Modellazione di microrganismi e microparticelle attraverso l'assemblaggio sequenziale assistito da capillarità

Questo metodo consente di produrre modelli di microrganismi definiti dall'utente all'interno di un canale microfluidico. Una volta modellati, i microrganismi possono essere monitorati per valutare la loro fisiologia a lungo termine e l'interazione con un alto rendimento. L'uso di forze capillari consente un percorso non specifico per la modellazione, che è applicabile a diverse classi di materiali.

Ad esempio, particelle colloidali e batteri. Inoltre, consente di produrre grandi array con un controllo squisito della disposizione spaziale del materiale di interesse. Ad oggi, abbiamo testato e applicato il metodo su particelle colloidali e cellule microbiche.

Di conseguenza, può trovare applicazioni nell'ingegneria dei materiali e campi che richiedono analisi quantitative a singola cellula come lo screening farmacologico. Per iniziare, preparare una miscela PDMS mescolando l'elastomero con il suo agente reticolante. Quindi mescolare vigorosamente la miscela per fondere i due componenti in modo uniforme fino a quando non si formano bolle d'aria e la miscela PDMS appare opaca.

Ora, degassare la miscela in un essiccatore sottovuoto fino a quando tutte le bolle d'aria non vengono rimosse e la miscela appare di nuovo trasparente. Per ottenere un pavimento modello di 400 micrometri di spessore del chip microfluidico, versare tre grammi della miscela sul master di silicio e posizionare il master di silicio su una cappottatrice di centrifuga per girare il rivestimento a 21 volte G per cinque secondi e 54 volte G per 10 secondi. Degas di nuovo per rimuovere le bolle d'aria intrappolate come descritto in precedenza.

Versare 20 grammi della miscela PDMS nello stampo stampato in 3D per creare il microcanale che fungerà da tetto del chip microfluidico e degasarlo per 30 minuti come descritto in precedenza. Cuocere il wafer di silicio e lo stampo stampato in 3D a 70 gradi Celsius per almeno due ore, quindi tagliare il PDMS lungo il contorno dello stampo stampato in 3D e staccarlo. Tagliare il PDMS con una lama attorno ai microcanali e perforare i fori che serviranno come ingresso e uscita del canale microfluidico.

Ora taglia il PDMS e staccalo dal master in silicio e taglia lo strato PDMS in pezzi più piccoli con le stesse dimensioni dei canali microfluidici che saranno incollati sopra i modelli. Strofinare delicatamente i modelli e i microcanali utilizzando una soluzione detergente all'1% per cinque minuti e quindi risciacquare con acqua deionizzata. Quindi, risciacquare i modelli e i microcanali con isopropanolo, prima di risciacquarli con acqua deionizzata.

Ora asciugare le sagome e i microcanali a temperatura ambiente per un minuto con aria compressa a una barra. Posizionare le sagome e i microcanali in un detergente al plasma con le superfici di incollaggio rivolte verso l'alto. Dopo aver acceso il pulitore al plasma, il plasma tratta i modelli e i microcanali per 40 secondi, quindi estraeli dal pulitore al plasma e incolla immediatamente i microcanali sopra i modelli.

Conservare i chip microfluidici in un forno a 70 gradi Celsius per cinque giorni per garantire il recupero idrofobo pdMS. Il giorno dell'esperimento, impostare l'incubatore della scatola a 37 gradi Celsius diverse ore prima dell'esperimento, quindi impostare la pompa della siringa e la lastra di vetro riscaldata sul palco del microscopio, impostando la stessa temperatura di quella dell'incubatore della scatola. 90 minuti prima dell'esperimento, mettere il chip microfluidico in un recipiente pieno di etanolo al 100% e lavare il canale con etanolo al 100% per almeno 10 minuti, quindi posizionare il chip microfluidico in un essiccatore a vuoto e degasare per almeno 30 minuti.

Ora scambia l'etanolo con acqua distillata e tratta sottovuoto il chip per almeno 30 minuti. Mettere il chip microfluidico nel forno a 70 gradi Celsius per 10 minuti per rimuovere eventuali tracce di liquido lasciate nel canale. Pipettare un millilitro di mezzo MOPS in un flaconcino di centrifuga e aggiungere 10 microlitri di 0,132 fosfato di potassio molare.

Aliquota 100 microlitri della coltura notturna nel flaconcino della centrifuga e centrifugare la coltura a 2.300 volte G per due minuti. Scartare delicatamente il surnatante per risospese il pellet in un millilitro di mezzo MOPS fresco con lo 0,015% di Tween 20 e lo 0,01% di fosfato di potassio e caricare la sospensione batterica in una siringa da un millilitro. Per fissare la siringa e il collegamento del tubo, inserire direttamente un ago nel tubo.

Ora montare la siringa sulla pompa della siringa e iniettare la sospensione nel chip microfluidico attraverso l'ingresso situato nella parte a monte del canale fino a quando la sospensione copre la regione del modello con trappole. Impostare la pompa della siringa a una portata compresa tra 0,07 e 0,2 microlitri al minuto per prelevare la sospensione batterica e monitorare il processo di modellazione tramite il software del microscopio. Una volta che il modello è stato modellato con celle, aumentare la portata di prelievo per svuotare rapidamente il canale microfluidico e sciacquarlo con LB fresco che è stato precedentemente degassato per almeno 30 minuti e preriscaldato a 30 gradi Celsius.

Ora impostare la pompa della siringa a una portata di due microlitri al minuto per lavare delicatamente il canale. Una volta riempito il canale, aumentare nuovamente la portata. Acquisire immagini di batteri in crescita all'ingrandimento desiderato e all'intervallo di tempo.

Pipettare 900 microlitri di una soluzione acquosa 0,015% Tween 20 in un flaconcino di centrifuga e quindi pipettare 100 microlitri della sospensione colloidale originale in esso. Centrifugare la sospensione a 13.500 volte G per un minuto e sostituire delicatamente il surnatante con la soluzione acquosa di Tween 20. Caricare la sospensione colloidale in una siringa da un millilitro e collegare la siringa al chip tramite tubi microfluidici.

Iniettare la sospensione nel chip microfluidico attraverso l'ingresso situato all'interno della sezione centrale nella parte a monte del canale e spingere gradualmente la sospensione fino a coprire il modello. Prelevare la sospensione colloidale a una portata compresa tra 0,07 e 0,2 microlitri al minuto e visualizzare il processo di modellazione tramite il software del microscopio. Aumentare la portata una volta che il menisco raggiunge rapidamente la fine del modello.

La geometria del canale rettilineo è stata sfruttata per modellare cellule stazionarie a fasi di un ceppo fluorescente di Escherichia coli depositando l'83% delle 5.000 trappole analizzate. I batteri modellati hanno ripreso la crescita in momenti diversi entro 1,5 ore da quando il canale è stato riempito con LB fresco. Una volta ripresa la crescita, le singole cellule batteriche hanno iniziato a formare singole colonie che si sono espanse fino a formare uno strato superficiale e la risoluzione della singola cellula è stata persa. L'analisi condotta su 55.000 trappole ha mostrato che i dimeri verde-rosso costituiti da particelle di due e un micrometro di diametro si sono formati rispettivamente nel 93% e nell'89% delle trappole analizzate.

E i trimmer verde-rosso-verde si sono formati nel 52% delle trappole. La distanza tra le particelle modellate può essere controllata con precisione eseguendo due deposizioni in direzioni opposte, intrappolando così tali particelle alle estremità opposte di ciascuna trappola. È importante garantire una temperatura uniforme in tutto il modello per evitare la condensa durante il processo di modellazione.

A tal fine, posizioniamo una lastra di vetro riscaldata sotto il modello e la impostiamo alla stessa temperatura dell'incubatore della scatola. Questo metodo può essere utilizzato in una varietà di studi biologici che coinvolgono l'analisi quantitativa di singole cellule. Un vantaggio unico è la sua natura ad alto rendimento che consente la modellazione di migliaia di celle fornendo grandi statistiche all'interno della stessa arena sperimentale.