calcola il rapporto tra pixel e cm, usa lo strumento Dritto e misura la lunghezza effettiva dell'immagine.</li>
		<li>Dopo aver selezionato, fare clic su Analizza > Misura per calcolare la lunghezza dei pixel per la lunghezza.</li>
		<li>Fare clic su Analisi > Imposta scala e immettere i numeri calcolati dal passaggio precedente.</li>
		<li>Utilizzate lo strumento Selezioni a mano libera e selezionate l'intera superficie polmonare. Fare clic su Analizza > misura per misurare l'area polmonare totale.</li>
		<li>Fare clic su Modifica > selezione > Crea inverso per selezionare il resto dell'area polmonare, quindi premere Canc o Backspace per rimuovere lo sfondo.</li>
		<li>Rimuovi l'area selezionata, quindi fai clic su Immagine > Regola > soglia colore.</li>
		<li>Per selezionare l'area della lesione patologica, regolare luminosità al minimo (tra 1 e 50) e un massimo (tra 50 e 200), a seconda dei livelli di congestione ed emorragie presenti.</li>
		<li>Una volta selezionate le lesioni patologiche, fare clic su Seleziona nella parte inferiore del pannello colore della soglia, quindi fare clic su Analizza > misura per misurare le aree patologiche.</li>
		<li>Calcolare la percentuale di lesioni grossolane con la formula: % di area patologica = (misurazione dell'area patologica/superficie polmonare totale) x 100.</li>
	</ol></li>
	<li>Titolazioni virali (Figura 2D e Figura 4D)<ol>
<li>Dopo l'imaging, completare l'eutanasia dei topi e raccogliere polmoni, cervello e mucosa nasale.</li>
		<li>Posizionare i polmoni, il cervello e la mucosa nasale in omogeneizzatori di tessuto sterili separati e aggiungere 1 mL di PBS freddo 1x.</li>
		<li>Omogeneizzare i campioni centrifugando a 21.500 x g per 10 minuti a pellet di detriti cellulari. Raccogliere e trasferire i supernatanti in un nuovo tubo sterile ed eliminare il pellet.</li>
		<li>Se le titolazioni virali vengono eseguite lo stesso giorno, conservare i supernatanti a 4 °C. In alternativa, congelare il surnatante dei campioni omogeneizzati a -80 °C fino a quando non viene valutato successivamente.</li>
		<li>Utilizzando i supernatanti ottenuti dagli omogeneizzati tissutali si ottengono diluizioni seriali 10 volte e si infettano monostrati confluenti di cellule Vero E6 con 1 mL di ogni diluizione del surnatante (formato a piastra a 6 pozzetti, 1,2 × 106 cellule/pozzetto, triplicati).</li>
		<li>Lasciare che il virus assorba per 1 ora a 37 °C in un incubatore umidificato al 5% di CO2 .</li>
		<li>Dopo l'adsorbimento virale, lavare le cellule con 1 mL di 1x PBS e incubare in 2 mL di terreno post-infezione contenente l'1% di Agar nell'incubatore umidificato al 5% di CO2 a 37 °C per 72 ore.</li>
		<li>Dopo l'incubazione, inattivare le piastre in formalina tamponata neutra al 10% per 24 ore a 4 °C, assicurarsi che l'intera piastra sia immersa.</li>
		<li>Estrarre le piastre da BSL3 e lavare le celle tre volte con 1 mL di 1x PBS e permeabilizzare con 1 mL di Triton X-100 allo 0,5% per 10 minuti a temperatura ambiente (RT).</li>
		<li>Bloccare le cellule con 1 mL di albumina sierica bovina al 2,5% (BSA) in 1x PBS per 1 ora a 37 °C, seguita da incubazione in 1 mL di 1 μg/mL dell'anticorpo monoclonale cross-reattivo della proteina SARS-CoV (N) (1C7C7), diluito in BSA al 2,5% per 1 ora a 37 °C.</li>
		<li>Lavare le celle tre volte con 1 mL di 1x PBS e sviluppare le placche utilizzando il kit ABC e il kit DAB Peroxidase Substrate secondo le istruzioni del produttore.</li>
		<li>Calcola i titoli virali come PFU / mL. NOTA: Calcolare con la formula PFU/mL = fattore di diluizione x numero di placche x (1 mL/volume dell'inoculo).</li>
	</ol></li>
	<li>Attività di Nluc nei tessuti di topi transgenici K18 hACE2 infettati da rSARS-CoV-2/Nluc (Figura 2E)<ol>
<li>Quantificare la presenza di Nluc negli omogeneizzati d'organo da topi transgenici K18 hACE2 infetti da finti, rSARS-CoV-2 / WT e rSARS-CoV-2 / Nluc utilizzando un test della luciferasi seguendo le istruzioni dei produttori.</li>
	</ol></li>
	<li>Valutazione della morbilità e della mortalità (Figura 2F, G e Figura 4E, F)<ol>
<li>Infettare per via intranasale topi transgenici K18 hACE2 femmina di 4-6 settimane con 105 PFU di rSARS-CoV-2/WT, rSARS-CoV-2/Venus, rSARS-CoV-2/Nluc o infettati finti come descritto al paragrafo 3.1.</li>
		<li>Monitorare e pesare i topi per 12 giorni contemporaneamente per ridurre al minimo la variazione di peso dovuta all'ingestione di cibo. Eutanasia i topi che perdono il 25% del loro peso corporeo iniziale da quando hanno raggiunto un endpoint umano e notano questi topi come soccombere all'infezione virale.</li>
		<li>Dopo 12 giorni, eutanasia dei topi che sopravvivono all'infezione virale e calcola la percentuale di variazione del peso corporeo e della sopravvivenza.</li>
	</ol></li>
</ol>

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<li>Avila-Perez, G., Park, J. G., Nogales, A., Almazan, F., Martinez-Sobrido, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rescue+of+recombinant+Zika+virus+from+a+bacterial+artificial+chromosome+cDNA+clone%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Rescue of recombinant Zika virus from a bacterial artificial chromosome cDNA clone.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (148), e59537(2019).</li>
<li>Chiem, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bifluorescent-based+assay+for+the+identification+of+neutralizing+antibodies+against+SARS-CoV-2+variants+of+concern+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">A bifluorescent-based assay for the identification of neutralizing antibodies against SARS-CoV-2 variants of concern in vitro and in vivo.</a> Journal of Virology. , (2021).</li>
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<li>Ye, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+SARS-CoV-2+infection+dynamic+in+vivo+using+reporter-expressing+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Analysis of SARS-CoV-2 infection dynamic in vivo using reporter-expressing viruses.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (41), (2021).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano che la ricerca è stata condotta in assenza di qualsiasi conflitto di interessi commerciale, finanziario e non finanziario o personale in relazione al lavoro descritto.

Questo protocollo dimostra la fattibilità dell'utilizzo di questi geni reporter che esprimono rSARS-CoV-2 per monitorare le infezioni virali in vivo. Entrambi i virus ricombinanti che esprimono reporter forniscono uno strumento eccellente per studiare le infezioni da SARS-CoV-2 in vivo. I sistemi di imaging ex vivo (rSARS-CoV-2/Venus) e in vivo (rSARS-CoV-2/Nluc) descritti rappresentano un'ottima opzione per comprendere le dinamiche dell'infezione da SARS-CoV-2, la patogenesi virale e ...

La sindrome respiratoria acuta grave coronavirus 2 (SARS-CoV-2) è un virus a RNA avvolto, a senso positivo, a singolo filamento che appartiene al lignaggio Betacoronavirus della famiglia Coronaviridae 1. Questa famiglia virale è divisa in Alpha-, Beta-, Gamma-, e Delta-coronavirus1. Gli alfa e i betacoronavirus infettano principalmente i mammiferi, mentre il gamma e il deltacoronavirus infettano quasi esclusivamente gli uccelli2. Ad oggi, sette coronavirus (CoV) hanno attraversato le barriere delle specie ed sono emersi come coronavirus umani (HCoV): due alfa-CoV (HCoV-229E e HCoV-NL63) e cinque beta-CoV (HCoV-OC43, HCoV-HKU1, SARS-CoV, coronavirus della sindrome respiratoria del Medio Oriente [MERS-CoV] e SARS-CoV-2)3,4,5,6. SARS-CoV, MERS-CoV e SARS-CoV-2 sono altamente patogeni, causando gravi infezioni del tratto respiratorio inferiore7. Prima dell'emergere di SARS-CoV-2, ci sono stati due focolai epidemici causati da CoV: SARS-CoV a Guangdong Providence, in Cina, dal 2002 al 2003, con un tasso di mortalità dei casi (CFR) di circa il 9,7%; e MERS-CoV in Medio Oriente dal 2012 ad oggi, con un CFR di circa il 34%7,8. SARS-CoV-2 ha un CFR complessivo tra il 3,4% e il 49%, con condizioni sottostanti che contribuiscono a un CFR 8,9 più elevato. Dalla sua scoperta nel dicembre 2019, a Wuhan, in Cina, SARS-CoV-2 è stato responsabile di oltre 242 milioni di infezioni umane e oltre 4,9 milioni di morti umane in tutto il mondo 7,10,11,12. In particolare, dalla fine del 2020, le nuove varianti di preoccupazione (VoC) e le varianti di interesse (VoI) di SARS-CoV-2 hanno avuto un impatto sulle caratteristiche del virus, tra cui la trasmissione e l'antigenicità 9,13, e sulla direzione generale della pandemia di COVID-19. Per il trattamento delle infezioni da SARS-CoV-2, attualmente esiste un solo Stati Uniti (USA) Food and Drug Administration (FDA) antivirale terapeutico (remdesivir) e un farmaco di autorizzazione all'uso di emergenza (EUA) (baricitinib, da somministrare in combinazione con remdesivir)14. Ci sono anche 6 anticorpi monoclonali EUA approvati: REGEN-COV (casirivimab e imdevimab, somministrati insieme), sotrovimab, tocilizumab e bamlanivimab ed etesevimab somministrati insieme 15,16,17,18,19. Attualmente esiste un solo vaccino profilattico approvato dalla FDA, Pfizer-BioNTech, e altri due vaccini profilattici (Moderna e Janssen) sono stati approvati dall'EUA 20,21,22,23,24. Tuttavia, con il tasso di infezione incontrollato e l'emergere di VoC e VoI, SARS-CoV-2 rappresenta ancora una minaccia per la salute umana. Pertanto, sono urgentemente necessari nuovi approcci per identificare profilattici e terapie efficienti per controllare l'infezione da SARS-CoV-2 e la pandemia di COVID-19 ancora in corso.
Lo studio di SARS-CoV-2 richiede tecniche laboriose e approcci secondari per identificare la presenza del virus in cellule infette e/o modelli animali di infezione convalidati. L'uso della genetica inversa ha permesso la generazione di virus ricombinanti per rispondere a domande importanti nella biologia delle infezioni virali. Ad esempio, le tecniche di genetica inversa hanno fornito mezzi per scoprire e comprendere i meccanismi di infezione virale, patogenesi e malattia. Allo stesso modo, gli approcci di genetica inversa hanno spianato la strada all'ingegnerizzazione di virus ricombinanti privi di proteine virali per comprendere il loro contributo nella patogenesi virale. Inoltre, sono state utilizzate tecniche di genetica inversa per generare virus ricombinanti che esprimono geni reporter per applicazioni in vitro e in vivo, compresa l'identificazione di approcci profilattici e/o terapeutici per il trattamento delle infezioni virali. Le proteine fluorescenti e bioluminescenti sono i geni reporter più comunemente usati grazie alla loro sensibilità, stabilità e facilità di rilevamento basata sul miglioramento delle nuove tecnologie25,26. In vitro, le proteine fluorescenti hanno dimostrato di servire come opzione migliore per la localizzazione dei virus nelle cellule infette, mentre le luciferasi sono più convenienti per gli studi di quantificazione 27,28,29. In vivo, le luciferasi sono preferite rispetto alle proteine fluorescenti per l'imaging di animali interi, mentre le proteine fluorescenti sono preferite per l'identificazione di cellule infette o l'imaging ex vivo 30,31,32. L'uso di virus ricombinanti che esprimono reporter è servito come un potente strumento per lo studio dei virus in molte famiglie, tra cui, tra gli altri, flavivirus, enterovirus, alfavirus, lentivirus, arenavirus e virus dell'influenza 28,33,34,35,36.
Per superare la necessità di approcci secondari per studiare SARS-CoV-2 e caratterizzare l'infezione da SARS-CoV-2 in tempo reale in vivo, abbiamo generato una riproduzione ricombinante (r)SARS-CoV-2 competente per la replicazione che esprime proteine bioluminescenti (nanoluciferasi, Nluc) o fluorescenti (Venere) utilizzando la nostra genetica inversa basata su cromosomi artificiali batterici (BAC) precedentemente descritta, che viene mantenuta come una singola copia in E. coli al fine di ridurre al minimo la tossicità delle sequenze virali durante la sua propagazione nei batteri37,38. In particolare, rSARS-CoV-2/Nluc e rSARS-CoV-2/Venus hanno mostrato patogenicità simile a rSARS-CoV-2/WT in vivo. L'alto livello di espressione di Venere da rSARS-CoV-2 /Venere ha permesso di rilevare l'infezione virale nei polmoni di topi transgenici K18 hACE2 infetti utilizzando un sistema di imaging in vivo (IVIS)39. I livelli di espressione di Venere si correlavano bene con i titoli virali rilevati nei polmoni, dimostrando la fattibilità dell'uso dell'espressione di Venere come valido surrogato dell'infezione da SARS-CoV-2. Utilizzando rSARS-CoV-2/Nluc, siamo stati in grado di tracciare la dinamica dell'infezione virale in tempo reale e valutare longitudinalmente l'infezione da SARS-CoV-2 in vivo utilizzando lo stesso approccio IVIS nei topi transgenici K18 hACE2.

<table><tbody><tr><td>0,5% Triton X-100</td><td>J.T.Baker</td><td>X198-07</td><td>Conservare a temperatura ambiente (RT)</td></tr><tr><td>1% DEAE-Dextran</td><td>MP Biomedicals</td><td>195133</td><td></td></tr><tr><td>10% Soluzione di formalina, tamponato neutro</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT501128</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Oxoid</td><td>LP0028</td><td></td></tr><tr><td>Piastra per coltura cellulare a 24 pozzetti</td><td>Greiner Bio-one</td><td>662160</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato di sodio al 5%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S-5761</td><td></td></tr><tr><td>Piastra per colture cellulari a 6 pozzetti</td><td>Greiner Bio-one</td><td>657160</td><td></td></tr><tr><td>Piastra per colture cellulari a 96 pozzetti</td><td>Greiner Bio-one</td><td>655-180</td><td></td></tr><tr><td>Cellule epiteliali renali di scimmia verde africana (Vero E6)</td><td>ATCC</td><td>CRL-1586</td><td></td></tr><tr><td>Ami HT</td><td>Spectral Instruments Imaging</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aura Software di imaging 3.2.0</td><td>Spectral Instruments Software</td><td></td> di <td>analisi delle immagini</td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina (BSA), 35%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9647</td><td>Negozio a 4 &deg; C</td></tr><tr><td>Acqua per colture cellulari</td><td>Corning</td><td>25-055-CV</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Eagle modificato' s medio (DMEM)</td><td>Corning Cellgro</td><td>15-013-CV</td><td>Negozio a 4 &deg; C</td></tr><tr><td>Macchina per anestesia a gas</td><td>Veterinary Anesthesia Systems, Inc.</td><td>VAS 2001R</td><td></td></tr><tr><td>Siero Fetale Bovino (FBS)</td><td>Seradigm</td><td>1500-050</td><td>Conservare a -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Topi transgenici K18-hACE2 femmina di età compresa</td> tra quattro e sei settimane <td>The Jackson Laboratory</td><td>34860</td><td></td></tr><tr><td>Graphpad Prism Versione 9.1.0</td><td>GraphPad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Baxter</td><td>1001936040</td><td>Negozio presso RT</td></tr><tr><td>MARS Software di analisi dati</td><td>BMG LABTECH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MB10 compresse</td><td>QUIP Laboratories</td><td>MBTAB1.5</td><td>Negozio su RT</td></tr><tr><td>Reagente per il saggio della luciferasi nano-Glo</td><td>Promega</td><td>N1110</td><td>Questo reagente viene utilizzato per misurare l'attività di Nluc. Conservare a -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Nunc MicroWell Micropiastre a 96 pozzetti</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>269620</td><td></td></tr><tr><td>Nunc MicroWell Micropiastre a 96 pozzetti</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>269620</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina/Streptomicina/L-glutammina (PSG) 100x</td><td>Corning</td><td>30-009-CI</td><td>Conservare a -20 &deg; C</td></tr><tr><td>PHERAstar FSX</td><td>BMG LABTECH</td><td>PHERAstar FSX</td><td></td></tr><tr><td>Precelleys Omogeneizzatore Evolution</td><td>Bertin Instruments</td><td>P000062-PEVO0-A Omogeneizzante</td><td></td></tr><tr><td>per tessuti molli CK14 - 7 mL</td><td>Bertin Instruments</td><td>P000940-LYSK0-A</td><td></td></tr><tr><td>T75 EasYFlask</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>156499</td><td></td></tr><tr><td>VECTASTAIN ABC-HRP Kit, perossidasi</td><td>Kit</td><td>PK-4002</td> ABC di Vector Laboratories <td>e kit substrato DAB perossidasi</td></tr></tbody></table>

imaging dal vivo e quantificazione dell'infezione virale in topi transgenici k18 hace2 utilizzando sars-cov-2 ricombinante che esprime reporter

Live Imaging and Quantification of Viral Infection in K18 hACE2 Transgenic Mice Using Reporter-Expressing Recombinant SARS-CoV-2

La pandemia di coronavirus 2019 (COVID-19) è stata causata dalla sindrome respiratoria acuta grave coronavirus 2 (SARS-CoV-2). Ad oggi, SARS-CoV-2 è stato responsabile di oltre 242 milioni di infezioni e più di 4,9 milioni di morti in tutto il mondo. Analogamente ad altri virus, lo studio del SARS-CoV-2 richiede l'uso di metodi sperimentali per rilevare la presenza di virus in cellule infette e/o in modelli animali. Per superare questa limitazione, abbiamo generato una ricombinante (r)SARS-CoV-2 competente per la replicazione che esprime proteine bioluminescenti (nanoluciferasi, Nluc) o fluorescenti (Venus). Questi rSARS-CoV-2 che esprimono reporter consentono di tracciare le infezioni virali in vitro e in vivo sulla base dell'espressione dei geni reporter Nluc e Venus. Qui lo studio descrive l'uso di rSARS-CoV-2 / Nluc e rSARS-CoV-2 / Venere per rilevare e tracciare l'infezione da SARS-CoV-2 nell'enzima murino transgenico K18 K18 umano di conversione dell'angiotensina 2 (hACE2) precedentemente descritto utilizzando sistemi di imaging in vivo (IVIS). Questo rSARS-CoV-2/Nluc e rSARS-CoV-2/Venus mostrano patogenicità rSARS-CoV-2/WT-like e replicazione virale in vivo. È importante sottolineare che l'espressione di Nluc e Venere ci consente di tracciare direttamente le infezioni virali in vivo ed ex vivo, nei topi infetti. Questi rSARS-CoV-2/Nluc e rSARS-CoV-2/Venus rappresentano un'opzione eccellente per studiare la biologia di SARS-CoV-2 in vivo, per comprendere l'infezione virale e la malattia COVID-19 associata e per identificare efficaci trattamenti profilattici e / o terapeutici per combattere l'infezione da SARS-CoV-2.

Infezione da rSARS-CoV-2/Nluc in topi transgenici K18 hACE2 (Figure 1 e 2) La Figura 1A mostra una rappresentazione schematica di rSARS-CoV-2/WT (in alto) e rSARS-CoV-2/Nluc (in basso) utilizzati per valutare le infezioni in vivo. La Figura 1B mostra il diagramma di flusso schematico applicato per valutare la dinamica dell'infezione da rSARS-CoV-2/Nluc nei topi transgenici K18 hACE2. Top...

Questo protocollo descrive la dinamica delle infezioni virali utilizzando la luciferasi e la fluorescenza che esprimono la ricombinante (r)SARS-CoV-2 e un sistema di imaging in vivo (IVIS) in topi transgenici K18 hACE2 per superare la necessità di approcci secondari necessari per studiare le infezioni da SARS-CoV-2 in vivo.

Imaging dal vivo e quantificazione dell'infezione virale in topi transgenici K18 hACE2 utilizzando SARS-CoV-2 ricombinante che esprime reporter

The coronavirus disease 2019 (COVID-19) pandemic has been caused by severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2). To date, SARS-CoV-2 has ...

Il nostro protocollo ha descritto l'uso di SARS-CoV-2 ricombinante fluorescente o luminescente per il rilevamento virale di imaging live in vivo ed ex vivo e il tracciamento virale nel modello murino transgenico ACE2 umano K18 dell'infezione da SARS-CoV-2. Il vantaggio principale di questa tecnica è l'applicazione e la fattibilità del rilevamento e del tracciamento virale per studi in vivo ed ex vivo di SARS-CoV-2 nel modello murino transgenico ACE2 umano K18. L'uso dell'imaging in vivo di SARS-CoV-2 nel modello murino transgenico DI ACE2 umano K18 rappresenta un'opzione eccellente per valutare le terapie per il trattamento dell'infezione da SARS-CoV-2 in vivo.L'implementazione dei reporter SARS-CoV-2 rappresenta un'opzione eccellente per valutare la patogenicità, la replicazione virale e il trofismo in vivo. Per gli studi in vivo con luciferasi che esprime SARS-CoV-2, si raccomanda la rasatura dei topi e l'imaging tempestivo dopo l'iniezione del substrato per migliorare il segnale di bioluminescenza. Iniziare il monitoraggio della bioluminescenza avviando il sistema di imaging in vivo, o IVIS, e impostando i parametri, fare clic sulla modalità immagine su Bioluminescenza, quindi aprire il filtro e impostare il tempo di esposizione su Auto.Quindi, rimuovere un topo già rasato e anestetizzato dalla camera di isolamento e utilizzare un ago calibro 25 per somministrare retro-orbitalmente 100 microlitri del substrato della luciferasi diluiti da 1 a 10 in PBS al topo. Quindi riposizionare il mouse nella camera di isolamento, trasferire la camera di isolamento alla macchina IVIS, dotata di un componente di riscaldamento per prevenire l'ipotermia, e chiudere lo sportello dell'imager IVIS per inizializzare l'imaging selezionando Acquisisci nel programma software. Per analizzare le immagini di bioluminescenza acquisite, utilizzare lo strumento ROI o regione di interesse nel software per designare il segnale preciso e misurare il flusso.Avviare il software di imaging e impostare i parametri. Fare clic sulla modalità immagine su Fluorescenza, impostare l'eccitazione a 500 nanometri e i filtri di emissione a 530 nanometri e impostare il tempo di esposizione su Auto. Condurre necroscopia e asportare i polmoni dai topi.Posizionare i polmoni asportati in una piastra a 6 pozzetti contenente due millilitri di 1X PBS e risciacquare per rimuovere il sangue in eccesso. Disinfettare e pulire gli strumenti chirurgici tra i campioni utilizzando il 70% di etanolo. Dopo aver inizializzato la macchina IVIS, posizionare i polmoni su un foglio nero e separare i tessuti l'uno dall'altro.Quindi posizionare il vassoio all'interno della camera di isolamento all'interno dell'armadio di biosicurezza e quindi trasferire la camera di isolamento all'IVIS. Chiudere la porta dell'imager IVIS e fare clic su Acquisisci per avviare il sistema di imaging. Per analizzare la fluorescenza, utilizzare lo strumento ROI e disegnare ROI attorno a ciascuno dei singoli polmoni.Misurare manualmente ogni ROI e quindi utilizzare i valori medi di efficienza radiante forniti e sottrarre dai topi finti infetti. Una volta completata l'imaging, posizionare i tessuti in un criotubo per il congelamento del ghiaccio secco da conservare a meno 80 gradi Celsius per una successiva elaborazione. Utilizzando il supernato ottenuto dagli omogeneizzati tissutali, eseguire una diluizione seriale decuplicata e infettare monostrati confluenti di cellule Vero E6 con un millilitro di ciascuna diluizione surnatante in triplicati.Lasciare che il virus assorba per un'ora a 37 gradi Celsius in un incubatore di anidride carbonica umidificato al 5%. Una volta fatto, lavare le cellule con un millilitro di 1X PBS e quindi incubare le cellule in due millilitri di mezzi post-infezione contenenti l'1% di agar nell'incubatore di anidride carbonica umidificato al 5% a 37 gradi Celsius per 72 ore. Dopo l'incubazione, inattivare le piastre in formalina tamponata neutra al 10% per 24 ore a quattro gradi Celsius, assicurandosi che l'intera piastra sia sommersa.Estrarre le piastre dal livello di biosicurezza tre e lavare le cellule tre volte con un millilitro di 0,5% Triton X-100 per 10 minuti a temperatura ambiente. Successivamente, bloccare le cellule permeabilizzate con un millilitro di 2,5 albumina sierica bovina o BSA e PBS per un'ora a 37 gradi Celsius seguita da incubazione in un millilitro di un microgrammo per millilitro dell'anticorpo monoclonale cross-reattivo della proteina nucleocapside SARS-CoV 1C7C7 diluito in 2,5 BSA per un'ora a 37 gradi Celsius. Lavare le cellule tre volte con un millilitro di 1X PBS e sviluppare le placche utilizzando i kit di substrato di perossidasi ABC e diaminobenzene, o DAB, secondo le istruzioni del produttore, quindi calcolare i titoli virali come unità di formazione della placca per millilitro.Nello studio, è stato osservato che la nanoluciferasi bioluminescente, o Nluc, era facilmente rilevabile e i topi infettati con rSARS-CoV-2 Nluc, ma non quelli infettati da rSARS-CoV-2 wild-type o finto infettati. Le analisi quantitative hanno mostrato l'intensità di Nluc in diversi giorni dopo l'infezione. Le lesioni grossolane sulla superficie polmonare di topi infetti da rSARS-CoV-2 Nluc erano paragonabili a quelle del gruppo infetto da rSARS-CoV-2 wild-type.Inoltre, i titoli virali rilevati e i topi infetti da rSARS-CoV-2 Nluc erano paragonabili a quelli infettati da rSARS-CoV-2 wild-type in tutti gli organi in diversi giorni dopo l'infezione. Allo stesso tempo, l'attività di Nluc è stata rilevata solo negli organi di topi infetti da rSARS-CoV-2 Nluc. Un gruppo separato di finti topi infetti e infettati da virus è stato monitorato per 12 giorni per i cambiamenti nel peso corporeo e nella sopravvivenza.I topi infettati da rSARS-CoV-2 Nluc e rSARS-CoV-2 wild-type hanno perso fino al 25% del loro peso corporeo e tutti soccombono all'infezione virale tra sette e otto giorni dopo l'infezione. Dopo l'infezione da Venere rSARS-CoV-2, l'espressione di Venere è stata prontamente rilevata in tutti i polmoni da topi infetti da rSARS-CoV-2 Venere, ma non quelli infettati da rSARS-CoV-2 wild-type o finto infetti. Le analisi quantitative hanno mostrato che l'intensità di Venere raggiunge il picco a due giorni dopo l'infezione e diminuisce nel corso dell'infezione e dei polmoni dei topi infetti.Le immagini della superficie polmonare hanno rivelato lesioni grossolane di topi infetti da rSARS-CoV-2 Venere era paragonabile a quella di topi infetti da rSARS-CoV-2 wild-type. Inoltre, l'infezione da rSARS-CoV-2 Venus ha provocato titoli virali comparabili a quelli osservati nei topi infetti da rSARS-CoV-2 wild-type in tutti gli organi. I topi infettati da rSARS-CoV-2 Venus e rSARS-CoV-2 wild-type hanno perso fino al 25% del loro peso corporeo e soccombono all'infezione virale entro il nono giorno dopo l'infezione senza sopravvivenza.I risultati del reporter che esprime SARS-CoV-2 hanno dimostrato di essere validi surrogati dell'infezione virale. Pertanto, ciò potrebbe portare a una rapida identificazione e valutazione delle contromisure per il trattamento dell'infezione da SARS-CoV-2.

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Imaging dal vivo e quantificazione dell'infezione virale in topi transgenici K18 hACE2 utilizzando SARS-CoV-2 ricombinante che esprime reporter

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