Name: DetectSyn: un metodo fluorescente rapido e imparziale per rilevare i cambiamenti nella densità delle sinapsi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-22T12:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 10 s
Description: Scopri il metodo DetectSyn per analizzare rapidamente le modifiche sinaptiche nei tessuti fissati e nei neuroni coltivati. Questa tecnica di ligazione di prossimità offre risultati imparziali per la ricerca neuroscientifica.

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Gli autori non segnalano alcun conflitto di interessi.

DetectSyn è un test rapido che utilizza un test di legatura di prossimità per rilevare proteine entro 40 nm l'una dall'altra, che consente il rilevamento della formazione di sinapsi. Questa tecnica migliora gli attuali saggi fluorescenti, che servono solo come misure proxy per la formazione delle sinapsi. DetectSyn rileva cambiamenti quantificabili nelle proteine sinaptiche localizzate entro 40 nm, cioè all'interno della fessura sinaptica, l'una dell'altra. Inoltre, DetectSyn è più conveniente e richiede meno tempo rispe...

Le sinapsi sono l'unità fondamentale della comunicazione tra i neuroni1. Molte sinapsi tra neuroni all'interno delle stesse regioni danno origine a circuiti che mediano il comportamento2. Le sinapsi sono costituite da un terminale presinaptico di un neurone che rilascia neurotrasmettitori o neuropeptidi che trasmettono informazioni ai recettori postsinaptici di un altro neurone. La somma dei segnali presinaptici determina se il neurone postsinaptico attiverà un potenziale d'azione e propagherà il messaggio ad altri neuroni.
La sinaptopatologia, la rottura delle sinapsi, si manifesta in malattie e disturbi caratterizzati da diminuzione del volume neurale, come il morbo di Alzheimer e il disturbo depressivo maggiore, con conseguente circuiti che non funzionano più in modo ottimale 3,4,5. Il ripristino della densità delle sinapsi probabilmente è alla base dell'efficacia dei potenziali trattamenti per questi disturbi. Ad esempio, è stato recentemente dimostrato che l'aumento delle sinapsi è alla base dell'efficacia comportamentale degli antidepressivi rapidi6. Per esaminare rapidamente possibili trattamenti sinaptopatologici, i ricercatori richiedono tecniche che identifichino rapidamente i cambiamenti nei numeri delle sinapsi.
Le metodologie attuali sono lunghe e costose (microscopia elettronica, tomografia ad array), oppure esaminano solo i cambiamenti postsinaptici senza incorporare l'impegno presinaptico (analisi della colonna vertebrale, immunofluorescenza / colocalizzazione). Coloranti come DiI o proteine fluorescenti come GFP aiutano a visualizzare i neuroni e caratterizzano le spine postsinaptiche. Tuttavia, l'analisi della colonna vertebrale utilizza rapporti definiti dal ricercatore per determinare la morfologia, che può ridurre la riproducibilità7. Inoltre, il modo in cui le diverse classi della colonna vertebrale si riferiscono alle sinapsi funzionali è ancora in fase di scoperta8. La formazione della colonna vertebrale può essere transitoria e può riflettere la plasticità postsinaptica, ma queste spine potrebbero essere eliminate prima di stabilizzarsi in una sinapsi con un neurone presinaptico9.
La colocalizzazione fornisce un proxy migliore per le sinapsi rispetto all'analisi della colonna vertebrale perché si può immunostain per le proteine presinaptiche e postsinaptiche. Tuttavia, le proteine sinaptiche possono produrre bassi valori di colocalizzazione perché le proteine sono giustapposte e potrebbero non sovrapporsi in modo coerente. Pertanto, poiché le proteine non sono completamente sovrapposte, le tecniche di colocalizzazione potrebbero non misurare con precisione i cambiamenti nella formazione delle sinapsi a causa di queste informazioni mancanti. Infine, sebbene sia la microscopia elettronica (EM) che la tomografia array forniscano immagini ad alta risoluzione delle sinapsi, richiedono molto tempo. EM richiede inoltre attrezzature specializzate e i ricercatori sono limitati a piccoli volumi di tessuto per ogni dato esperimento. Mentre la tomografia ad array fornisce elegantemente la possibilità di selezionare molte proteine su sezioni ultrasottili e può essere combinata con EM10, questa tecnica può essere troppo laboriosa e al di là dello scopo degli esperimenti che devono eseguire rapidamente la scansione per i cambiamenti nella formazione delle sinapsi.
DetectSyn è un'applicazione specifica del Duolink Proximity Ligation Assay. Il test PLA consente la rilevazione generale delle interazioni proteina-proteina. DetectSyn collega le misure postsinaptiche proxy amplificando un segnale fluorescente emesso da proteine pre- e postsinaptiche taggate entro 40 nm l'una dall'altra. Se le proteine sinaptiche sono entro 40 nm, come all'interno di una fessura sinaptica, allora gli anticorpi secondari, che contengono sonde di DNA, si ibridano in DNA circolare. Questo DNA circolare ibridato esprime una sonda fluorescente, che viene poi amplificata e rilevata con tecniche standard di microscopia fluorescente (vedi Figura 1). Fondamentalmente, a differenza della tomografia EM e array, questa tecnica non richiede attrezzature specializzate e richiede circa la stessa quantità di tempo dell'immunoistochimica standard. L'accessibilità di questa tecnica, quindi, consente ai ricercatori al di fuori delle istituzioni ad alta intensità di ricerca di partecipare alla ricerca sinaptopatologica. Inoltre, questa tecnica può esaminare i cambiamenti della densità sinaptica in più regioni del cervello all'interno di un singolo esperimento, offrendo una rappresentazione più olistica dei cambiamenti sinaptici dovuti a malattie o trattamenti.

<table><tbody><tr><td>10x PBS</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP39920</td><td>PBS made in house funziona, pure.</td></tr><tr><td>Piastre a 24 pozzetti</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB012929</td><td>Per le fette di tessuto, le piastre pre-sterilizzate potrebbero non essere necessarie.</td></tr><tr><td>Provette coniche da 50 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>Foglio di alluminio</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-078-290</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-MAP2 del pollo</td><td>Abcam</td><td>ab5392</td><td></td></tr><tr><td>Smalto trasparente</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC1849418</td><td>Anche altri smalti trasparenti funzionano.</td></tr><tr><td>Blocco freddo</td><td>Fisher Scientific</td><td>13131012</td><td></td></tr><tr><td>Postazione di lavoro Computer</td><td>HP</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio confocale o fluorescente</td><td>Nikon</td><td>A1R HD25</td><td></td></tr><tr><td>Asino anti-pollo FITC</td><td>Fisher Scientific</td><td>SA1-72000</td><td></td></tr><tr><td>Duolink asino anti-Topo PLUS</td><td>Sigma</td><td>DUO92001</td><td></td></tr><tr><td>Duolink asino anti-Coniglio MINUS</td><td>Reagenti per</td> il rilevamento in situ Sigma <td>DUO92005</td><td></td></tr><tr><td>Duolink Far Red</td><td>Sigma</td><td>DUO92013</td><td>Contiene materiale di legatura, materiale di amplificazione, ligasi e polimerasi.</td></tr><tr><td>Mezzo di montaggio in situ Duolink con DAPI</td><td>Sigma</td><td>DUO82040</td><td></td></tr><tr><td>Tampone di lavaggio in situ Duolink, DUO82049 a fluorescenza</td><td>Sigma</td><td></td> contiene <td>il tampone di lavaggio A e il tampone di lavaggio B; diluire il tampone di lavaggio B all'1% in diH20 per l'1% di tampone di lavaggio B.</td></tr><tr><td>Pennello a punta fine</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9691026</td><td>Capelli di zibellino, misura 00 o 000, si possono trovare anche nei negozi di artigianato</td></tr><tr><td>Fisherbrand Occhiali di copertura: Rettangoli</td><td>Fisher Scientific</td><td>12545MP</td><td>Il vetro di copertura non è necessario per i neuroni coltivati già sui vetrini di vetro.</td></tr><tr><td>Fisherbrand Vetrini per microscopio Superfrost Plus Fisher</td><td>Scientific</td><td>1255015</td><td>Per i neuroni in coltura già presenti sui vetrini coprioggetti, i vetrini Superfrost potrebbero non essere necessari.</td></tr><tr><td>Congelatore, -20 gradi C</td><td>VWR</td><td>76449-108</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini coprioggetti</td><td>Fisher Scientific</td><td>125480</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP381-1</td><td></td></tr><tr><td>Software di elaborazione delle immagini</td><td>, ad es. NIS Elements, ImageJ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-015-2633</td><td></td></tr><tr><td>Capsula di Petri grande, 100 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875712</td><td></td></tr><tr><td>Acqua di grado molecolare</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP24701</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-sinapsina 1 del topo</td><td>Sistemi sinaptici</td><td>106-011</td><td></td></tr><tr><td>Siero d'asino normale</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td>Agitatore orbitale</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-106-1013</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-374-10</td><td></td></tr><tr><td>Puntali per pipette</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-707-025</td><td></td></tr><tr><td>Pipette</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-388-100</td> I <td>volumi di lavoro vanno da 3 & micro; L fino a 500 &micro; L</td></tr><tr><td>Pipetta pasteur in plastica</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-708-006</td><td></td></tr><tr><td>Pinzette/precepi di precisione</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-000-122</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-PSD95 di coniglio</td><td>Abcam</td><td>ab18258</td><td>Anche altre coppie di anticorpi possono funzionare con l'ottimizzazione.</td></tr><tr><td>Frigorifero</td><td>VWR</td><td>76470-402</td><td></td></tr><tr><td>Capsula di Petri piccola, 60 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875713A</td><td></td></tr><tr><td>Timer</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-649-17</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337-100</td><td></td></tr></tbody></table>

detectsyn: un metodo fluorescente rapido e imparziale per rilevare i cambiamenti nella densità delle sinapsi

DetectSyn: A Rapid, Unbiased Fluorescent Method to Detect Changes in Synapse Density

Le sinapsi sono il sito di comunicazione tra i neuroni. La forza del circuito neuronale è correlata alla densità sinaptica e la rottura delle sinapsi è caratteristica di stati patologici come il disturbo depressivo maggiore (MDD) e il morbo di Alzheimer. Le tecniche tradizionali per studiare il numero di sinapsi includono l'espressione genetica di marcatori fluorescenti (ad esempio, proteina fluorescente verde (GFP)), coloranti che riempiono un neurone (ad esempio, colorante carbocianine, DiI) e rilevamento immunofluorescente di marcatori spinali (ad esempio, densità postsinaptica 95 (PSD95)). Un avvertimento importante a queste tecniche proxy è che identificano solo i cambiamenti postsinaptici. Tuttavia, una sinapsi è una connessione tra un terminale presinaptico e una colonna vertebrale postsinaptica. Il gold standard per misurare la formazione / eliminazione delle sinapsi richiede tecniche di microscopia elettronica o tomografia array che richiedono tempo. Queste tecniche richiedono una formazione specializzata e attrezzature costose. Inoltre, solo un numero limitato di neuroni può essere valutato e viene utilizzato per rappresentare i cambiamenti in un'intera regione del cervello. DetectSyn è una tecnica fluorescente rapida che identifica i cambiamenti nella formazione o nell'eliminazione delle sinapsi a causa di uno stato di malattia o di un'attività farmacologica. DetectSyn utilizza un test di legatura di prossimità rapida per rilevare proteine pre e postsinaptiche giustapposte e microscopia fluorescente standard, una tecnica prontamente disponibile per la maggior parte dei laboratori. Il rilevamento fluorescente del puncta risultante consente un'analisi rapida e imparziale degli esperimenti. DetectSyn fornisce risultati più rappresentativi rispetto alla microscopia elettronica perché è possibile analizzare aree più grandi rispetto a un numero limitato di neuroni fluorescenti. Inoltre, DetectSyn funziona per neuroni in coltura in vitro e fette di tessuto fisse. Infine, viene fornito un metodo per analizzare i dati raccolti da questa tecnica. Nel complesso, DetectSyn offre una procedura per rilevare i cambiamenti relativi nella densità delle sinapsi tra trattamenti o stati patologici ed è più accessibile rispetto alle tecniche tradizionali.

I dati modificati da Heaney et al.6 sono presentati per dimostrare un esperimento in cui è previsto un aumento della formazione di sinapsi (vedere6 per ulteriori informazioni e una discussione più approfondita del meccanismo). In precedenza, è stato dimostrato che gli antidepressivi rapidi richiedono l'attivazione del recettore metabotropico inibitorio, GABAB (sottotipo di acido gamma-aminobutirrico B), per essere efficace13. Inoltre, i dati preceden...

DetectSyn è un saggio fluorescente rapido e imparziale che misura i cambiamenti nel numero relativo di sinapsi (impegno pre e postsinaptico) tra trattamenti o stati patologici. Questa tecnica utilizza una tecnica di legatura di prossimità che può essere utilizzata sia nei neuroni in coltura che nei tessuti fissi.

DetectSyn: un metodo fluorescente rapido e imparziale per rilevare i cambiamenti nella densità delle sinapsi

Synapses are the site of communication between neurons. Neuronal circuit strength is related to synaptic density, and the breakdown of synapses is ...

DetectSyn sfrutta la tecnologia di analisi della legatura di prossimità per identificare rapidamente le modifiche alle sinapsi. Forniamo anche un protocollo per analizzare i risultati. Il vantaggio principale di DetectSyn è la rapidità con cui i risultati possono essere ottenuti nelle grandi regioni di tessuto che possono essere analizzate.Per iniziare, rimuovere con attenzione la soluzione bloccante con una pipetta Pasteur di plastica senza disturbare le cellule. Quindi foderare una grande capsula di Petri di plastica con Parafilm. E usando la pinza, trasferire con cura le scivolate di copertura sul Parafilm.Aggiungere 60 microlitri della soluzione anticorpale primaria nella parte superiore dello slip di copertura, assicurandosi che la soluzione anticorpale non si rovesci sui lati dello slip di copertura. Per fornire umidità ed evitare che i campioni si secchino durante l'incubazione, aggiungere acqua ultrapura a una capsula di Petri più piccola e posizionare con cura il piatto attorno agli scivoli di copertura. Quindi coprire la capsula di Petri più grande e incubare le cellule coltivate per un'ora a temperatura ambiente.Dopo l'incubazione con l'anticorpo primario, utilizzare una pinza per estrarre con cura la soluzione anticorpale primaria dal coperchio scivola su un tovagliolo di carta e trasferire i foglietti di copertura sulla loro piastra originale a 24 pozzetti riempita con 500 microlitri di PBS. Quindi lavare i campioni con PBS tre volte per 10 minuti ciascuno con una leggera agitazione su uno shaker orbitale. Dopo l'ultimo lavaggio, trasferire il coperchio scivola di nuovo nella grande capsula di Petri e aggiungere 40 microlitri della soluzione anticorpale secondaria nella parte superiore dello slip di copertura.Coprire la capsula di Petri e incubare i campioni a 37 gradi Celsius per un'ora. Per la legatura, mantenendo la ligasi su un blocco freddo, diluire la ligasi da 1 a 40 usando il calcio di legatura e aggiungere immediatamente 40 microlitri del mix di ligasi alle scivolate di copertura. Coprire la capsula di Petri e incubare i campioni a 37 gradi Celsius per 30 minuti.Per l'amplificazione, diluire la polimerasi 1280 su un blocco freddo utilizzando il materiale di amplificazione. Quindi aggiungere 40 microlitri della miscela di amplificazione agli scivoli di copertura e incubare i campioni per 100 minuti a 37 gradi Celsius. Successivamente, per il montaggio, rilasciare tre microlitri di supporto di montaggio su una diapositiva.Togliere il tampone di lavaggio in eccesso dallo slip del coperchio e posizionare lo slip del coperchio con le celle rivolte verso il basso nel supporto di montaggio. Sigillare i lati con una piccola quantità di smalto trasparente per mantenere il coperchio in posizione. Per il montaggio di tessuto affettato, trasferire con cura una fetta di tessuto sul vetrino preparato e appoggiarla in piano.Quindi far cadere da 5 a 10 microlitri di supporto di montaggio sulla fetta di tessuto. Posizionare un coperchio di vetro scivolare sopra la fetta di tessuto e sigillare il coperchio con smalto trasparente, come dimostrato in precedenza. Per l'imaging digitale con un microscopio confocale, regolare il guadagno, l'offset e la potenza laser per ciascun canale fluorescente per ridurre il rumore di fondo e migliorare il segnale fluorescente.Assicurarsi che il segnale fluorescente non sia troppo saturo. Per i neuroni di coltura, nella scheda Acquisizione ND, fare clic su Salva su file. Quindi, in Sfoglia, scegli un file per salvare l'immagine e inserisci il nome del file.Quindi, nella scheda Z, selezionare l'opzione Modalità simmetrica definita dall'intervallo. Impostare la messa a fuoco sulla migliore mappa a due piani e fare clic sul pulsante Relativo per impostare questo piano focale come centro dello z-stack. Quindi, impostare l'intervallo su cinque micrometri con passi di un micrometro e selezionare Chiudi otturatore attivo durante il movimento Z.Nella scheda Lunghezza d'onda, selezionare il nome del pulsante ottico con le impostazioni di acquisizione configurate in precedenza in Configurazione ottica e fare clic su Esegui ora. Per il tessuto affettato, dal menu acquisizione scegliere Scansione immagine di grandi dimensioni, quindi sotto il pannello di acquisizione, selezionare il pulsante ottico con le impostazioni di acquisizione configurate in precedenza. Inoltre, selezionate l'obiettivo corretto in questo pannello.Successivamente, sotto il pannello dell'area e l'oculare, utilizzare i tasti freccia per impostare i confini della regione di interesse o del ROI. Quindi fare clic su Salva immagine di grandi dimensioni su file e creare un nome di file di percorso di salvataggio per l'immagine. Infine, sotto il pannello di configurazione, assicurarsi che l'acquisizione multicanale sia selezionata.Quindi scegliere il nome del pulsante ottico con le impostazioni di acquisizione precedentemente configurate in configurazione ottica. In ImageJ, apri l'opzione di soglia andando al menu immagine, facendo clic su Regola, quindi su Soglia. Scegli l'opzione Sfondo scuro se l'immagine ha uno sfondo scuro.Quindi, regolare i limiti superiore e inferiore della soglia per le impostazioni di soglia ottimizzate precedentemente determinate e fare clic su Applica. Per le cellule coltivate, utilizzare il canale MAP2 e uno strumento ROI a mano libera per disegnare un ROI per ciascun neurone, inclusi dendriti e soma. Per il tessuto affettato, disegna un ROI a mano libera all'interno dell'immagine della sezione che incapsula l'area di interesse.Quindi ottenere l'area del ROI aprendo il menu Analizza e facendo clic su Misura. Per rilevare il numero di punti all'interno di ciascun ROI, utilizzare uno strumento di rilevamento automatico come l'analisi delle particelle. Dal menu Analizzato ,Analyzed), selezionate Particelle analizzate (Analyzed Particles) e definite il diametro della dimensione del punto.Successivamente, dal menu a discesa Mostra, scegli l'opzione Maschere sovrapposte, quindi seleziona l'opzione Visualizza risultati e fai clic su OK. Per dividere il numero di punta per l'area del singolo ROI, copia e incolla i risultati per ogni immagine dai risultati pop-up in un foglio di calcolo. Identifica da quale file e campionare i dati da cui siamo ottenuti e dividi l'area del ROI per il numero di punta.Infine, per normalizzare i risultati ai campioni di controllo, calcolare la media dei risultati per i campioni di controllo e dividere i risultati ottenuti di tutti i campioni per la media del controllo. L'agonista GABAB, baclofen, è necessario per l'efficacia in vitro dell'antidepressivo rapido Ro-256981. Un aumento della formazione di sinapsi è dimostrato da un aumento della punta bianca.Senza baclofene, non si osserva alcun aumento della formazione di sinapsi. In vivo, l'iniezione intraperitoneale dell'antidepressivo rapido provoca un aumento della formazione di sinapsi rispetto al controllo salino. Mentre alcuni punta appaiono nelle immagini di controllo tecnico, generalmente non hanno le stesse dimensioni dimostrate dalle specifiche bianche rispetto alla grande punta negli altri pannelli.Inoltre, queste punte non si trovano nella stessa posizione, come dimostrato da qualche punta che appare all'interno del soma. DetectSyn può identificare i cambiamenti alle sinapsi dovuti a uno stato di malattia o a un trattamento farmacologico. Questo metodo può aiutare a fornire informazioni a qualsiasi area di ricerca che studia i disturbi che influenzano lo sviluppo o la rottura delle sinapsi.

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Qui, descriviamo un approccio quantitativo per determinare la distribuzione di una proteina sinaptica rispetto una proteina marker mediante immunofluorescenza, microscopia confocale e analisi computerizzata.

Quantificare la distribuzione eterogenea di una proteina sinaptica nel cervello del Mouse mediante immunofluorescenza

Presentiamo un protocollo per valutare l'equilibrio tra il rilascio del glutammato e l'autorizzazione alle singole sinapsi glutamatergiche corticosterogiche in fette acute di topi adulti. Questo protocollo utilizza il sensore fluorescente iGluu per il rilevamento del glutammato, una telecamera sCMOS per l'acquisizione del segnale e un dispositivo per l'illuminazione laser focale.

Indicatori di sinapsi singola di Soldamento Release e Uptake in Acute Brain Slices da Topi Normali e Huntington

Sono descritti due metodi correlati per visualizzare gli eventi subcellulari necessari per la trasmissione sinaptica. Questi protocolli consentono il monitoraggio in tempo reale della dinamica dell'afflusso di calcio presinaptico e della fusione della membrana delle vescicole sinaptiche utilizzando l'imaging a cellule vive di neuroni in coltura in vitro .

Misurazione fluorescente in tempo reale delle funzioni sinaptiche in modelli di sclerosi laterale amiotrofica

Scopri il metodo DetectSyn per analizzare rapidamente le modifiche sinaptiche nei tessuti fissati e nei neuroni coltivati. Questa tecnica di ligazione di prossimità offre risultati imparziali per la ricerca neuroscientifica.

DetectSyn: un metodo fluorescente rapido e imparziale per rilevare i cambiamenti nella densità delle sinapsi

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