Rilevamento di epitopi sensibili alla neutralizzazione in antigeni visualizzati su vaccini basati su particelle simili a virus (VLP) utilizzando un test di cattura
February 10th, 2022
Qui, presentiamo un protocollo per rilevare epitopi di neutralizzazione su particelle simili a virus che visualizzano l'antigene (VLP). L'immunoprecipitazione dei VLP derivati dal virus dell'immunodeficienza umana (HIV) viene eseguita utilizzando anticorpi monoclonali specifici della glicoproteina dell'involucro accoppiati a perle magnetiche coniugate con proteina G. I VLP catturati vengono successivamente sottoposti all'analisi SDS-PAGE e Western blot utilizzando anticorpi specifici della proteina virale Gag.
Nel mio laboratorio, sviluppiamo sistemi di produzione per vettori virali e particelle simili a virus, o vaccini basati su VLP. Il test di cattura VLP consente il rilevamento molto sensibile degli antigeni bersaglio visualizzati sui VLP. In questo test, utilizziamo anticorpi ampiamente neutralizzanti diretti contro gli epitopi di neutralizzazione per dimostrare l'esposizione di questi epitopi sulla superficie VLP.
Questa è un'importante valutazione della qualità per i candidati vaccini, poiché solo i VLP che mostrano epitopi sensibili alla neutralizzazione saranno in grado di suscitare una risposta anticorpale neutralizzante nei vaccinati. Inizia sospendendo le perline magnetiche tubando su e giù o mescolando su un rotatore a 50 RPM per almeno cinque minuti. Nel frattempo, preparare la soluzione anticorpale contenente i bNAB.
Utilizzare 10 microgrammi di ogni bNAB in 200 microlitri di legame anticorpale e tampone di lavaggio per reazione. Per ogni reazione, trasferire 50 microlitri della soluzione di perline magnetiche in un tubo di reazione da 1,5 millilitri, quindi posizionare i tubi sul rack di separazione magnetica. Attendere che le perline si raccolgano sulla palla del tubo per assicurarsi che tutte le perline siano raccolte, quindi rimuovere il surnatante.
Rimuovere il magnete e sospendere le perline in 200 microlitri della soluzione bNAB precedentemente preparata. Incubare per 30 minuti a tre ore mentre si mescola su un rotatore a 50 RPM a temperatura ambiente. Dopo l'incubazione, posizionare i tubi di reazione nel rack di separazione magnetica, attendere e rimuovere il surnatante.
Rimuovere i tubi dal magnete e lavare le perline sospendendo nuovamente in 200 microlitri di legame anticorpale e tampone di lavaggio. Ripetere il lavaggio con legante anticorpale e tampone di lavaggio, rimuovendo il più possibile il tampone di lavaggio al termine. Aggiungere i campioni ai bNAB con perline.
Se il volume del campione aggiunto è inferiore a un millilitro, aggiungere PBS per regolare il volume del campione a un millilitro, quindi sospendere nuovamente le perline mediante pipettaggio delicato. Incubare i campioni e le perline per 2,5 ore su un rotatore a temperatura ambiente, assicurandosi che le perline rimangano in sospensione e che la soluzione venga accuratamente miscelata durante l'incubazione. Posizionare i tubi sul magnete e rimuovere il surnatante, quindi lavare le perle magnetiche sospendendole in 200 microlitri di tampone di lavaggio.
Sospendere le perline in 100 microlitri di tampone di lavaggio e trasferire la sospensione in un tubo di reazione pulito e resistente al calore. Posizionare il tubo sul rack di separazione magnetica e rimuovere completamente il surnatante. Per preparare campioni STS-PAGE denaturati, sospendere le perline in 20-80 microlitri del tampone Laemmli e incubare a 95 gradi Celsius per cinque minuti.
Procedere direttamente con SDS-PAGE, posizionando i tubi su un rack magnetico per separare le perline dalla soluzione. In alternativa, conservare i campioni a meno 20 gradi Celsius. Un risultato rappresentativo dei VLP catturati per la prima volta da surnatante di coltura cellulare senza cellule e pellet VLP utilizzando bNAB, e successivamente sottoposti ad analisi Western blot per rilevare proteine core virali, è mostrato qui.
Le perle utilizzate per il test di cattura sono state rivestite con tre diversi bNAB diretti contro gli epitopi di neutralizzazione delle glicoproteine dell'involucro e anticorpi isotipici che fungono da controlli negativi. Utilizzando perline rivestite con anticorpi isotopici, nessuna proteina Gag è stata rilevabile in campioni VLP contenenti VLP calvi, cioè VLP Env-negativi o VLP che mostrano Env, dimostrando che il legame aspecifico dei VLP alle perline rivestite con anticorpi umani non ha mediato la cattura VLP. Anche i VLP calvi non erano legati da perline rivestite di bNAB e, di conseguenza, nessuna proteina Gag era rilevabile nell'analisi Western blot.
Al contrario, tutti e tre i bNAB hanno catturato VLP che mostravano proteine Env, pertanto, le proteine Gag sono state prontamente rilevate, dimostrando la presenza di epitopi di neutralizzazione nelle Env-glicoproteine visualizzate sui VLP. Cruciale per il successo del test: una miscelazione accurata di VLP con perline rivestite di anticorpi. Ciò si ottiene al meglio utilizzando volumi superiori a 500 microlitri in rotazione.
In alternativa, i VLP catturati possono essere eluiti in condizioni non riducenti. Ciò consente l'analisi di VLP utilizzando la microscopia immunoelettronica o lo studio degli antigeni visualizzati utilizzando PAGE nativo.
Panoramica
Questo articolo presenta un protocollo per rilevare gli epitopi di neutralizzazione su particelle simili a virus (VLP) utilizzando un saggio di cattura. Il metodo impiega anticorpi ampiamente neutralizzanti (bNAB) per valutare l'esposizione di questi epitopi, cruciale per la valutazione dei candidati vaccini.
Componenti chiave dello studio
Area di scienza
- Immunologia
- Sviluppo di vaccini
- Virologia
Conoscenze di base
- Le particelle simili a virus (VLP) sono importanti per lo sviluppo di vaccini.
- Gli epitopi di neutralizzazione sono fondamentali per suscitare una risposta immunitaria.
- Gli anticorpi ampiamente neutralizzanti possono essere utilizzati per rilevare questi epitopi.
- La valutazione della qualità dei VLP è essenziale per i candidati vaccini efficaci.
Obiettivo dello studio
- Sviluppare un saggio sensibile per rilevare gli epitopi di neutralizzazione sui VLP.
- Dimostrare l'importanza di questi epitopi nell'efficacia del vaccino.
- Fornire un protocollo dettagliato per i ricercatori nel campo.
Metodi utilizzati
- Immunoprecipitazione di VLP derivati dall'HIV utilizzando bNAB.
- Utilizzo di perline magnetiche coniugate con proteina G per la cattura dei VLP.
- SDS-PAGE e analisi Western blot per rilevare le proteine del core virale.
- Miscuglio accurato di VLP con perline rivestite di anticorpi per una cattura efficace.
Risultati principali
- I VLP che presentano proteine Env sono stati catturati con successo utilizzando bNAB.
- Nessuna proteina Gag è stata rilevata nei VLP negativi per Env, confermando la specificità.
- Tutti e tre i bNAB hanno dimostrato un efficace legame con VLP sensibili alla neutralizzazione.
- Il successo del saggio dipende da condizioni di miscelazione e incubazione adeguate.
Conclusioni
- Il saggio fornisce un metodo affidabile per valutare la qualità dei VLP.
- Gli epitopi di neutralizzazione sono essenziali per indurre una risposta immunitaria.
- Questo protocollo può aiutare nello sviluppo di vaccini efficaci.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
The VLP capture assay provides a sensitive method to evaluate vaccine candidate quality by confirming the presence of neutralization-sensitive epitopes on antigen-displaying virus-like particles. This enables early prediction of neutralizing B-cell response potential, supporting go/no-go decisions in vaccine development pipelines. The assay reduces biological risk by validating structural integrity of envelope glycoproteins prior to costly preclinical and clinical advancement.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Confirms exposure of neutralization-sensitive epitopes on VLP surfaces, enabling therapeutic hypothesis interrogation of vaccine immunogenicity.
- Operational Value: Uses broadly neutralizing antibodies as functional probes to de-risk target validation through epitope-specific binding evidence.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Enables preparation of antigen-displaying VLPs for downstream immunoassays by isolating particles with preserved structural integrity.
- Operational Value: Delivers quantitative detection of viral core proteins (e.g., Gag) via Western blot, supporting assay standardization and reproducibility.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Demonstrates continuity from VLP production to immune relevance by linking epitope exposure to predicted neutralizing antibody responses in humans.
- Operational Value: Supports risk-adjusted advancement decisions by identifying VLPs capable of eliciting protective immunity before animal challenge studies.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits within the discovery-to-preclinical continuum, positioning post-production VLP characterization before immunogenicity testing to inform lead candidate selection.
- Discovery Biology: Validates that VLPs display cognate antigens in native conformation, supporting biological de-risking of vaccine constructs.
- Screening: Confirms assay readiness through specific capture of Env-positive VLPs and absence of signal in Env-negative controls.
- Analytics: Generates Western blot readouts of Gag proteins as a quantitative proxy for captured VLP yield and integrity.
- Translational Research: Connects biophysical VLP quality to immunological predictive value by confirming exposure of neutralization-sensitive epitopes.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable QC platform for VLP-based vaccine candidates across multiple antigen targets and serotypes.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in vaccine efficacy through direct assessment of neutralizing epitope exposure.
- Operational Value: Standardized capture and wash steps using magnetic beads ensure reproducibility across laboratories and production batches.
- Strategic Value: Enables better go/no-go decisions by filtering VLPs lacking functional epitopes, reducing late-stage biological failure risk.
- Portfolio Impact: Facilitates risk-adjusted prioritization of VLP candidates based on structural and functional quality metrics.
Implementation Considerations
- Requires expertise in immunoprecipitation, antibody handling, and magnetic bead-based separation techniques.
- Depends on access to protein A/G-conjugated magnetic beads, broadly neutralizing antibodies, and Western blot instrumentation.
- Necessitates standardization of bead-VLP mixing volumes (>500 µL) and rotation conditions to ensure efficient capture.
- Involves adaptation considerations for non-HIV VLPs, including antibody selection and buffer optimization for different antigen targets.
- Includes practical limitations such as the need for high-titer bNAbs and potential steric hindrance in densely packed VLP arrays.
