Un semplice chip microfluidico per la crescita a lungo termine e l'imaging di Caenorhabditis elegans

Il vantaggio principale di questa tecnica è che l'animale può crescere liberamente all'interno del dispositivo e può essere intrappolato per l'imaging ad alta risoluzione. Il dispositivo può essere riutilizzato più volte. Durante la realizzazione del dispositivo, la pulizia è il fattore più importante per poter fabbricare dispositivi privi di polvere per evitare perdite durante le operazioni del dispositivo.

Per iniziare a progettare il modello uno per lo strato di flusso e il modello due per il livello di controllo utilizzando forme rettangolari in un software di elaborazione testi e stampare le maschere fotografiche con l'aiuto di un plotter laser con una dimensione minima delle caratteristiche di otto micrometri su pellicola a base di poliestere. Tagliare i wafer di silicio in pezzi quadrati di 2,5 centimetri di altezza e larghezza. Pulirli con idrossido di potassio al 20% per un minuto e sciacquare i wafer in acqua deionizzata.

Utilizzare un wafer per il flusso e l'altro per il livello di controllo. Asciugare i pezzi con 14 gas azoto compresso P-S-I seguito da disidratazione su una piastra calda a 120 gradi Celsius per quattro ore. Dopo il raffreddamento, prendi un pezzo di silicio, mettilo sul mandrino di un codificatore di rotazione e accendi l'aspirapolvere per tenere il wafer in posizione.

Mettere circa 20 microlitri di esametildisilano sul pezzo di silicio e rivestirlo utilizzando il codificatore di rotazione a 500 R-P-M per cinque secondi seguito da 3000 R-P-M per 30 secondi. Per ottenere uno spessore fotoresist uniforme di circa 40 micrometri specifico per lo strato di flusso, rivestire il wafer di silicio con circa 1,5 millilitri di fotoresist negativo utilizzando uno spin coder a 500 R-P-M per cinque secondi seguito da 2000 R-P-M per 30 secondi. Ripetere il rivestimento del pezzo di silicio con esametildisilano e negativo fotoresist uno per il secondo wafer per ottenere uno spessore fotoresist uniforme di circa 40 micrometri specifico per lo strato di controllo.

In alternativa, per aumentare lo spessore dello strato di flusso a circa 80 micrometri per gli animali più anziani, rivestire wafer di silicio con circa 1,5 millilitri di fotoresist negativo due, utilizzando lo spin coder a 500 R-P-M per cinque secondi seguito da 2000 R-P-M per 30 secondi. Cuocere entrambi i pezzi di silicone precedentemente rivestiti di fotoresist su una piastra calda a 65 gradi Celsius per un minuto seguito da 95 gradi Celsius per 10 minuti. Dopo il raffreddamento, posizionare i pezzi di silicone cotto morbido sullo stadio di esposizione dell'illuminatore U-V con la superficie rivestita di fotoresist rivolta verso la lampada U-V.

Esporre i due pezzi separatamente a U-V per 15 secondi utilizzando una lampada da 200 watt attraverso una maschera fotografica con modelli uno e due per ottenere rispettivamente livelli di flusso e controllo. Cuocere i due pezzi di silicone esposti come descritto in precedenza con strati rivestiti rivolti verso l'alto. Dopo aver raffreddato i pezzi, sviluppare i modelli immergendo i pezzi di silicone nella soluzione di sviluppo photoresist per 20 minuti.

Una volta che il motivo è visibile, sciacquare i pezzi con alcool isopropilico puro e asciugare delicatamente con azoto gassoso. Tenere i pezzi di silicone in un essiccatore con la superficie rivestita rivolta verso l'alto. Esporre i pezzi a vapori di silano versando 50 microlitri di T-C-P-F-O-S puro su un vetrino.

Posizionare il vetrino all'interno di un essiccatore e incubare per due ore. Preparare P-D-M-S in un bicchiere di plastica mescolando la base di elastomero con l'agente polimerizzante e mescolare costantemente per tre minuti. Degasare la miscela P-D-M-S in un essiccatore per 30 minuti per rimuovere tutte le bolle d'aria.

Posizionare i wafer di silicio dello strato di controllo in una piastra di Petri e versare uno strato di miscela P-D-M-S spesso cinque millimetri sui pezzi di silicio. Dopo il processo di versamento P-D-M-S, ripetere il degasaggio della miscela P-D-M-S. Posizionare il wafer di silicio con lo strato di flusso rivolto verso il carrello spinner applicando una pressione del vuoto da 200 a 500 millitorr.

Versare circa un millilitro di P-D-M-S sul wafer di silicio. Codificalo usando uno spin coater per ottenere uno strato di circa 80 micrometri di spessore. Cuocere i due wafer di silicio con il P-D-M-S rivestito di spin e versare gli strati P-D-M-S a 50 gradi Celsius in un forno a convezione ad aria calda per sei ore.

Dopo il raffreddamento, tagliare lo strato P-D-M-S spesso cinque millimetri dal pezzo di silicio attorno allo strato di controllo usando una lama affilata e staccarlo dal substrato di silicio. Perforare due fori di circa un millimetro di diametro utilizzando un perforatore Harris nel serbatoio del blocco P-D-M-S per collegare il canale di immobilizzazione e le prese del canale di isolamento alle tubazioni del gas per le deflessioni della membrana P-D-M-S. Posizionare il pezzo di silicone con lo strato P-D-M-S rivestito di spin sul modello uno con la superficie rivestita P-D-M-S rivolta verso l'alto su un vassoio di plastica.

Tenere il blocco P-D-M-S perforato con il modello due sul vassoio con il lato stampato rivolto verso l'alto. Tenere il vassoio di plastica all'interno di un detergente al plasma ed esporre le due superfici P-D-M-S a 18 watt di plasma d'aria per due minuti applicando un vuoto basso. Estrarre i due blocchi trattati al plasma e legarli delicatamente premendo insieme le superfici trattate al plasma dei modelli uno e due.

Cuocere i modelli incollati a 50 gradi Celsius per due ore in un forno a convezione ad aria calda. Dopo aver estratto il dispositivo incollato dal forno, ritagliarlo dal wafer di silicio con modello uno e modello due e perforare i fori nei serbatoi di ingresso e uscita dello strato di flusso usando il perforatore Harris. Posizionare il blocco P-D-M-S incollato con lo strato di flusso rivolto verso l'alto su un vassoio di plastica e tenere un vetro di copertura pulito sullo stesso vassoio.

Esporre i blocchi nel vetro di copertura al plasma d'aria da 18 watt per due minuti. Regolare la pressione del vuoto per vedere una camera viola. Posizionare il blocco P-D-M-S esposto al plasma sul vetro di copertura e cuocere la struttura incollata in forno a 50 gradi Celsius per due ore.

Conservare il dispositivo in una camera bianca per eventuali esperimenti futuri. Prendi il dispositivo, mettilo su un microscopio stereo e attacca i tubi. Collegare un tubo microflex a una linea di gas azoto compresso e un connettore a tre vie sull'altra estremità.

Collegare i tubi uno e due dei connettori a tre vie alla trappola rispettivamente nelle membrane isolanti. Collegare due tubi microflex alle due porte di uscita del rubinetto di arresto a tre vie. Collegare l'altra estremità dei due tubi a un ago lungo otto millimetri da 18 gauge.

Riempire lo strato di flusso con tampone M-9 utilizzando una micro pipetta attraverso la porta di ingresso. Riempire entrambi i tubi con acqua deionizzata attraverso l'estremità collegata all'ago. Inserire i due aghi nei fori perforati che collegano la membrana isolante e intrappolante.

Aprire il regolatore di gas azoto a 14 P-S-I e ruotare la valvola a tre vie dal tubo uno per spingere l'acqua nel dispositivo attraverso i canali microfluidici negli strati di controllo, vale a dire le membrane di intrappolamento e isolamento. Rilasciare la pressione utilizzando il rubinetto a tre vie, una volta che i canali sono riempiti d'acqua e adescati. Rimuovere le bolle facendo scorrere altri supporti attraverso il canale di flusso.

La figura mostra immagini di P-S-3-2-3-9, animale che cresce all'interno del chip microfluidico e immobilizzato ogni otto-10 ore per catturare immagini di fluorescenza. La variazione nel pattern di espressione rappresenta un esempio di regolazione genica temporale in cui lo stesso gene è espresso in cellule diverse in diversi stadi di sviluppo. L'imaging del genotipo individuale W-D-I-S-5-1 di caenorhabditis elegans mostra un'architettura dendritica ramificata simile alla menorah in ciascun neurone P-V-D che comprende processi terziari primari, secondari e quaternari rispettivamente negli stadi di sviluppo L-2, L-2 tardivi e L-3 e L-4.

La figura qui riportata confronta lo sviluppo di P-V-D e gli animali cresciuti con dispositivi e quelli cresciuti su piastre N-G-M. Il numero di S-P e Q-P nelle diverse fasi dello sviluppo del verme è aumentato con l'età. Caenorhabditis elegans è stato trattato con una goccia di tre levamisolo millimolare per causare la paralisi sufficiente necessaria per l'imaging ad alta risoluzione.

I valori di S-P non erano significativamente diversi quando misurati da animali simili allevati su piastre N-G-M e ripresi utilizzando tre levamisolo millimolari su un vetrino di Agar. Inoltre, la distanza tra i due corpi cellulari P-V-C, uno presente nella coda e il secondo presente vicino alla vulva, aumenta man mano che si allontanano sia negli animali cresciuti nel dispositivo che in quelli cresciuti su piastre N-G-M. La figura rappresenta l'immagine ad alta risoluzione dei neuroni del recettore tattile degli animali che crescono all'interno del dispositivo microfluidico.

Il montaggio rappresenta l'intero processo neuronale P-L-M-R in punti temporali successivi evidenziando i mitocondri e il processo neuronale. Il grafico rappresenta la lunghezza totale del processo neuronale che è stato osservato aumentare con una pendenza di 10,4 micrometri all'ora. Il dispositivo microfabbricato utilizza una sottile membrana P-D-M-S deviata in presenza di azoto gassoso ad alta pressione per immobilizzare e mantenere i C-elegans in posizione per l'imaging ad alta risoluzione.

Questa procedura può consentire studi longitudinali dei processi cellulari e subcellulari in C-elegans che richiedono osservazioni intermittenti per un lungo periodo di tempo.