Rilevamento di epitopi sensibili alla neutralizzazione in antigeni visualizzati su vaccini basati su particelle simili a virus (VLP) utilizzando un test di cattura
10 febbraio 2022
Qui, presentiamo un protocollo per rilevare epitopi di neutralizzazione su particelle simili a virus che visualizzano l'antigene (VLP). L'immunoprecipitazione dei VLP derivati dal virus dell'immunodeficienza umana (HIV) viene eseguita utilizzando anticorpi monoclonali specifici della glicoproteina dell'involucro accoppiati a perle magnetiche coniugate con proteina G. I VLP catturati vengono successivamente sottoposti all'analisi SDS-PAGE e Western blot utilizzando anticorpi specifici della proteina virale Gag.
Nel mio laboratorio, sviluppiamo sistemi di produzione per vettori virali e particelle simili a virus, o vaccini basati su VLP. Il test di cattura VLP consente il rilevamento molto sensibile degli antigeni bersaglio visualizzati sui VLP. In questo test, utilizziamo anticorpi ampiamente neutralizzanti diretti contro gli epitopi di neutralizzazione per dimostrare l'esposizione di questi epitopi sulla superficie VLP.
Questa è un'importante valutazione della qualità per i candidati vaccini, poiché solo i VLP che mostrano epitopi sensibili alla neutralizzazione saranno in grado di suscitare una risposta anticorpale neutralizzante nei vaccinati. Inizia sospendendo le perline magnetiche tubando su e giù o mescolando su un rotatore a 50 RPM per almeno cinque minuti. Nel frattempo, preparare la soluzione anticorpale contenente i bNAB.
Utilizzare 10 microgrammi di ogni bNAB in 200 microlitri di legame anticorpale e tampone di lavaggio per reazione. Per ogni reazione, trasferire 50 microlitri della soluzione di perline magnetiche in un tubo di reazione da 1,5 millilitri, quindi posizionare i tubi sul rack di separazione magnetica. Attendere che le perline si raccolgano sulla palla del tubo per assicurarsi che tutte le perline siano raccolte, quindi rimuovere il surnatante.
Rimuovere il magnete e sospendere le perline in 200 microlitri della soluzione bNAB precedentemente preparata. Incubare per 30 minuti a tre ore mentre si mescola su un rotatore a 50 RPM a temperatura ambiente. Dopo l'incubazione, posizionare i tubi di reazione nel rack di separazione magnetica, attendere e rimuovere il surnatante.
Rimuovere i tubi dal magnete e lavare le perline sospendendo nuovamente in 200 microlitri di legame anticorpale e tampone di lavaggio. Ripetere il lavaggio con legante anticorpale e tampone di lavaggio, rimuovendo il più possibile il tampone di lavaggio al termine. Aggiungere i campioni ai bNAB con perline.
Se il volume del campione aggiunto è inferiore a un millilitro, aggiungere PBS per regolare il volume del campione a un millilitro, quindi sospendere nuovamente le perline mediante pipettaggio delicato. Incubare i campioni e le perline per 2,5 ore su un rotatore a temperatura ambiente, assicurandosi che le perline rimangano in sospensione e che la soluzione venga accuratamente miscelata durante l'incubazione. Posizionare i tubi sul magnete e rimuovere il surnatante, quindi lavare le perle magnetiche sospendendole in 200 microlitri di tampone di lavaggio.
Sospendere le perline in 100 microlitri di tampone di lavaggio e trasferire la sospensione in un tubo di reazione pulito e resistente al calore. Posizionare il tubo sul rack di separazione magnetica e rimuovere completamente il surnatante. Per preparare campioni STS-PAGE denaturati, sospendere le perline in 20-80 microlitri del tampone Laemmli e incubare a 95 gradi Celsius per cinque minuti.
Procedere direttamente con SDS-PAGE, posizionando i tubi su un rack magnetico per separare le perline dalla soluzione. In alternativa, conservare i campioni a meno 20 gradi Celsius. Un risultato rappresentativo dei VLP catturati per la prima volta da surnatante di coltura cellulare senza cellule e pellet VLP utilizzando bNAB, e successivamente sottoposti ad analisi Western blot per rilevare proteine core virali, è mostrato qui.
Le perle utilizzate per il test di cattura sono state rivestite con tre diversi bNAB diretti contro gli epitopi di neutralizzazione delle glicoproteine dell'involucro e anticorpi isotipici che fungono da controlli negativi. Utilizzando perline rivestite con anticorpi isotopici, nessuna proteina Gag è stata rilevabile in campioni VLP contenenti VLP calvi, cioè VLP Env-negativi o VLP che mostrano Env, dimostrando che il legame aspecifico dei VLP alle perline rivestite con anticorpi umani non ha mediato la cattura VLP. Anche i VLP calvi non erano legati da perline rivestite di bNAB e, di conseguenza, nessuna proteina Gag era rilevabile nell'analisi Western blot.
Al contrario, tutti e tre i bNAB hanno catturato VLP che mostravano proteine Env, pertanto, le proteine Gag sono state prontamente rilevate, dimostrando la presenza di epitopi di neutralizzazione nelle Env-glicoproteine visualizzate sui VLP. Cruciale per il successo del test: una miscelazione accurata di VLP con perline rivestite di anticorpi. Ciò si ottiene al meglio utilizzando volumi superiori a 500 microlitri in rotazione.
In alternativa, i VLP catturati possono essere eluiti in condizioni non riducenti. Ciò consente l'analisi di VLP utilizzando la microscopia immunoelettronica o lo studio degli antigeni visualizzati utilizzando PAGE nativo.
Panoramica
Questo articolo presenta un protocollo per il rilevamento di epitopi di neutralizzazione su particelle simili a virus (VLPs) mediante un saggio di cattura. Il metodo utilizza anticorpi neutralizzanti ampiamente reattivi (bNABs) per valutare l'esposizione di questi epitopi, aspetto fondamentale per la valutazione di candidati vaccini.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Immunologia
- Sviluppo di Vaccini
- Virologia
Sfondo
- Le particelle simili a virus (VLPs) sono importanti per lo sviluppo di vaccini.
- Gli epitopi di neutralizzazione sono fondamentali per indurre una risposta immunitaria.
- Gli anticorpi neutralizzanti a spettro ampio possono essere utilizzati per rilevare questi epitopi.
- La valutazione della qualità delle VLPs è essenziale per identificare candidati vaccini efficaci.
Scopo dello studio
- Sviluppare un saggio sensibile per rilevare epitopi di neutralizzazione su VLP.
- Dimostrare l'importanza di questi epitopi nell'efficacia del vaccino.
- Fornire un protocollo dettagliato per i ricercatori del settore.
Metodi Utilizzati
- Immunoprecipitazione di VLP derivati da HIV mediante bNAB.
- Utilizzo di microsfera magnetiche coniugate con proteina G per l'acquisizione di VLP.
- Analisi mediante SDS-PAGE e immunoblotting per rilevare le proteine del core virale.
- Mescolamento accurato di VLP con microsfere rivestite di anticorpi per un'efficace acquisizione.
Risultati principali
- I VLP che esprimono le proteine Env sono stati catturati con successo utilizzando bNAB.
- Nessuna proteina Gag è stata rilevata nei VLP negativi per Env, confermando la specificità.
- Tutti e tre i bNAB hanno dimostrato un legame efficace con i VLP sensibili alla neutralizzazione.
- Il successo del saggio dipende da condizioni adeguate di miscelazione e incubazione.
Conclusioni
- Il saggio fornisce un metodo affidabile per valutare la qualità delle VLP.
- Gli epitopi di neutralizzazione sono essenziali per indurre una risposta immunitaria.
- Questo protocollo può contribuire allo sviluppo di vaccini efficaci.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Il saggio di cattura dei VLP fornisce un metodo sensibile per valutare la qualità dei candidati vaccinali confermando la presenza di epitopi sensibili alla neutralizzazione su particelle virali simili a virus che espongono l'antigene. Ciò consente una previsione precoce del potenziale di risposta delle cellule B neutralizzanti, supportando decisioni di avanzamento o interruzione nello sviluppo dei vaccini. Il saggio riduce il rischio biologico validando l'integrità strutturale delle glicoproteine dell'involucro prima di costosi passaggi preclinici e clinici.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Valore scientifico: Conferma l'esposizione di epitopi sensibili alla neutralizzazione sulle superfici dei VLP, consentendo l'analisi di ipotesi terapeutiche relative all'immunogenicità del vaccino.
- Valore operativo: Utilizza anticorpi neutralizzanti ampiamente attivi come sonde funzionali per ridurre i rischi nella validazione dell'obiettivo, grazie a evidenze di legame specifico per l'epitopo.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Consente la preparazione di VLP esprimenti antigeni per saggi immunologici successivi, isolando particelle con integrità strutturale preservata.
- Valore operativo: Permette la rilevazione quantitativa di proteine del capside virale (ad esempio, Gag) mediante Western blot, favorendo la standardizzazione e la riproducibilità del saggio.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Dimostra la continuità dalla produzione di VLP alla rilevanza immunologica collegando l'esposizione dell'epitopo alle risposte predette di anticorpi neutralizzanti nell'uomo.
- Valore operativo: Supporta decisioni di avanzamento basate sul rischio identificando VLP in grado di indurre immunità protettiva prima degli studi di sfida animale.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il saggio si inserisce nel continuum dalla scoperta alla fase preclinica, posizionando la caratterizzazione dei VLP post-produzione prima dei test di immunogenicità, al fine di guidare la selezione del candidato principale.
- Biologia della scoperta: Conferma che le VLP esprimono gli antigeni corrispondenti in conformazione nativa, contribuendo alla riduzione del rischio biologico delle costruzioni vaccinali.
- Screening: Verifica la prontezza del saggio attraverso l'efficace cattura delle VLP positive per Env e l'assenza di segnale nei controlli negativi per Env.
- Analisi: Produce risultati di Western blot delle proteine Gag come indicatore quantitativo del rendimento e dell'integrità delle VLP catturate.
- Ricerca traslazionale: Collega la qualità biofisica delle VLP al valore predittivo immunologico confermando l'esposizione di epitopi sensibili alla neutralizzazione.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma di controllo qualità riutilizzabile per candidati vaccinali basati su VLP, applicabile a diversi antigeni e sierotipi.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Previsione affidabile dell'efficacia del vaccino mediante valutazione diretta dell'esposizione degli epitopi neutralizzanti.
- Valore operativo: Fasi standardizzate di cattura e lavaggio mediante microsferette magnetiche garantiscono riproducibilità tra laboratori e tra diverse produzioni.
- Valore strategico: Consente decisioni più accurate su prosegui/non prosegui filtrando le VLP prive di epitopi funzionali, riducendo il rischio di fallimento biologico in fasi avanzate.
- Impatto sul portafoglio: Favorisce la priorizzazione dei candidati VLP in base a metriche di qualità strutturale e funzionale, adeguata al livello di rischio.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nell'immunoprecipitazione, nella manipolazione degli anticorpi e nelle tecniche di separazione basate su microsferette magnetiche.
- Presuppone l'accesso a microsferette magnetiche coniugate con proteina A/G, anticorpi neutralizzanti ampiamente efficaci e strumentazione per il Western blot.
- Necessita della standardizzazione dei volumi di miscelazione tra microsferette e VLP (>500 µL) e delle condizioni di rotazione per garantire un efficiente catturamento.
- Comprende aspetti di adattamento per VLP non derivati da HIV, inclusa la selezione degli anticorpi e l'ottimizzazione del buffer per diversi antigeni target.
- Presenta limitazioni pratiche, come la necessità di bNAbs ad alto titolo e il potenziale ingombro sterico in array di VLP particolarmente densi.
